鸡新城疫疫苗研究进展

鸡新城疫疫苗研究进展 ?中圈采禽2006年第28.~g18期ChinaPou~,ryVo1.28,No.18.2006 鸡新城疫疫苗研究进展 王贺民,秦素琴,魏涛 (1.乾元浩生物股份有限公司,北京100083;2.河南省畜牧局,河南郑州450001) 新城疫(Newcastledisease,ND)是由新城疫 病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)引起的一种 禽类急性,高度接触性传染病.新城疫常呈败血 症,主要特征是呼吸困难,下痢,神经机能紊乱, 黏膜和浆膜出血.该病发病急,致死率高,对养禽 业的发展构成严重的威胁,被国际兽医局定为A 类烈性传染病. 1ND流行历史及现状 最早有记载的新城疫1926年发生于印度尼 西亚的爪哇和英国的新城,1927年Doyle首次分 离病原,并将该病命名为新城疫.以后几年内,世 界各地陆续分离出许多新城疫病毒,其引起的症 状轻重不一,或者不发病.由于目前疫苗的广泛 使用,已经难以估计出新城疫的地理分布.历史 上记载了3次新城疫大流行,波及世界主要养禽 国家[. 1928年我国已经有本病的记载,1935年新城 疫在我国的流行造成了很大的经济损失,并由梁 英,马闻天等通过病原分离证实.目前我国尽管 普遍采用常规疫苗接种预防该病,并在很大程度 上控制了该病的大规模流行,但每年因该病造成 的损失仍极其严重. 2NDV病原特性 新城疫病毒基因组为一条负链不分节段的 RNA单个分子,由15186个核苷酸组成,包含6 个基因,由3到5的顺序依次为Np—p—M—F— HN—L,分别编码核衣壳蛋白(NP),磷酸化的核 衣壳相联蛋白(p),基质蛋白(M),血凝素神经氨酸 酶(HN),融合蛋白(F),RNA依赖的RNA聚合 酶(L)等6种病毒特异性结构蛋白[2].HN蛋白与 收稿日期:2006—09—05 F蛋白是重要的宿主保护性抗原,其中F蛋白是 决定病毒毒力的主要因素,其次是HN蛋白,HN 蛋白和F蛋白在决定病毒毒力方面关系密切.新 城疫病毒只有一个血清型,但不同亚群和毒株在 毒力,抗原性和致病性等方面存在着明显的差 异.这种差异虽然不足于造成免疫失败,但有可 能使一些致病毒株在免疫鸡群持续存在.有报道 单克隆抗体可以区分新城疫病毒不同的亚群和 毒株. 3ND防制 控制病原毒株的传人和通过免疫接种减少 易感禽的数量是防制新城疫的主要策略.世界各 国都在禽类贸易中对新城疫采取了严格的检疫 控制措施,避免疫病的传人.许多国家制定了控 制新城疫等烈性传染病暴发的法规,一旦发病, 坚决消灭,扑杀疫区禽类和执行严格消毒措施. 至于对易感禽的免疫预防,各国也分别采取了不 同的策略.在欧,美,澳等发达国家和地区,一般 不允许使用疫苗,或仅仅使用灭活疫苗和低毒活 疫苗,凡是发生ICPI大于0.7的新城疫病毒感染, 就采取相应的扑杀措施. 对存在新城疫地方流行的国家和地区,防 制新城疫的工作就要复杂得多.避免禽类接触 到新城疫高致病力毒株的生物安全措施必须严 格执行.另一方面,提高易感禽类免疫力的疫苗 接种预防必不可少.我国目前在新城疫防控工 作中采取的是强制防疫政策,所有家禽接 种疫苗. 4ND疫苗 鉴于新城疫对家禽业的严重危害和疫苗在 防制新城疫工作中的重要作用,目前新城疫疫苗 —— 48—— ?中同家禽2006年第28卷第18期 的研究是动物疫苗研究的热点之一. 4.1弱毒活疫苗 上个世纪30年代,Haddow等通过减弱新城 疫病毒毒力的研究,研制了中发型活疫苗,目前 在一些地方仍然使用,包括在我国的大部分地 区.在美国为了便于新城疫的诊断和检疫,最初 只使用灭活疫苗,但观察到慢性流行毒株仅仅只 产生较为温和的症状,也开始了中发型活疫苗的 使用.R.oakin随后开发了毒力更加温和的 HitchnerB1和LaSota毒株目前仍是使用最为普 遍的疫苗类型_1]. 