干扰素α-2b缓释微球及干粉吸入剂研究

干扰素α-2b缓释微球及干粉吸入剂研究 干扰素α-2b缓释微球及干粉吸入剂研究 中国人民解放军军事医学科学院 博士学位 干扰素α-2b缓释微球及干粉吸入剂的研究 姓名:李志平 申请学位级别:博士 专业:药剂学 指导教师:梅兴国 20070518军事医学科学院博士学位论文 中文摘要 缓释微球和干粉吸入剂的研究 摘要 是一类高活性、多功能的诱生蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节 作用,在临床上具有极其广泛的应用。但多以常规注射剂的形式应用,且 体内半衰期短,用药周期较长,给患者尤其恐针症患者带来极大不便。因此, 的临床应用受到了极大限制。针对以上问题,可以从开发缓控释制剂或寻找 注射 给药的替代途径两方面进行解决。但对周围环境极其敏感,活性保持困难, 导致制剂研发难度较大。 目前,国内外针对及其制剂进行了大量研究,国外通过将聚乙 二醇化使其注射后疗效可维持一周,尚无作用于全身的非注射用制剂或疗效 持续 时间更长的制上市,因此开发作用时间更长或能够替代注射给药的制剂研究 迫 在眉睫。本研究拟进行丑附.缓释微球和干粉吸入剂的研发。 在缓释微球的研究中,建立了测定含量的酶联免疫吸附 法法及和测定效价的细胞病变抑制法法,并通过将含 的明胶溶液与金属盐溶液混合、冷冻干燥、研磨制备明胶粉末胶粉, 并将其混悬于基质材料的有机溶剂中制备微球。 对影响胶粉性质的因素进行考察,结果发现以 为溶剂、 . 葡聚糖为保护剂、明胶溶液浓度为/时,制备的胶粉平均粒径约为, 包封率可达%以上。 通过考察胶粉粒径、的存在形式液态含、固态含及液态 不含、微球的制备方法//法、/法及//法及基质材料 /及对微球性质的影响,确定了制备微球的基本处方工艺,并以 、及胶粉的加入量为考察因素,采用正交试验优化了微球处方。结 果明,制备的 /微球的平均粒径为..,包封率为 .%,突释为.%,体外可持续释放天以上,累积释放量达.%, 且微球的处方工艺重现性较好。 微球的稳定性试验结果表明,高温、光照及印照射可导致 失活变性,在加速及长期试验条件下放置个月微球性质无明显变化。 通过对 /微球的体外释放进行模型拟合,并考察体中文摘要 军事医学科学院博士学位论文 外释放试验中/微球、微球及/微球的外观形态、 / 失重及粒径变化,探讨了微球的释放机理。结果表明,. 微球的体外释放曲线符合零级模型,/微球中的释放为扩 散机制。 . 伊.微球在大鼠体内的药代动力学性质考察结果表明, 微球在大鼠体内的释放除突释外基本平稳,且可持续释放左右;体内外释放 相关性分析结果表明,二者具有良好的相关性,且体内释放天相当于体外释 放 天。 在..干粉吸入剂的研究中,首先以包封率、粒径及吸湿性为主要考 察指标筛选并确定了干粉吸入剂的处方工艺。结果表明,干粉吸入剂粒径小 于 岬,吸湿小于%,包封率高于%,一级和二级分布量超过%。处方工艺 重现性较好。 稳定性试验表明,高湿及高温条件下.干粉吸入剂不稳定,光照和 照射对其略有影响,干粉吸入剂在加速及长期试验条件下放置个 月后无明显变化。 大鼠气管内给予干粉吸入剂后,.即可达峰浓度;【.干粉吸入剂 与皮下注射剂的生物等效性分析结果表明,两者不具有生物等效性。干粉吸 入剂 的刺激性及安全性试验表明,大鼠气管内给予干粉吸入荆后可能会引起 轻微的炎症反应。 综上可知,本研究采用新方法制备的微球外观形态良好,包封率 高,突释小,体内外释放持续时间长,制备工艺稳定,重现性好,为蛋白多肽类 药物长效制剂的研究提供了新思路,本制剂已申请专利;本研究所制备的干 粉吸 入荆不含保护蛋白及表面活性剂,体外内结果均符合干粉吸入剂的,且 在加 速及长期试验条件下可以稳定保存个月以上,本制剂也已申请专利。 关键词;微球干粉吸入剂/ ?英文摘蔓 军事医学科学院博士学位论文 . ..: ,.. ., ,. . 弛 , . , . .?.’? ,. ;. ‘ ’ / .珏 . 军事医学科学院博士学位论文 英文摘要、?犯 ., 琢? 够 %. /. 删. / .%%. . , 埘 ?. . ., / ,,。. . 加 /. 一 / . ,圮 悒 ,. . . . 英文摘要 军事医学科学院博士学位论文 . , ;嘻墙 .,% %.%, %, . 口.曲砒 . ..黜 埘 勰. 呻、 . 鼢./,, /. , . . ’ / 军事医学科学院研究生学位论文独创性声明 秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风,本人声明所呈交的学位论 文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果,除了文中特 别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果,也不包含为获得芏查匡堂盘鲎瞳或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 论文作者签字:蕉单 签字日期:』毕年垒 月』 日 军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解芏主匿茔盘鲎瞳有关保留、使用学位论文的规 定。