高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂王浆中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留

高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂王浆中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留 高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂王浆 中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留 第23卷第5期分析科学 Vo1.23No.5JOURNALOFANAIYTICAISCIENCE 2007年10月 0ct.2007 文章编号:1006—6144(2007)05—0527—05 高效液相色谱一串联质谱法同时测定蜂王浆中 氯霉素,甲砜霉素和氟甲砜霉素残留 王鹏,胡小钟,林雁飞,罗静,高晓丹, 郭少飞,荆涛,梅素容,周宜开 (1.华中科技大学同济医学院公共卫生学院教育部环境与健康重点实验室,武汉430030; 2.湖北出入境检验检疫局,武汉430022) 摘要:采用高效液相色谱一串联质谱(HPLC—MS/MS)法同时测定了蜂王浆中氯霉素, 甲砜霉素和氟甲砜霉素残留.样品加入阴性蜂蜜和水均质后,采用乙酸乙酯提取,蒸发 浓缩,C18固相萃取净化.HPLC分离后,串联质谱法以电喷雾负离子多反应监测方 式(MRM)进行定性定量分析.通过对固相萃取条件的优化,大大减小了基质的干扰. 氯霉素,氟甲砜霉素和甲砜霉素的检出限分别为0.1ng/g,0.2ng/g和0.5ng/g,平均 回收率为89.9,98.4,相对偏差(RSD)均小于8.2. 关键词:氯霉素;蜂王浆;固相萃取;高效液相色谱一串联质谱法 中图分类号:O657.63文献标识码:A 氯霉素,甲砜霉素和氟甲砜霉素都属于氯霉素类抗生素,因对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很强 的活性,现出广谱的抗菌能力,广泛地应用于动物养殖业.氯霉素作为第一个人工合成的抗菌药物,至 今已有50多年的使用历史,由于它能导致人体产生再生障碍性贫血和溶血性贫血等毒副作用_】j,欧盟,美 国等先后将其定为禁用药物,不得用于畜牧养殖业中,且动物源性食品中残留检出限为0.1t0.3~g/kg. 甲砜霉素和氟甲砜霉素与氯霉素的结构相似,是替代氯霉素的理想药物,最高残留限量一般为50,100 txg/kg.虽然它们在动物体内残留量低,但毒副作用依然存在.在蜜蜂的养殖过程中,此类药物用于预防 或治疗各种病虫害,易在蜂王浆产品中形成残留.为保证蜂王浆的食用安全,建立准确可靠的定性定量方 法是十分必要的. 目前,对于水产品,蜂产品,动物组织等不同基质中氯霉素的检测很多,而多种氯霉素类抗 生素同时测定的报道不多,主要采用高效液相色谱(HPLC)法__2],气相色谱一质谱(GC—MS)法_3和液一质联 用(LC—MS或LC—MS/MS)法__4,其中针对蜂王浆中氯霉素,甲砜霉素和氟甲砜霉素的同时检测方法国 内外尚未有报道.本文采用LC—MS/MS法建立了蜂王浆中氯霉素,甲砜霉素和氟甲砜霉素的定性定量 检测方法.为了消除基质干扰,采用固相萃取技术净化,并对洗脱和淋洗条件进行了优化.本方法定性定 量准确,检出限低,重现性好,能满足于蜂王浆进出口检测的要求. l实验部分 1.1仪器与试剂 Agilentl100型高效液相色谱仪(美国,安捷伦公司);API3000三级四极杆质谱仪(美国,ABI公司), 配有电喷雾离子源;HARVARDPumpII针泵(美国,Varian公司);GLSONASPECXL 固相萃取仪(美 收稿Et期:2007—03—29修回日期:2007—07—06 基金项目:国家自然科学基金(No.20407009);湖北省自然科学基金(No.2003ABA060) 通讯联系人:梅素容,女,副教授,研究方向:卫生检验新技术. 527 第5期王鹏等:高效液相色谱一串联质谱法同时测定蜂王浆中氯霉素,甲砜霉素和氟甲砜霉素残留第23卷 国,吉尔森公司);HITACHICD6D离心机;YAMATO涡旋混合器;多功能微量化样品处理仪(长沙中迅 电子工程研究所);C18固相萃取小柱,3mL/500mg(美国,Supelco公司). 氯霉素标准品(Chloramphenicol,CAP)和氟甲砜霉素标准品(Florfenicol,FF)购自Sigma公司,甲砜 霉素标准品(Thiamphenicol,TAP)购自Fluka公司,纯度均?99,用甲醇溶解并配制成1.0mg/mL标 准储备液,再根据需要稀释成适当含量的混合标准工作液,4?避光保存.其它试剂均为色谱纯. 蜂蜜阴性干粉(美国,CHARM公司). 1.2样品前处理 1.2.1提取室温下,取1g蜂王浆样品于5OmL离心管内,加人1.0mI阴性蜂蜜稀释液,混匀.再加 入5mL蒸馏水,混匀.加入15mL乙酸乙酯,充分震荡提取15min.以4000r/min离心5min,转移上 层有机相至50mI梨形瓶中,再用10mL乙酸乙酯重复提取两次,合并有机相于50mL梨形瓶中.45.C 下,减压浓缩,然后加入5mL蒸馏水,超声5min使之充分溶解,待净化. 1.2.2净化用C18进行SPE净化,先后以3.0mL/min的速度用4mL甲醇,4mL蒸馏水活化.