【doc】冷冻复苏后对人胚胎嗜铬细胞活性的影响

【doc】冷冻复苏后对人胚胎嗜铬细胞活性的影响 冷冻复苏后对人胚胎嗜铬细胞活性的影响 江西医学检验2006年10月第2酱第_ 冷冻复苏后对人胚胎嗜铬细胞活性的影响 胡银英袁芳戴志芳熊丽袁铿 中图分类号Q25.Q813文献标识码A文章编号1008-0023(2006)05—0415-02 . 415. ? 实验研究? 【摘要】目的探讨嗜铬细胞冷冻复苏后生长情况及其功能稳定性.方法取5—6月水囊引产人胚 胎肾上腺髓质分离嗜铬细胞进行原代培养,经组化及免疫荧光染色法,嗜铬细胞染色证实为嗜铬细胞后 冻存于液氮中两年后复苏观察细胞存活率,贴壁率及生长情况,用免疫荧光染色法进行细胞鉴定.结 果复苏后细胞生长情况良好.存活率>70%,贴壁率>50%,传代4次后仍保持其生物特征.免疫荧光染 色显示酪氨酸羟化酶达阳性颗粒.结论人胚胎嗜铬细胞经冷冻保存复苏后,活性良好,仍具有嗜铬 细胞的形态及特征,并且能够分裂增殖.为解决嗜铬细胞供体来源提供新的途径. 【关键词】嗜铬细胞;冷冻复苏;分裂增殖 生物细胞治疗近年来已逐渐应用于慢性疼痛治疗领域. 其中已用于临床的是肾上腺髓质碎片和嗜铬细胞移植术.其 方法是将上述生物材料移植入宿主蛛网膜下腔,通过移植物 持续分泌儿茶酚胺,脑啡肽等神经活性物质而达到治疗疼痛 的目的IL2]但是由于嗜铬细胞来源困难.原代细胞难以达到 较高的细胞浓度.限制了其在临床上的广泛应用.本实验旨 在将经过鉴定的嗜铬细胞经液氮冷冻保存后再复苏,观察细 胞生长情况,分裂增殖能力及其生物稳定性. 1材料与方法 1.1主要试剂RPMI一1640培养基.胰蛋白酶(美国GiBCO 公司).新生小牛血清(FCs,杭州四季青生物公司),酪氨 酸羟化酶免疫组化试剂盒(Dako公司),二甲基亚砜(DMSO, 上海试剂一厂). 1.2标本来源取自新鲜(12h内)5—6月胎龄水囊引产的 胚胎肾上腺. 1.3方法 1.3.1嗜铬细胞的制备及培养将肾上腺表面多余组织剔 除后.取髓质剪成1mm左右.用0.125%胰蛋白酶消化,过 200目不锈钢网,制成单个细胞.用RPMI1640(含IO%FCS, 1%谷氨酰胺,1%Hepes,lOOU/ml青霉素,100g/ml链霉素) 培养体系.调整细胞密度1×107ml当细胞呈对数生长期时 取出部分做细胞鉴定.剩余部分传代培养4—5次后于液氮 中冷冻保存 1.3.2嗜铬细胞的冻存嗜铬细胞(1.0×106,m1)悬于冻存 液(含10%DMSO+90%FCS)中,置保温瓶中密封后经4oC (4h)一一30~C(24h)一液氮梯度冻存. 1.3.3嗜铬细胞的复苏将冻存两年的细胞取出液氮.置于 38~C水浴中快速解冻后移置试管中.缓慢加入等体积含10% 课项目:江西省科委重点题48—26 作者单位:330006江西省医学科学研究所 作者简介:胡银英,1971年生,女,江西宜丰人,实验师,从事 细胞生物学研究.※通讯作者:袁铿,1956年出生,女,上海市 人,研究员,从事细胞生物学研究. FCS的RPMI1640培养液.边加边轻摇.1000r/min离心 5min.弃上清后于10%FCS的RPMI1640培养液中重悬置 37?5%C0:孵箱中培养.待细胞呈对数生长时用0.25%胰蛋 白酶常规消化后.调整细胞密度为1.0×104/ral接种于6孔培 养板(每孑L置1块盖玻片).置37~C5%Co2培养48—72h,爬 片95%酒精固定后待检测. 1.3.4台盼兰染色法检测活细胞百分率O.4%台盼兰染料 一 滴加复苏后的细胞悬液一滴混匀,一分钟内计数500个细 胞.