特授权芏主匡茔盘鲎睦可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和 借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。 保密学位论文在解密后适用本授权书 签字日期: 年堕月堑日 论文作者签字:奎埠 ? 舯教师签字捆签字日期:卫乒年五日军事医学科学院博士学位论文 前言 言 前 年和首先发现了病毒干扰现象,即病毒感染的细胞 能产生一种因子,该因子可作用于其他细胞从而干扰病毒的复制,这种因子 被命 名为干扰素,。 是由宿主细胞编码的一类高活性、多功能的诱生蛋白,是细胞基因自 我稳定的反应产剜。】。可以抑制病毒或其它微生物的繁殖及肿瘤和其它细 胞的生长,同时还具有免疫调节作用,因此在临床上被广泛用作抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节药物。在临床上的具体应用包括治疗病毒性疾病、恶 性血液病、恶性肿瘤以及控制炎症反应,在免疫疾病、血管增生性疾病和纤 维化 疾病等的治疗中也可发挥作用。 可分为型和?型两种类型。干扰素根据其产生细胞和抗原性分为 种类型,即白细胞或一干扰素、纤维母细胞或争干扰素及免疫或 干扰素。随着分子生物学的发展,又发现了?.干扰素和争干扰素 ,这些干扰素均属于型干扰素;?型仅有一种,即一?。 其中,是第一个应用于临床的基因重组细胞因子。自年批 准忆用于临床以来,全球已有多个国家和地区应用制剂治疗大约 多种疾病,并取得了良好的治疗效果,已成为治疗丙型肝炎、慢性粒细胞白血 病 等疾病的首选药及特效药,是最常用于肾癌治疗的细胞因子,也是目前公认 最为 有效的抗病毒和抗肿瘤细胞因子。 目前临床上应用的?大多是由基因重组技术生产的一种高纯度干扰素, 由个左右的氨基酸组成,其理化性质及与其他类型干扰素的性质比较见表, 其模拟三维结构见图。 . 墼塑壁 型堡 型& 旦 、、 、 .. .. .? %. % % .? .每前言 军事医学科学院搏士学位论文 . 由表及图可知,刀分子量大,半衰期短,具有高级结构,分子中存 在双硫键,对周围环境比较敏感,还原剂、值、温度、反复冻融、振荡、搅 拌、有机溶剂及酶等均可影响其活性。因此,的活性保持极其困难,这使 其制剂的研发难度较大,导致市售的制剂以常规注射剂为主己上市的 制剂如表,还有局部用制剂如膏剂、凝胶剂、滴眼剂和栓剂等‘“,种类较为 单一。 。 锄 聊 。锄舢翟. : 。 .竺础协锄?. . ? 一 .. . 。:。 。。。篙。戮 鳅掣。 ??????????????????????????????????????????:一旦旦型?? 但临床上的用药周期一般较长,而该类药物半衰期较短,一般每周需 军事医学科学院博士学位论文 前言 注射给药次。这种频繁注射给药的治疗方案不仅给患者尤其有恐针症的患者 带来了极大不便,而且还具有高度危险性,患者注射后常伴有发热、寒颤、肌肉 痛等副作用,只有在严密医学监视下才能使用。另外,注射给药存在针头感染的 危险,加之注射液中常加入血液制品人血清白蛋白作为稳定剂,增加了污 染和传播疾病的潜在危险。因此,玎的临床应用受到了极大的限制。 临床用药方面存在的问题可以通过两方面进行解决:一为开发的 缓控释制剂,延长制剂的释药时间,减少用药次数,提高病人的用药顺应性。另 有试验证实,长期每日连续用药可诱导耐受现象,问歇疗法可得满意效果,长期 低剂量给药最为可取,因此缓控释制剂还可降低常规注射给药带来的毒副作用。 缓控释制剂系统中生物可降解型长效注射微球顺应了制剂向长效、高效、低毒的 发展方向,是近年来药剂学研究的一个热点。二是积极寻找注射给药的替代 途径,消除患者的用药恐惧心理,避免注射带来的潜在危险,提高病人的顺应性。 众多非注射给药系统中,肺部给药途径由于其独特的生理结构而被认为是最理想 的注射给药替代途径。因此,本研究拟从生物可降解型长效注射微球和肺吸入给 药两个方向进行.制剂的研究. 、生物可降解型长效注射微球的国内外研究进展 所谓微球是一种以适宜高分子材料为载体包裹或吸附药物而 制成的球形或类球形微粒【?,粒径一般在之间,属于基质型骨架微粒, 可以供注射、口服、滴鼻及皮下埋植等。 药物制成微球后具有以下优点:掩盖药物的不良气味与口味;提高药 物的稳定性,防止药物在胃内失活或减少对胃的刺激;可将液态药物固化以 便于运输、应用与贮存;可减少复方药物的配伍变化;可使制剂具有缓控 释功能,甚至靶向功能;可显著延长给药间隔,提高病人用药的顺应性; 避免普通注射剂给药所致的峰谷现象,减少总给药剂量,降低毒副作用;生 物可降解微球不需植入,释药后不需取出,克服了植入剂使用上的不便。 制备微球用高分子载体材料可分为生物可降解材料和非生物降解材料,早期 应用非生物降解材料较多,主要有硅酮、乙烯.醋酸乙烯共聚物等。以非降解型 材料为骨架制成埋植剂,经手术植入体内后,药物以扩散方式释出。这种埋植剂 存在需手术植入和取出及肌纤维沉积其上会阻碍药物平稳释放等缺点。