用上 述1.2.1步骤提取的水相以1.0mL/min的速度过柱,并对淋洗和洗脱条件进行优化.优化后的条件为: 4mL10的甲醇水溶液进行淋洗,然后用4mL60%的甲醇水溶液洗脱,液面全部通过C18柱后,加大负 压,使C18柱内残留液充分淋下.在40C下,洗脱液N吹干,再以流动相定容至1mL,过0.45m滤膜, 备用. 1.3液相色谱及质谱条件 1.3.1色谱条件色谱柱:PinnacleIIC18(150×2.1mm,5m)(美国,RESTEK公司);保护柱:Dis— coveryC18(20×4.0mm,5m)(美国,Supelco公司).流动相梯度洗脱见表1,其中A:0.1乙酸水溶 液;B:乙腈;柱温:室温;进样量:20L. Table1Optimalelutionconditionsforthreecomponents O 3 8 12 15 22 25O 25O 25O 25O 25O 25O 8O 8O 2O 2O 8O 8O 2O 2O 8O 8O 2O 2O 1.3.2质谱条件电喷雾离子源(ESI),负离子多反应监控(MRM)扫描模式,离子源电 压:4.5kV;离子 源温度:450?;N作为雾化气,气帘气和辅助气,其中雾化气为13psi,气帘气为10psi, 辅助气流速为7 L/min.MRM监测离子对,碰撞电压(cE)及去簇电压(DP)及驻留时间(Dwelltime)见 表2. Table2TheoptimizedMS-MSconditionsforthreecomponents CompoundPrecursorionProductionsDP(V)CE(V)Dwelltime(ms) CAP TAP FF 32O.8 355.2 356.8 152.1 194.3 257.1 185.1 29O.4 240.6 338.O 185.O 119.1 — 23 — 18 — 17 — 28 — 18 22 — 13 — 27 — 46 2结果与讨论 2.1提取条件的优化 氯霉素类药物属于弱极性物质,易溶于有机溶剂.根据文献[3--10j,本文采用乙酸乙 酯作为提取液. 528 OOOOOOOOO 第5期分析科学第23卷 由于蜂王浆组分复杂,含有大量蛋白质的均匀胶体,提取时不能用单一的溶剂全部 溶解样品,要从蜂王浆 中提取待测物质,必须破坏其胶体状态,使其形成均匀的体系,这样才能实验在第 一步提取中避免损失不 确定的有效组分.食用蜂王浆时,一般需要按比例用蜂蜜调剂饮用,所以本方法尝试性采用美国 CHARM公司生产的阴性蜂蜜干粉稀释后,作为阴性辅助提取液用于溶解王浆样品,可得均匀的体系,并 且三种化合物的提取回收率均达90以上. 2.2固相萃取条件的优化 C18固相萃取柱为非极性吸附剂,可对弱极性的氯霉素,甲 砜霉素和氟甲砜霉素进行选择吸附.因此,本文采用C18柱作 为固相萃取柱,并且通过GILSONASPECXL自动固相萃取仪 对净化条件进行了优化.C18小柱经3mL甲醇,3mL蒸馏水 活化后,取5mL加标提取液上样.分别用一系列不同比例的甲 醇一水溶液淋洗,收集淋洗液,无需进一步洗脱,收集.用以上淋 洗液直接进样分析,以甲醇的含量为横坐标,回收率为纵坐标, 洗脱分布曲线如图1所示.当甲醇浓度大于10时,柱中保留 的氟甲砜霉素开始洗脱;当甲醇浓度为60时,柱上对三种待测 物已经无保留;当甲醇比例进一步加大时,大量干扰物质洗脱下 来,基质噪音增大,灵敏度下降.进一步通过不同体积的10和 Fig.1SPEelutioncurvesofthreecompo. nents — ?一CAP;—l卜一THA;—?r—FF. 60甲醇水溶液进行淋洗和洗脱,对淋洗液和洗脱液的体积进行了优化,优化后的体积均为4mL,加大体 积对回收率无明显改变. 经进一步实验证明,用提取的阴性样品溶液作为基质空白,向其中添加水溶剂标准品,该净化步骤的 回收率均在99以上. 2.3LC-MS/MS条件优化 根据文献阳报道,本文采用ESI负离子电离模式.将1mg/L三种混标溶液利用针泵以10p~L/min 流动注射的方式在负离子模式下通过全离子扫描,找出准确的母离子峰,并且对其进行轰击,分别找出3 个信号较强的碎片离子,以母离子和子离子组成监测离子对,以多反应检测(MRM)模式对待测物进行定 性和定量分析.选择丰度最强,并且色谱峰上无干扰的碎片离子组成的监测离子对/320.8/152.1, /355.2/185.1和/356.8/338.0分别用于氯霉素,甲砜霉素和氟甲砜霉素的定量,其它离子对则分 别用于它们的辅助定性.为了获得更高的离子强度,在MRM模式下同时对质谱条件进行了优化. 虽然对样品进行了固相萃取净化,但干扰峰依然存在,以乙腈一0.1乙酸水溶液为流动相,按不同比 例进行等度洗脱时,待测物和干扰峰难以分开,不仅对待测物的离子化产生严重影响,而且给定性和定量 带来很大困难.因此本文以乙腈一0.1乙酸水溶液为流动相进行了优化,采用梯度洗脱的方式,达到了待 测物和干扰峰的分离. 从添加样品的提取离子色谱图(图2)可见,在优化的色谱条件下,甲砜霉素,氟甲砜霉素和氯霉素的 保留时间分别为4.2min,8.7min和10.5min. 2.4方法的线性范围,检出限,回收率和精密度 本研究采用外标曲线定量.利用标准储备液,以甲醇稀释,配制三种待测物的混合标准液.以目标组 分的峰面积y对相应的质量浓度x(ng/mI)做标准曲线.氯霉素,氟甲砜霉素和甲砜霉素的线性范围, 线性方程,相关系数以及方法检出限(S/N?3)列于表3.