1999年Bebsink等在澳大利亚选育出12株 热稳定性新城疫无毒株,免疫后可使小鸡产生很 高的抗体滴度.同年,Foster在坦桑尼亚证实,新 城疫热稳定性V4毒株通过点眼和饮水免疫,可 以保护免疫鸡抵抗强度攻击,口服免疫保护率为 70%?.2001年King等将新城疫B1和LaSota毒 株进行热稳定性选育,所获得热稳定性毒株血凝 素也得到了提高].2000年金扩世等对新城疫长春 分离株进行研究,证明该株是弱毒株,免疫试验能 够使接种鸡100%抵抗强毒攻击.2000年Blignaut 等用ELISA检测经过LaSota疫苗免疫的鸽子, 证明皮下接种能够产生良好的免疫反应,但点眼 不能够引起体液免疫.2001年郝勤宗等用新城疫 热稳定性天然弱毒株采取不同途径免疫鸡均产 生了良好的免疫反应j. 4.2灭活疫苗 用氢氧化铝作为佐剂制造的灭活疫苗在 1970年以后几年内在欧洲得到了广泛的使用,但 因为免疫保护力差,很快被弱毒活疫苗所取代. 随后发展起来的油乳剂灭活疫苗,因为性能优 越,一直到今天仍然被广泛使用. 新城疫灭活疫苗越来越广泛地和其它禽类 疫病疫苗混合制成联合疫苗,用于多种疫病的免 疫预防.这种联合疫苗常包括传染性支气管炎病 毒,传染性法氏囊病病毒,产蛋下降综合征病毒 和呼肠孤病毒等. 4.3亚单位疫苗 亚单位疫苗就是将新城疫病毒保护性抗原 基因通过载体在表达系统进行抗原表达,加以佐 剂制成的疫苗.杆状病毒载体系统是目前研究新 城疫亚单位疫苗的主要工具,它以昆虫杆状病毒 ChinaPoultryVoL2&No.18.2006 为载体,以昆虫或昆虫细胞为受体表达目标抗 原.这种表达系统与原核细胞和哺乳动物细胞相 比,具有产量高,产物和天然抗原相似,可以通过 感染昆虫或昆虫细胞大批量生产等优点. 1990年Nagy等将HN基因插入杆状病毒载 体,在昆虫细胞表达的重组HN蛋白具有HA和 NA活性,能与NDV抗血清或HN蛋白单克隆 抗体反应,昆虫细胞表面能吸附红细胞,表明重 组HN糖基化后转移到了细胞表面].Nagy等用 电镜观察负染色的重组NDVHN的杆状病毒感 染的昆虫细胞外液,发现其中含有NDV样囊膜, 这些囊膜与NDV真实的病毒囊膜形态相同.用 免疫胶体金标记的HN抗体检测发现HN抗原 位于NDV样囊膜的纤突上.用表达的HN蛋白 或重组HN杆状病毒制成油乳剂灭活疫苗免疫 鸡,重组杆状病毒活疫苗诱导的抗体水平高于灭 活疫苗,低于常规疫苗.但重组活疫苗和灭活疫 苗免疫鸡均能抵抗新城疫强毒攻击]. 1994年Kamiya等证实重组杆状病毒表达的 新城疫无毒株F蛋白,因为没有裂解,免疫保护 性差.但同年Mori等的试验结果相反,用重组杆 状病毒表达的NDVD26株F蛋白制备亚单位 疫苗,免疫鸡可以抵抗新城疫强毒攻击.说明F 蛋白表达产物的免疫原性需要进一步研究. 2002年丁壮等应用杆状病毒表达系统表达 了新城疫四平和长春两个分离株的HA,制备疫苗 免疫鸡后,应用ELISA和HI方法检测到免疫鸡 的IgG和HI抗体,用新城疫F勰E强毒株攻毒 后,分别达到65%(四平株)和100%(长春株)的保 护率. 2003年Kapczynski用处理新城疫病毒得到 的不具感染性的病毒HN和F蛋白免疫鸡,并与 LaSota活疫苗对照,检测HI抗体及攻毒保护试 验均证实这些病毒亚单位成分具有良好的免疫 保护效果_1. 2005年曾黎平等将新城疫F勰E株的NA和 F基因核心片断克隆到杆状病毒载体,也得到了 糖基化的HN和F蛋白表达产物. 亚单位疫苗安全,稳定,易于大规模生产,是 新城疫疫苗未来发展的一个重要方向.但因为存 在抗原的高效表达,抗原后加工,合适免疫佐剂 选择等问需要解决,亚单位疫苗的实际应用, —— 49—— ?中圈采禽2006年第28卷第l8期 尚有很长一段路需要走. 