近年来,军事医学科学院博士学位论文 前占 研究工作者越来越倾向于以生物可降解聚合物 为载体来 制备长效埋植剂或微球剂,其中后者由于无需手术植入而研究更为深入,应用更 为广泛。 所谓生物可降解聚合物是指一些能够在水、酶作用下降解的高分子聚合物, 包括天然生物可降解高分子材料及合成生物可降解高分子材料。较早应用的有血 清蛋白、血红蛋白、骨胶原、明胶、淀粉和葡聚糖等,这些天然可生物降解的高 分子材料生物相容性好,但制备困难、成本高、质量无法控制,不能大规模生产, 因而人们将目光转向了较易获得的合成生物降解型聚合物,如聚丙烯葡聚糖、聚 烷基氰基丙烯酸酯、聚羟基丁酸、聚羟基己酸内酯、聚原酸酯、聚氨酸、聚丙烯 酰胺等,其中应用最多的是.聚酯类的聚乳酸,. ,: ,;聚乙交酯 聚丙交酯,、聚羟基乙酸 及二者的共聚物聚乳酸羟基乙酸共聚物,。相对而言,合成生物可降解材料具有更易于获得、 质量稳定、生物惰性、降解速度可调节性和良好的可塑性等优点,可满足不同类 型药物的制备要求,得到了广泛应用。其中是由乳酸和羟基乙酸按一定比 例聚合而成,通过调整其分子量大小、单体比例等即可调节其亲水性、内在粘度 及降解周期,而且易被水解或酶解,终产物为水和二氧化碳,不会在重要器官聚 集,故被公认为良好的可生物降解和生物相容性的控释骨架,因而被广泛应用于 药物缓/控释系裂。自世纪年代首次应用于长效控释系统并获得美国 批准以来”,已有多种微球制剂上市,如:公司的、 公司的 和公司的 等。 但由于材料亲水性较差,降解产物酸性较强,使其应用受到一定限制。 尤其当包裹蛋白类药物时,蛋白类药物的疏水基团易与表面相互作用而失 活变性,而且的降解使微球内环境呈酸性,亦会导致蛋白质的失活变性, 因此蛋白类药物的微球中经常存在药物失活变性及释放不完全等问题。 为此,研究者们又有合成了一系列的新型生物可降解高分子材料,其中聚乙 二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯共聚物 / . /是一类易于水解及热降解的聚醚酯弹性体,具有降解产物酸性低,生 物相容性好,不易引起受体发生组织炎症反应,性能优良可调、价廉易得等优点。 军事医学科学院博士学位论文 前育 荷兰的植入材料公司年前将其商业化,商品名为。作为新 型生物材料,其在骨、软骨、皮肤、鼓膜组织工程和药物尤其是蛋白多肽类药物 的缓释载体方面的应用引起了人们的广泛关注,这方面的研究已取得了一批阶段 性的成果,并有部分产品进入临床【啪。 制备微球的方法主要有喷雾干燥法、超临界流体技术、反相胶束蒸发法、熔 融.挤出法、相分离法及溶剂挥发法等铡,其中应用最为广泛的方法有喷雾干 燥法、复乳.液中干燥法复乳法,/法和相分离.凝聚法等。 复乳法是目前制备蛋白多肽类药物微球最常用的制备方法,它具有工艺稳 定、设备简单等特点。但复乳法制备蛋白多肽类微球过程中,许多步骤都可能会 使蛋白质的结构发生改变,特别是在制备初乳时,由于蛋白质具有表面活性而易 吸附于油水界面,引起蛋白质的伸展、变性和不可逆的聚集,超声、搅拌等剧烈 条件均易导致蛋白质的失活变性。 低温喷雾提取法中,蛋白质粉末悬浮在溶有高分子材料的有机溶剂中,然后 喷到覆有液氮的冻结乙醇中,升温至时,乙醇融化,液滴中的有机溶剂被 提取到乙醇中而固化。该法避免了高温及油水界面,已被成功用于开发重组人生 长激素微球,并已经批准上市,成为第一个蛋白质药物的缓释微球, 商品名为 。比较复乳法与低温喷雾法,前者制备的微球突释效应 常达%,而用低温喷雾法制备的微球可明显改善上述缺点,而且据报道药 物包裹率可达%,但这种制备方法需要特殊的设备及操作条件,只有在具备 一定条件实验室中才能制备。 喷雾干燥法相对于其他方法的优点包括可重复性、粒径易控性、微球释放性 质的可控性及过程对聚合物性质变化不敏感性等,缺点为高资金投入,并且所用 蛋白须冻干后分散在聚合物有机溶液中进行匀化,这可能会引起蛋白质的聚集和 因此被包裹蛋白质的稳定性在微球的制备、释放和储存过程中成为关变性, 注的 一个焦点。 制备蛋白质微球方法还包括固体/油/油//法和部分无水法//。 //法主要是将蛋白质微粉分散在溶有高分子材料的有机溶剂中一般用乙腈 形成混悬液,在另一含有乳化剂的油溶液一般用棉子油中乳化,最后固化形成 微球。部分无水法//是在完全无水法包括低温喷雾提取法和//法和军事医学科学院博士学位论文 前言 //法之间存在的一种方法。在这种方法中,脱水的蛋白粉末混悬于溶有聚 合物的有机溶剂中,然后将这一混悬液在含有乳化剂的水溶液中乳化制备微 球。 不同的制备方法对微球性质的影响很大,因此在选择方法的同时应注意所需 微球的性质。 除载体材料及制备工艺对微球性质有较大影响外,药物性质、有机溶剂种类、 乳化剂选择、药物与载体重量比、载体在有机相中的浓度、乳化温度和溶剂挥发 的温度、溶剂挥发时的压力、微球表面的残留量及微球中水的残留量等均可 能影响微球的大小、形态、载药及释放性质埘。 评价微球优劣的参数包括以下方面:形态特征;包封率;实际载 药量;突释及释放性质;批间重现性;溶剂残留量;产率等。研究者 可结合实际情况对微球的不同参数进行重点考察。