以阴性样品为测试样品进行回收实验,得到的 各种药物的回收率,相对标准偏差(RSD)(一6)如表4所示. Table3Linearity,detectionlimitsofthreecomponents 529 第5期王鹏等:高效液相色谱一串联质谱法同时测定蜂王浆中氯霉素,甲砜霉素和氟甲砜霉素残留第23卷 .J \ >, 2.0.5 1.0.5 00 e 1234567801O111213141516171810202122 12345678口1D11121314151617181口202122 2.0 0 1234567e01O111213141516171810202122 1234567801O1112131415161718伯202122 Time/mi11 Fig.2MRMchromatogramsforspikedsample (A)TatolIonsChromatogram;(B)Thiamphenicol;(C)Florfenicol;(D)Chloramphenico Table4Spikedrecoveriesandrelativestandarddeviations(RSDs)ofthreecomponents 3方法应用 采用本文方法对89个蜂王浆出口样品进行TN定,绝大部分样品中都不含有CAP,FF,TAP三种药 物,仅检出部分阳性样品.表5中列出了2006年某批样品检测结果.其中3号和9号样品中CAP为阳 性,结果为0.5ng/g和1.2ng/g,7号样品FF为阳性,结果为12.6.湖北省对CAP药物 监控已经开展多 年,而FF和TAP是目前国内销售产品中允许限量使用的药物.所以,从结果也可以看出,CAP的含量 比较低,而其它两种药物出现阳性,含量都比较高. 530 Table5Analyticalresultsforrealsamples 第5期分析科学第23卷 参考文献 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1O] TurtonJA,HavardAC,RobinsonS,HoltDE,AndrewSCM,FaggRandWillamsTC.Foodan dChemicalToxicol— ogyEJ],2000,38:925. YangFang.ChenGuonan.FujianAnalysis~Testirg[J],2005,14(1):2112. 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SimultaneousDeterminationofResiduesofChloramphenicol, ThiamphenicolandFlorfenicolinRoyalJellybyHigh PerformanceLiquidChromatography.-tandem MassSpectrometry WANGPeng,HUXiao—zhong,LINYan—fei,LUOJing, GAOXiao—dan,GUOShao—fei,JINGTao,MEISu—rong,ZHOUYi—kai (1.MOEKeyLabofEnvironmentandHealth,SchoolofPublicHealth,TongJiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030; 2.HubeiEntry—ExitInspectionandQuarantineBureauofPRC,Wuhan430022) Abstract:Amethodwaspresentedforsimultaneousdeterminationofresiduesofchloramphenicol (CAP),thiamphenicol(TAP)andflorfenicol(FF)inroyaljellybyusinghighperformanceliquid chromatographytandemmassspectrometry(LC— MS/MS).Afterapreliminaryhomogenizationwith negativehoneyandwater,sampleswereextractedwithethylacetate,andevaporatedtodryne ss;then, thecleanupwascarriedoutonaC18SPEcartridge.Inordertodecreasethematrixinterference,the conditionsofsolidphaseextractionwereoptimized.Afterreversed— phaseHPLCseparation, identificationandquantificationwereperformedusingmultiplereactionmonitoring(MRM)and electrosprayionizationinnegativemode.ThedetectionlimitsforCAP,FFandTAPwere0.1ng?g_., 0.2ng?gand0.5ng?g_.,respectivelywiththeaveragerecoveriesof89.9,98.4andtheRSD lessthan8.2. Keywords:Ch1oramphenico1;Royaljelly;HighperformanceLiquidchromatography— tandemmassspec— trometry 531