4.4重组活载体疫苗 利用痘病毒,火鸡疱疹病毒和某些细菌作为 载体,插入新城疫病毒HN或F基因,通过动物 接种,使接种鸡得到免疫保护已经证明是可行的 方法.载体病毒或细菌表达目标抗原可以最大限 度地不受接种动物体内新城疫抗体的干扰.某些 载体疫苗用于鸡胚免疫,同样得到较好的结果. 同样的,可以利用合适的新城疫病毒作为载体, 插入其它目标基因.如用插入人工构建标志基因 的新城疫病毒疫苗免疫鸡,可以和野毒感染区分 开来.用插入禽流感病毒HA基因的新城疫病毒 接种,可以预防这两种疫病.目前含禽流感病毒 HA基因的重组新城疫弱毒活疫苗已经被批准用 于国内的高致病性禽流感的防疫.美国农业部早 在1995年就批准了重组鸡痘病毒活载体疫苗 VectorVAXFP—N的上市使用. 1990年Edbauer等用新城疫病毒Texas株HN 基因构建了重组禽痘病毒,用免疫沉淀实验证实了 HN蛋白的表达,重组病毒经肌肉注射途径免疫一 次后,实验鸡获得了对NDV的攻毒保护.同年, Taylor等将新城疫病毒Texas株F基因插入禽痘病 毒基因组构建重组病毒,在培养细胞中表达了F蛋 白并经过糖基化修饰后被切割成F,和F:,用重组 病毒免疫鸡可诱导免疫反应,通过点眼或口服重组 病毒可获得部分攻毒保护,而通过肌肉注射或翅下 刺种则免疫一次就可获得完全攻毒保护|1. 1991年Ifitani等研究证实,鸡体内存在新城 疫病毒抗体不影响重组HN痘病毒的免疫应答, NDV的HI抗体水平很高,但存在FPV母源抗体 时,免疫鸡则不能观察到NDV抗体产生.1998年 Karaca等用新城疫病毒HN和F基因分别插入 鸡痘病毒(FPV)基因组构建重组鸡痘病毒.以此 免疫17日龄鸡胚,对孵化率没有影响,雏鸡能抵 抗NDV和FPV攻毒.2002年Sharma等分别用 构建了表达NDVHN和F蛋白的重组鸡痘病毒 进行鸡胚免疫,证实重组病毒能有效诱导实验鸡 的体液免疫和细胞免疫,对NDV攻击的保护率 达到81%,对鸡胚的孵化率亦没有明显影响. 2003年丁炜东将已构建表达新城疫病毒 F48E.株HN和F基因的重组鸡痘病毒rFPV—HN 和rFPV—F连续传20代,HN和F基因仅发生微 ChinaPoultryVo1.2&No.18.2006 小变化,通过免疫荧光检测证明,外源基因能够 得到很好的表达,免疫性能良好.说明重组鸡痘 病毒遗传稳定性较好. 在多基因共表达重组活疫苗方面,2002年夏 志平等构建了共表达新城疫病毒F基因和法氏 囊病毒VP.基因的重组鸡痘病毒,刺种免疫后, 能够引起良好免疫发应.2003年韦栋平等构建了 共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒 HA基因的重组鸡痘病毒,间接免疫荧光试验检 测,两种抗原得到表达.2004年智海东等共表达 新城疫病毒F基因和传染性喉气管炎gB基因的 重组鸡痘病毒rFPV—gB—F,在鸡胚成纤维细胞中 能够表达两种蛋白.进一步试验表明,按照500~ 5000PFU/只的剂量接种30日龄SPF鸡,传染性 喉气管炎攻毒保护率70%,新城疫攻毒保护率 80%. 在其它载体方面,1992年Morgan等首先将新 城疫病毒的HN,F基因分别克隆至火鸡疱疹病毒 (HVD的复制非必需区US2,利用Rous肉瘤病毒 LTR的强启动子构建了重组HVT.分别用表达F, HN的重组HvT质粒腹腔接种1日龄SPF自来杭 鸡,第28天以新城疫病毒TexasGB株肌肉接种攻 毒,产生了90%和47%的保护率,而经口攻毒时,均 不能抵抗NDV在气管内的复制.重组HvT和野 生型H,,T免疫鸡对马立克氏病毒强毒攻击提供同 等水平的保护.1996年Rdy用新城疫病毒B1株 的HN和F基因重组HVT疫苗进行17日龄鸡胚 免疫试验表明,试验鸡能够产生中和抗体和HI抗 体,也可以产生相同的攻毒保护效果I1. 