蛋白类药物的微球应具有合适 的蛋白质载量、包封率及得率,被包裹蛋白质应稳定有效,释放曲线可控。由于 蛋白质的稳定不仅是制剂有效的保证,而且聚集或变性的蛋白质可能会引起意想 不到的免疫反应,因此在微球的制备、贮存及释放过程中保持蛋白质的稳定性尤 其重要. 但蛋白质是一种大分子物质,结构复杂,富含活性基团,极易发生失活变性。 而在微球的制备过程中,往往需要搅拌、超声及有机溶剂等,这些都可能使蛋白 质发生聚集、吸附、沉淀、氧化、脱酰胺及水解等一系列物理或化学改变。在微 球的释放过程中,亦有很多因素影响蛋白质的稳定性,主要有生物可降解聚合物 的降解可能会导致微球内部和释放介质的下降,微球内固体蛋白质接触水分 后可发生不可逆的聚集,蛋白质与高分子材料的相互作用可导致蛋白质的失活变 性,温度亦是导致蛋白不稳定的重要因素,绝大多数蛋白质在条件下稳定 性差。此外,器壁对蛋白质的吸附也是导致蛋白质聚集或释放不完全的原因。 因此,在微球的制备、贮存及体内外释放过程中保持蛋白质原有的生物学活 性尤其困难,开发蛋白质类药物的长效注射微球非常具有挑战性。 目前微球给药系统中蛋白类药物稳定性最成功的策略是加入稳定剂及与金 属离子如锌离子形成复合物。 蛋白质的稳定剂主要有蛋白质、糖、多羟基化合物、氨基酸、鳌合剂和无机 盐等。这些添加剂可以增强溶液、冷冻和干燥状态下蛋白质的稳定性。如海藻糖、 军事医学科学院博士学位论文 前言 蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等可以用作一些蛋白质如胶原质、核糖核酸酶及卵白蛋白 等的稳定性,羟丙基环糊精可以作为猪生长激素的稳定剂。加入表面活性剂可以 增加从包裹到释放各阶段中蛋白质的稳定性,有研究发现吐温的加入有助于 增 加中重组人生长激素的稳定性。缓释递送系统中还可以通过加入一些其他 蛋白竞争吸附部位而达到保护目的,如在胰岛素溶液中加入白蛋白可以减少胰岛 素在固体表面的吸附。一些生物可降解型基质的降解会产生乳酸或乙醇酸等单 体,使得蛋白质处于酸环境中而易于降解,加入一些碱盐如碳酸氢钠及氢氧化镁 等可以改善微球内环境。过渡金属与蛋白质形成络合物后可以增加其稳定性,如 络合物在微球中的稳定性较未络合的人生长激素更强。 人生长激素. 尽管最近多年来,科学家们投入了相当大的精力并有了显著性进展,但可生 物降解型注射微球作为蛋白质和疫苗递送系统的研究有待加强。到目前为止,只 有可数的几个微球处方上市见表,正在研究中的微球情况见表。究其原因, 主要有以下几方面问题:产率、包封率较低,突释高;制造工艺复杂、条 件要求高,不易灭菌,较难大规模生产,稳定性和重复性差;材料在机体内 可引起炎性反应及免疫反应等。 . / 军事医学科学院博士学位论文 静言 . / 因此今后微球制剂研究的重点是提高载体材料性能及改进制各工艺,以便更 好地应用于医药领域的开发与研究。可以预测,随着制剂技术的不断更新、改造 和日益现代化,将有更多的生物可降解微球注射剂面市。制剂工作者必会克服各 种困难,制备出成功的缓释微球制刹,减少病人用药次数,延长用药间隔,提高 病人的顺应性和用药水平,为社会带来巨大的经济效益。 近年来的长效制剂得到了一定的发展,国内外研究报道主要包括埋植 剂、微球注射剂蚴和化的口【。其中化的已在国外上 ,其作用时间可维持周。日本的两家公司和目前研制了 市 一种长效成淋巴细胞样【皮下应用剂型微粒,每周应用一次治疗慢性丙型 肝炎有效。但治疗乙肝、丙肝及肿瘤等恶性疾病用药周期往往较长,临床需要具 有更长作用时间的,因此针对硎的作用时间更长的制剂研究迫在眉睫。 目前蛋白类药物的长效可生物降解注射微球是最有希望解决问题的途径之一,但 目前尚无微球制剂上市,已报道的微球存在药物活性维持时间短及释 放不完全的问题【。本研究选择/及为基质材料,将 以胶粉形式固化后制备微球,希望能为蛋白多肽类药物的微球制剂研究提供新的 思路。 、干粉吸入剂的国内外研究进展 世纪年代以来,蛋白质及多肽类药物新剂型的研发就转向了非注射途 径给药及长效注射剂。其中,非注射给药途径的作用部位主要包括鼻腔、肺、 颊军事医学科学院博士学位论文 前寿 粘膜、直肠、口服、透皮、眼及阴道等,由这些部位给药面临的问题主要有: 给药或释放部位粘膜透过性低,药物吸收差;但体液易造成药物水解或酶解, 药物稳定性差;存在肝脏的“首过效应”,药物的生物利用度低;药物对作 用部位的靶向性差。 其中,肺部给药由于其独特的优点而被认为是众多给药系统中注射给药最理 想的替代给药途倒弼】,其优点主要表现在:具有巨大的吸收表面积,约, 成人肺泡数目可达亿个,总面积约为,超过体表面积倍;肺 泡由单层上皮细胞构成,厚度小于.,且大多与毛细血管紧密相连,通透性 好,吸收屏障小,经空气.血液途径交换距离短,药物吸收迅速,给药后起效 快; 毛细血管丰富,血流量大,可达/;可避免肝脏“首过效应”, 且肺细胞内外的生物水解代谢酶活性低,有利于提高药物的生物利用度;患 者顺应性好,特别适用于需进行长期治疗的病人;药物吸收后可直接进入体 循环,达到全身治疗目的;起局部治疗作用时,可明显降低给药剂量,减小毒 副 作用黩卿。 