未染上色的细胞为活细胞,百分率计算方法:百分率=(活 细胞数/500)x100% 1.3.5复苏后细胞贴壁率计算t31将复苏细胞离心后.用含 10%FCS的RPMI1640培养液调整细胞密度为1.0×lO'/ml, 加入24孔培养板中.1ml/孔,置37?5%C0:培养箱中培养. 每2h取3孔.轻轻吸掉培养液.然后加入胰酶消化已贴壁细 胞,计数贴壁细胞.用下面公式逐个计算每个时间组的贴壁 率.贴壁率计算方法:贴壁率%=贴壁细胞数,接种细胞数× 1oo% 1.3.6复苏后生长曲线制定嘲取对数生长期细胞.胰蛋白 酶常规消化后.用含10%FCS的RPMI1640培养液调整细胞 密度为1.0×1041m1.加入24孔培养板中.Iml/孔置37?5% CO:培养箱中培养.每天取--':/L细胞进行细胞计数,取其平均 值,连续观察7天.根据所得数据绘制生长曲线,见附图. 12X104 细8×104 胞 数4×1 O 01234567 培养天数(d) 附图复苏后嗜铬细胞的生长曲线 . 416. 1.3.7Schmorl氏嗜铬细胞染色爬片洗涤一3%重铬酸钾 溶液12-24h一蒸馏水洗涤--+Giemsa稀释液24h—O.25%醋酸 溶液急速分化一无水酒精脱水一二甲苯透明一树脂封片.光 学显微镜观察细胞的显色状况. 1_3.8免疫组化和免疫荧光法检测嗜铬细胞特异性标记物 酪氨酸羟化酶的表达参照酪氨酸羟化酶试剂盒操作方法略 加改进.其步骤为:爬片水洗一95%乙醇固定—0.15%Tritor— inx一100过氧化酶阻断剂一双蒸水冲洗一TBs浸泡一一抗孵 育一TBs浸泡一弃TBs一二抗孵育一荧光显微镜观察.计数 200个细胞.计算阳性的细胞百分率(方法同1.3.4). 1.3.9复苏的嗜铬细胞再次冻存复苏后的嗜铬细胞经培 养传代4次后.按3.2方法再次进行梯度冷冻.冻存时间为一 年.复苏方法同前. 2结果 2.1复苏后的嗜铬细胞活率>70% 2,2冻存两年复苏后的嗜铬细胞培养1d后贴壁率>50% 细胞呈多边形,有突起.体积较大.3—4d后细胞贴壁较多,成 簇生长.并开始分裂增殖.5—6d时细胞生长较快.突起增多, 增粗.胰蛋白酶消化传代后与复苏前的细胞相比.细胞形态 未见明显改变 2.3Schmorl氏嗜铬细胞染色复苏前与复苏后的嗜铬细 胞经Schmorl氏染色后.在光学显微镜下均可见到细胞浆内 棕色的嗜铬颗粒 2.4酪氨酸羟化酶表达的检测荧光显微镜下可见到细胞 浆内明显的黄绿色酪氨酸羟化酶阳性颗粒计算阳性率的结 果显示.复苏前与复苏后细胞的阳性率均>80%. 5复苏的嗜铬细胞经传代培养后再次冻存一年后复苏.细 胞贴壁很少(<10%).培养一周后细胞内颗粒明显增多.但 没有增殖能力.细胞逐渐死亡. 3讨论 蛛网膜下腔移植嗜铬细胞致中枢性镇痛作用已成为生 物性镇痛方法的一个研究热点嗜铬细胞能够分泌儿茶酚胺 和脑啡肽等多种神经活性物质.这些物质通过与中枢神经系 统中特定的受体结合而具有缓解疼痛的作用国内外均有 报道用同种或异种嗜铬细胞移植治疗癌痛的研究在临床上 有一定进展1.但要将这种技术广泛应用于临床.必需解决 为移植供体来源稀少问题.成功培养具有分泌功能的嗜铬细 胞是进行临床研究的先决条件.2000年吕捷l嘴报道了用悬 浮培养的牛嗜铬细胞在培养板中集聚成团.始终保持圆形. 并液氮冻存一个月后复苏.仍能维持存活一个月.异种移植 虽然可以克服同种移植来源不足的问题.但潜在的免疫排斥 反应限制了其应用.