在新城疫病毒作为重组载体方面,2000年 Krishnamurthy等将基因CAT插入新城疫病 毒BeauteteC株构建的重组NDV病毒,在重组 病毒中的CAT基因连续传8代仍保持稳定,但 重组病毒蚀斑变小,复制速度下降,病毒表现出 对鸡胚的毒力降低.其它试验同样证明,在NDV 基因组中引入外源基因可作为减毒和延迟病毒 增殖的手段.Nakaya等将流感病毒HA基因插入 新城疫病毒基因组构建的重组病毒的感染性也 显着降低,用重组病毒rNDV/B1一HA或rNDV— AIV—H7分别免疫小鼠或SPF鸡能产生高水平的 NDV抗体以及流感病毒HA抗体,对流感病毒的 攻毒保护分别达到100%和40%.2005年12月24 — 50— ?中同象禽2006年第28卷第18期 日农业部宣布,国家流感参考实验室研制成功表 达高致病性禽流感病毒抗原基因的新城疫病毒 活载体疫苗,能够同时预防禽流感和新城疫,并 开始批量生产. 4.5DNA疫苗 新城疫DNA疫苗将病毒HN或F基因通过 表达质粒DNA导入机体细胞,借助宿主细胞表 达系统表达病毒NA或F蛋白,诱发机体产生针 对这些抗原的特异性免疫发应. 1996年Sakaguchi等用表达新城疫病毒F基 因的线性化重组质粒注射鸡,有40%的免疫鸡产 生了高水平的新城疫病毒F抗体,免疫后9周用 新城疫病毒强毒株攻击能得到有效保护.1999年 陈金顶将一株鹅源APMV一1的F基因克隆到哺 乳动物细胞表达质粒,使其处于hCMV启动子控 制,用环状重组质粒进行多点肌肉注射也使实验 鸡产生了F蛋白抗体. 1999年倪振亚等构建了携带新城疫病毒 F毒株F基因的重组鼠伤寒沙门氏菌x4550. 免疫7日龄SPF鸡2周后能够测出抗体,在致死 量强毒攻击时能提供80%的免疫保护.2003年潘 志明等将新城疫病毒融合蛋白F基因克隆入真 核表达载体转化减毒鼠伤寒沙门氏菌,获得运送 DNA疫苗的重组沙门氏菌,以2x10cfu/只的剂 量两次免疫小鼠,可以检测到特异性针对F蛋白 的血清抗体,表明该运送DNA疫苗的减毒沙门 氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒并 能够刺激机体产生免疫应答. 2000年姜永厚等构建了能够共表达新城疫 病毒F和鸡IFN一2的重组质粒.为进一步提高 DNA疫苗的免疫效果提供了新的思路. DNA核酸疫苗与其它疫苗相比,具有易于 设计,稳定性好,可以诱导体液免疫和细胞免疫, 免疫效果好等优点,已是目前动物疫苗研究的重 要方向之一. 鉴于新城疫的危害性,新城疫疫苗一直是广 大禽病研究者的热点之一.随着分子生物学的不 断发展,分子水平的疫苗研究成果不断涌现,为 新城疫的防制带来了新的希望.但目前新型基因 工程疫苗基本上还停留在实验室水平,距离实际 应用尚有很长的路要走,因此仍要重视传统疫苗 的研究和进一步开发,特别是在疫苗交叉保护, ChinaPoultryVo1.28,No.18.2006 联合疫苗等方面加紧研究,同时引入分子生物学 研究的最新成果,力求尽快推出更加安全,有效, 经济和适用的新一代新城疫疫苗. 参考文献: 1卡尔尼克Bw.禽病学(第十版)[M].北京:中国农业出版 社,1999,691—712. 2AlexanderDJ,CollinnsMs.Thestructuralpolypeptidesof avianparamyxovirses[J].ArchVirol,1981,67:309—323. 3HansonRP.HeterogeneitywithinstrainsofNewcastledisease virus:KeytOsurviva1.InD.J.Alexander(ed).NewcasdeDisease. 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