由于肺部给药的诸多优点,经肺吸入递送大分子药物的给药方式引起了广泛 , 的关注.目前肺部吸入给药剂型主要有有定量吸入气雾剂 、雾化吸入剂和干粉吸入剂 ,”。 定量吸入气雾剂主要由药物和抛射剂组成,使用时可通过定量阀门控制剂 量。据报道,定量吸入剂主导了全球哮喘吸入剂销售市场,约有,万人使用。 的优点在于其便携性、低成本和可处理性,但其使用仍有一定的局限性: 使用氯氟烃类抛射剂对某些高敏感病人可产生冷效应 ,还可破坏大气臭氧层,造成环境污染,但目前已研究者提出了使用新型 抛射剂氢氟代烷烃类;需耐压容器和阀门系统以及冷却和灌装的机械 设备;药物递送的剂量较小,生物利用度相对较低;许多病人尤其儿童不 能很好的协调自身呼吸和吸收装置,在一定程度上限制了其应用。 雾化吸入剂是经雾化器递送药物溶液或混悬液的。传统的喷射雾化器利用压 缩空气流雾化封装在带有毛细管给液系统储药室中的水溶液或混悬液,其局 限性 是药物的雾化是连续的,而吸气循环的时间仅占整个吸入和呼出循环时间的 约 %,因而大量药物被浪费。超声雾化器是利用超声波在药物溶液中产生空化作 军事医学科学院博士学位论文 前言 用,使药物变成细微雾粒直径~的气溶胶到达病灶沉积,其局限性是激素、 蛋白类药物可能会被超声波破坏。在雾化器中,只有小部分能量在雾滴的形 成过 程中是必须的,其余的能量将转变成热量而引起雾化器内液体温度增加,直 至输 入能量与蒸发溶剂分子和循环空气的能量平衡,这将使医用超声雾化器中的药物 溶液温度较周围温度高约,可能会引起蛋白多肽类药物热变性。等 发现雾化后,蛋白类药物失去了%的活性,超声雾化器在人重组去 氧核糖核酸酶的肺部递送中也因此受到限制脚】。 是借助患者吸气气流将装载于吸入装置内的药物或和载体微粉化, 并吸入呼吸道或肺部而起治疗作用的一类制剂。自年英国公司研制的第 一个干粉吸入装置世以来,已由第一代的胶囊型发展至第三代的贮 库型,粉雾剂品种也由色甘酸钠发展至治疗哮喘各环节及全身其他疾病的药物, 组方也由单方制剂向复方制剂发展。 具有携带方便、易于操作呼吸推动、价格低廉、无抛射剂污染、室温 稳定性好、吸入的效率高、不易被微生物污染、不含溶剂及对病变粘膜无刺激性 等优点。许多文献认为,千粉吸入剂具有远远超过喷雾器和定量吸入剂的优势, 并更适合于蛋白多肽类药物的肺部递送。 经吸入递送的药物会因重力及惯性撞击等作用而沉积在气管或肺的不同部 位,因此良好的粉体学性质对于粉吸入剂的成败和质量保证具有非常重要的意 义,重要的粉体学性质包括粉末粒径及粒径分布、流动性、密度、雾化性能、 吸 湿性和荷电性等。 粒径对沉积部位有着直接影响,一般粒子小于.时易随气流呼出, 时易沉积于肺泡,时沉积于气道,大于时易沉积于咽部,因此粒径 不应超过.范围。因此较大颗粒的药物及载体必须经过粉碎才能达到肺部 给药的要求。通常采用磨粉碎法、喷雾干燥法、超临晃流体技术及其他一些新技 术。蛋白质粗粉可以在喷射磨流能磨、球磨、胶体磨和锤击磨上粉碎成可吸 入粉末,但多肽和蛋白质类药物在粉碎过程中易发生化学降解,需要通过某些制 剂技术如冷冻干燥或加入载体来增加药物的稳定性。等【】的研究证实,只有 用较高的喷雾干燥温度才能使粉剂的湿度水平接近%,这不利于大型的工业生 产和后继的真空干燥。等】继续比较了分别采用喷雾干燥和喷雾冷冻干燥技前言 军事医学科学院博士学位论文 术制备的蛋白悬浮颗粒性质,结果表明冷冻喷雾干燥法制备的蛋白颗粒为光亮的 疏松性状,且具有更好的空气动力学特性.超临界流体技术操作条件相对温和, 较有利于蛋白多肽类药物的粉碎,但需要特殊的条件和设备。 不同形态和密度的粒子在呼吸道停留的几率也不同,带棱角、细长形粒子及 密度小的粒子不易被截留。颗粒表面形态和粉末密度与其在气体中飞行时的顺应 性直接相关,密度越小,越容易随着气体飞行流动。干燥粉末的敲击密度通常为 /以,更好的是. /以。敲击密度越小, ./以,较好的是. 则大粒径越容易进入肺泡部位,如敲击密度小于. /时,粒径为以上的 粉末也有可能进入肺泡。 粉雾剂中药粉粒径小,比表面积大,极易吸潮而聚集成块,而且用药时不易 分散,从而可能会影响疗效。因此。有人指出蛋白/多肽类组分作为干粉吸入剂 面临的最基本的问题是粉末吸湿性【。,?认为即使成功地解决微粒粒径问题, 干粉还会经常吸湿而导致在人为的环境下粒度分布的改变。 性能好坏的最终评价指标则是其在体内外的沉积情况,该指标可以验证 处方的合理性。体外沉积一般采用人工呼吸道和人工肺,选择体外二级或多 级碰撞取样器,模拟进行体外沉积试验,考察药物粉末在呼吸道各部位的沉积率。 体内肺部沉积一般采用放射性标记法进行检测。 经由肺部途径实现蛋白/多肽的递送而发挥全身活性具有较大的开发潜力, 但还面临着很多问题,主要包括蛋白多肽类药物的稳定性差、易在肺部引起 免疫 反应、给药剂量不准确及由于药物消除迅速而导致的药物作用持续时间短等 。 . 药物颗粒的冷冻干燥、粉碎及雾化作用等往往容易改变蛋白,多肽的构象, 从而降低蛋白多肽类药物的生物活性。聚乙二醇、明胶、聚乙烯吡咯烷酮 、泊洛沙姆、表面活性剂吐温等都是很好的活性保护剂,有助于维持蛋白 的化学稳定性。 雾化吸入抗原后,原始的免疫接种作用将会诱导局部肺细胞介导免疫,从而 激发粘膜表面产生抗体。