为防止异种移植产生的免疫排斥反应. 国内学者多采用微囊化移植的实验研究171.该方法虽然可以 JiangxiJ.MedLabSci.October2006,Vol24,No5 防止免疫排斥反应.但是实验操作较复杂.实验过程容易造 成细胞污染 WinnieII】报道了人嗜铬细胞的培养时间仅为5—7天.傅 志俭[8】等原代培养的健康成人嗜铬细胞第5天.细胞就开始 破损而本研究室采用人胚胎肾上腺髓质分离制备的原代嗜 铬细胞.经冷冻复苏后46天.细胞生长最快.可能是因为 人胚胎期细胞比成年期细胞具有更强的分裂增殖能力.且标 本比较新鲜在经过多次消化传代培养后冻存.两年后复苏 的细胞不仅仍然能够分裂增殖.而且仍具有其本身的功能特 征:Schmorl染色后的细胞内可见到明显的棕色嗜铬颗粒;酪 氨酸羟化酶阳性率>80%.表明复苏后的嗜铬细胞仍具有分 泌儿茶酚胺的功能 采用人胚胎嗜铬细胞进行同种移植治疗慢性疼痛可以 避免异种移植带来的免疫排斥反应.如果能够通过冻存嗜铬 细胞的复苏培养,解决材料的供体来源问题.将可以为嗜铬 细胞移植治疗慢性疼痛另辟新的途径.对再次冻存复苏后的 细胞进行观察及验证后.我们发现.再次复苏培养的细胞贴 壁率大大降低.细胞逐渐死亡,这可能是由于细胞在近四年 的时间内.经过数次胰蛋白酶的消化传代.逐渐失去了其增 殖能力.具体原因尚需我们下一步的研究探讨. 参考文献 【1】WinnieA,PappasGD,GuptaTK,eta1.Subarachnoidad~nM medullartr~splantsforterminalcancerpain【JJ.An~thesidogy, 1993,79:644,653. 【2】CzeceKAandSagenJ.tJpdateoncellartransplantationintotheCNS asanoveltherepyforchronicpain[J].Progress.Neurobiology,1995,46: 507,509. 【3J司徒镇强,吴军正.细胞培养【MJ.西安:兴国图出版公司,第2版, 2004,7:244,245. 【4JSagenJ,Pappa.sGD,WinnieA.Alleviationofpainincancerpatients byadrenalmedullrytransplantsinthesubarachnoidspace【JJ.Cell Transplant,1993,2:259,266. 【5】薛毅珑,何立敏,李留树,等.微囊化牛肾上腺嗜铬细胞脊髓蛛网膜 下移植治疗慢性疼痛患者的初步观察【JJ.中国器官移植杂志 2000,21(6):372,374. 【6】吕捷,张进禄,赵春礼,等.牛嗜铬细胞体外培养及其分泌多巴胺的 测定【J】.首都医科大学,2000,21(3):185—186. 【7】薛毅珑'肖秀斌,张伟京,等.海藻酸钙一聚赖氨酸一海藻酸钙微囊 化牛肾上腺嗜铬细胞植入镇痛治疗中人体的免疫反应【JJ.中国临 床康复,2004,8(11):2078—2079. 【8】傅志俭,毕好生,宋文阁,等.人体嗜铬细胞培养的实验研究【JJ.中华 麻醉学杂志,1999,19(1o】:609,611. 【9】MarkeyA,KondoH,ShenkmanL,eta1.Purificationandcharaeteriza— tionoftyrosinehydroxylasefromclonalpheochwmac~omecellline[J]. MolPharmaco1.1980.17:79,85.