等‘指出修饰的蛋白可以减少吸入后免 疫原应答发生的机会。 有资料指出,仅通过常规的和系统,大部分药物不能到达肺部,前育 军事医学科学院博士学位论文 许多药物可能会残留在装置中,也可能会残留在雾化室系统中如果使用雾化 室,但大部分药物会滞留在在咽喉部,然后通过吞咽进入胃肠道系统。一般的 干粉吸入剂仅约~%的药物可以到达肺部,而到达肺周边的只有~%左右。 蛋白多肽类药物大约仅有?%到达肺泡并被吸收,这表明相对于最初的给药剂 量,通常肺部递送系统的生物利用度只有%甚至更少。最近出现了有关 和递送的新概念,可使大量药物以更精确的剂量递送到肺部,且主要是肺 部深处。 尽管存在许多问题,干粉吸入荆还是成功的应用于许多蛋白类药物。如甲状 旁腺激素尸经成功地制备成了干粉吸入剂。辉瑞与赛诺菲安万特公司 共同开发的经肺吸入给药的胰岛素雾化吸入剂已于年月获得美国批准 上市,商品名。是使用获得专利的专用吸入器经口腔吸入给药, 将雾化的胰岛素送达患者肺部。这是自年胰岛素发明以来的除注射途径外的 第一个新的胰岛素给药方法,并可作为胰岛素皮下注射给药的替代治疗【】。 目前,正在研究的经肺部递送的蛋白有降血钙素、干扰素、生长激素和甲状 旁腺激素等嘲。文献报道可能经肺递送的蛋白及多肽类药物如表。 . /,. . . ,. 可将药物直接递送至肺部,并在肺部直接起作用,增强了药物的药理作 用,减少了用药剂量,降低了药物的副作用,是最有希望替代注射给药的给药 途 径。目前已有专业“粉末吸入”制药公司,的产品也正逐步进入临床研究四。 但仍有许多工作需要进一步研究,尤其是维持蛋白生物活性、后期制备及递 送装军事医学科学院博士学位论文 前言 置方面。相信不久的将来蛋白多肽类药物的肺吸入制剂必有突破性进展。 本课题将制备的干粉吸入剂,以吸湿性、粒径等主要考察指标筛选 处方,并对粉剂处方工艺的重现性、粉剂在大鼠体内的药代动力学性质及粉 剂的 刺激性及安全性等进行考察。 参考文献 . 【】 四. :?. . ?田. ,,:. , 【】 / . ,,:. , .: 【】 明. ,:., 】 ,叨. , :. . 【】 , , , 叨.,,:.. 【】 , , . , : ,,: 阴. . 【】。、,【】.,,:.. .【】 . ,:?. 国家药典委员会编.中华人民共和国药典年版,二部】.北京:化 学工业出版社. 【】毕殿洲,药剂学,人民卫生出版社,,第四版: .., ... 【】 .., ...,,: 【 印 , . 阴...,前言 军事医学科学院博士学位论文 .: 【】杜兵,程祥荣聚乳酸及其共聚物微球的性质及应用川.国外医学生物医学 工程分册,,: 【】张蜀,谭载友,陈济民.聚乳酸类缓释、控释注射剂的研究进展【】中国 药 : 学杂志,, .. 【】 ., 阴..., ,:. 】邹静恂,杨华,徐瑞兴等.聚醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯多孔细胞支架 的制备与表征川.首都医科大学学报,,: 琏, 【】 ., . . ,,: 】 .“酣 ., 田. : . 】 , , : /. .,: 【】 , . 叽. ,,:? 【】傅应华.国内微球剂的最新研究进展叨.药学实践杂志,,: ? 】 , .,: . ?. 】 . 军事医学科学院博士学位论文 前言 ..,,:? . 】 阴. ,,: ? . ., 【】 . . ,: 妇 ., ., .,.:. ,: 撕 【】 , . . ,: 【 .. . ..,。:?.,. ,. ,,: 【 】 .,..。 】. ,,: 【 , . , :. ,,:., , . 蚴?: .,:. ... , 吖 军事医学科学院博士学位论文 前言 . ,:? .亿. 伽 ? 叨. ,,: .【 . ,,: . . , 【 ,. .:? .【, / 阴. ,,:. , ;几, .,,: .... . 】. .: , 【 ., ,,: . 】 飚, . : . ,,:? , ,,【】 .,,:. 【】. , . 【】 , ,, 叨. “:. 前言 军事医学科学院博士学位论文 , , . 】 , ? . ,,:. ,【】 ,,,: . ,, , . 【】 :川.,: 【】. 】.:, ?. , , 】 , ..:. . ,【 . ,?:. , ,】 , .鹅 . ,:. , ,耽.. 【】 ,,:. 田. 【】. 【】.,, ?。 【】 , , .?川. ,,:.. 【 ,. ,,?:?. ? , , 【】 . . ,,:. 【., .. . ,,: 前胄 军事医学科学院博士学位论文 .,.,,. .. ,,:. 【.,. .:...,, . ,.: . 【,? ...,. .。. .,... .,,:. : 【】 /】.://.. / /.,?. . 【】 【. ,,:. 【“】申海燕,朱家壁.多肽和蛋白质及疫苗类药物干粉吸入给药的研究进 展】. 国外医学药学分册,,:.,.,.,.,. 川....,?. 【.,,.,.,. 四.,,: 【】..,? ,.,.,,.,... .:.】&.,. .. .,: . ., 【】 .,.‘忉.., ,:. . 【,。 .:, ,...., .,,. 军事医学科学院博士学位论文 前言 :争七. 【吸入制剂质量控制研究技术指导原则第二稿 陈西敬,朱家壁.蛋白质和肽类药物肺部给药新剂型一吸入粉雾【】熊莲沽, 剂】. 药学进展.,:? ..., 【】 / .,,,:. . 【 ..., ., .., : 丘..,,:. 。【】,? ,.,.: ~. ,.,, 【.,.,,..,. .: ,,,, ?. 】..,. ? ..,:. .. 【】,..,. .. 川. 【】,..,.,.,? ..,.,. : .,. 【 .., / ..:?. 【】审评五部审评十置内分泌项目组,:匕准首个胰岛素雾化吸入剂 上市,电子刊物国家食品药品监督管理局药品审评中心 【? ,..,,.,乙,,.,. ...,” . .军事医学科学院博士学位论文 前寄. ,.. 【】.. ,,. 【】李风前,胡晋红,朱全刚综述.干粉末吸入给药系统【】.国外医学药学分 册 :第一部分缓释徽球的研究 军事医学科学院博士学位论文 第一部分洳缓释微球的研究 具有广泛的抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用,是治疗丙型肝炎、慢 性粒细胞白血病等疾病的首选药及特效药,也是最常用于肾癌治疗的细胞因 子, 被广泛应用于临床。由于的活性保持极其困难,制剂研发难度较大,目前 市售制剂种类单一,以常规注射剂为主。但由于一体内半衰期短, 每周需要注射给药次,频繁注射给药给病人尤其有恐针症的病人带来了极大 不便,而且患者常伴有发热、寒颤、肌肉痛等副作用,具有高度危险性。因此, 长效干扰素制剂的开发势在必行。 近年来,长效的研究有了突破性进展,国外已有聚乙二醇化上市。 但其疗效只能维持一周【。因此,作用时间更长的长效可生物降解注射微 球具有重要的临床意义。但由于稳定性较差,对周围环境极其敏感,使得 微球的制备、贮存及使用过程中保持的活性成为制剂研究的最大难点,目 前尚无微球制剂上市.。本研究希望能开辟一种新的微球的制 备方法,使在微球的制备、释放及贮存过程中保持活性,同时为其他蛋 白多肽类药物微球制剂的研发提供新的思路。 本部分主要包括分析方法的建立、胶粉的制备及处方筛选、微球的 制备及影响因素考察、微球处方的优化及处方工艺重现性考察、.微球稳 定性考察、田伍.微球释药机理的探讨及微球在大鼠体内的药代动力 学性质考察七方面内容。 第一部分缓释微球的研究 军事医学科学院博士学位论文 第一节.分析方法的建立 目前测定含量的方法有多种,主要包括法【、法、 法【、放射免疫分析法?【、酶联免疫吸附法法及细胞病 变抑制法法等。 法可用来测定溶液中的蛋白总量,但灵敏度低,最低检测限为 扯/左右,不能满足药物制剂学和药物体内代谢动力学实验的要求,。 法和法的最大特点是快速、简便、不受还原性试剂的干扰,但二 者均需要使用另外一种蛋白质作为参照,参照蛋白质不同,检测结果差异较 大。 此外法还具有背景色深,线性范围窄等缺点。法灵敏度高,线性 范围宽,但该方法需要特定的实验室环境,操作后的用品也需特殊处理,目前 已 逐渐被法所取代。法是以免疫原理为基础,通过抗原决定簇来 测定抗原蛋白的含量。但对而言,由于其抗原决定簇并不一定是活性中 心,因此法测得的含量与其生物学活性没有明显的相关性,因 而只能从侧面反应.的结构。目前,嗣生物学活性的检测一般采用 法,但该法较为繁琐,成本商,且误差较化学方法大.总之,含量测定方法 与生物学活性’钡定方法各有利弊,含量测定方法不能真实的反映蛋白活性, 但测 定方法简便,灵敏度高,活性测定方法虽能如实反映蛋白活性,但操作步骤繁琐, 且误差相对较大。因此,要全面、真实的反映三维结构的维持情况,需 要将多种方法结合起来相互印证。为达此目的,本部分分别建立了法和 法用于测定的含量及活性。埘。 试验材料 ./,深圳海王药业提供:.的鼠抗人单克隆抗体 ,;本室自制;辣根酶标山羊抗鼠 ,:北京中杉金桥生物技术有限公司;邻苯二胺, 公司进口分装;牛血清白蛋白,进口分装;人羊膜细胞株 细胞,军事医学科学院微生物与流行病研究所提供;水泡性口炎病毒,军 事医学科学院微生物与流行病研究所提供;培养基公司;小牛血 清州,杭州四季青生物工程材料有限公司;其它试剂均为分析纯。 恒温水套培养箱一,湖北黄石医疗器械厂;止、灿,及肛军事医学科学院博士学位论文 第一部分缓释微球的研究 移液器,法国::和冰箱广东科龙电器股份有限公司;孔酶 标板:酶标史公司;细胞培养箱 ;超净台一型生物洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司; 道移液器;冰箱公司;孔细胞培养板; 显微镜重光;细胞计数板上海求精生化试剂仪器有限公司。 试验方法 . 法测定含量方法的建立 ..溶液的配制 各种溶液的配制方法如下: 包被缓冲液:./ :缓冲液; . 洗涤液:. /.磷酸盐缓冲液,临用时加入.%吐 温: 封闭液:含%的; 反应稀释液:含.%的; 底物显色缓冲液:.柠檬酸与. ?溶于蒸馏 ‘ 水中: 终止液:/ 。 .. 含量的测定 间接竞争法测定妇?含量的步骤如下:包被抗原即: 将用包被缓冲液稀释成浓度为/的溶液,混匀后加入酶标板中, 每孔,密封过夜:洗涤:倒去酶标板中抗体溶液,洗涤次; 封闭:加入封闭液肛/孔,密封温育;洗涤:倒去酶标板中的封 闭液,洗涤次;加单抗与待测样品:将待测样品进行预稀释后与: 稀释的单抗:混合,混匀后加入到酶标板中,每孔加,密封温育; 洗涤:洗涤次:加二抗:将二抗稀释,倍后加入酶标板中, 每孔加.,密封温育;洗涤:洗涤次;显色:称取 ,加入到底物显色缓冲液中,溶解混匀后加入此%,混匀 后迅速加入酶标板中,每孔斗,然后于避光处显色;终止反应:显色 后,加入终止液,每孔此,然后于酶标仪上处读数。军事医学科学院博士学位 论文 第一部分.缓释徽球的研究 ..曲线的制备 / 配制浓度分别为、/、、、 及/的溶液,将其与:的单抗混合后测定不同浓度? 溶液的吸光度值,并绘制标准曲线。 ..闯接竞争法最低检测限的确定 测定个零标准吸光度值,其平均值减去倍标准差.即为本方法的 最低检测限。 ..回收率的测定 分别配制浓度为/、/及/的抗原溶液,与:倍 的稀释单抗混合后分别作为高、中、低三个浓度的样品测定间接竞争法 的回收率。 ..批内批问精密度的测定 分别配制浓度分别为/、/及/的抗原溶液,与: 倍的稀释单抗混合后分别作为高、中、低三个浓度的样品进行测定。同批标 准浓 度样品在块酶标板中各测定次,澳定本方法的批内精密度;批标准浓度样 品/在同一酶标板中各测定次,测定本方法的批间精密度。 . 法检测.效价方法的建立 ..溶液的配制 各种溶液的配制方法如下: 完全培养液:培养液添加%; 测定培养液:培养液添加%; 攻毒培养液:培养液添加%; 消化液:. 胺四乙酸二钠、、.、.、 ,用蒸馏水配成的溶液,经?、高压灭菌; . 染色液:结晶紫加入乙醇溶解,用蒸馏水定容至 脱色液:%乙醇,%蒸馏水,.%乙酸/。 ..?效价的测定 法检测样品中玎附小效价的步骤如下:完全培养液中培养 细胞,每”消化传代:待细胞长满后,用胰酶消化,加入适量完全培养液 分散、稀释细胞,使其密度为.~.个细胞/,混匀后接种于孔军事医学科学院博 士学位论文 第一部分缓释微球的研究 细胞培养板中,每孔“。培养“;将?对照品用测定培养液稀 释至/;预稀释待测样品;另取一孔细胞板,将待测样品进行 倍比系列稀释;取出步骤中的细胞板,将步骤中的溶液混匀后对应移 入该细胞培养板,每孔,培养~;取保存的用攻毒培养液稀 释至/:取出步骤中制备的细胞板,弃去上清,加入病毒液, 每孔,细胞攻毒;染色及读数:弃去细胞板中的上清液,每孔加入 皿结晶紫染色液,室温放置后吸去染色液,用水清洗次并吸干残留 水分,加入脱色液旺/孔,室温放置后酶标仪中测定各孔的吸光度值 测定波长,参比波长。 .. 法剂量反应曲线的绘制 以对照品及待测样品?稀释倍数的对数值为横坐标,以吸光度 值为纵坐标绘制剂量反应曲线。然后将剂量反应曲线中直线部分吸光度值与 相应 稀释度的对数值进行线性回归,求出回归方程和回归系数,并将对照样品稀 释后 效价为处的吸光度值代入样品回归方程中,计算样品在相同吸光度值处的稀 释倍数,即为样品的效价。 样品效价的计算公式为: 待检样品效价标准品效价待检样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数待 检样品半效稀释倍数/标准品半效稀释倍数 ..精密度的测定 配制高、中、低种不同浓度的对照溶液,分别在同一细胞板日 内及不同时间不同细胞板日间中测定其效价,考察法的批内、批间精密 度。 ..回收率的测定 分别配制高、中、低种不同浓度的对照溶液,各吸取皿,后分 别与大鼠空白血清及空白释放介质混合,混匀后法测定效价,计算 样品的回收率。 试验结果 . 法测定含量方法的建立 ..标准曲线的绘制军事医学科学院博士学位论文 第一部分缓释微球的研究 采用法测定.所绘制标准曲线如图.。结果显示,标准曲线 的线性关系,相关系数大于.。 . .. 法的灵敏度 重复测定个零标准孔样品,求出的平均值为.,标准差为.,计 算出本方法的最低检测限为./。 .. 法的回收率 高、中、低三个浓度样品的回收率测定结果如表.所示。结果显示, 法的回收率在.~.%之间,符合要求应在%之间。 . .. 法的精密度 批内与批间精密度的测定结果表显示,高、中、低三种浓度的样品批 内批间精密度均在%以内,符合要求。 . 一 .. . ?。廿锄瓦丽矿?面万:厂一?面磊丽?聂顽万一 吐 . . . . . . . . . . . . . 法测定.效价方法的建立第一部分缓释微球的研究 军事医学科学院博士学位论文 .. 法的剂量反应曲线 以对照品,样品稀释倍数的对数值为横坐标、以对照品,荦品的值为纵坐 标绘制剂量反应曲线,如图.。结果显示,.的浓度与保护作用呈典型 的曲线关系,在一定浓度范围内两者成直线关系,提示在该浓度范围内值 与浓度成正相关。 . . 乞 . . . 窖 】懈球旺/ .将剂量反应曲线中的直线部分进行线性回归并计算回归系数见表.,用 检验评价标准品和样品的反应剂量曲线是否偏离了直线性和平行性。由表. 可 知,样品和对照品的回归系数均大于.,说明.在该浓度范围内值 与稀释倍数的对数值呈直线关系。将两条直线的斜率及截距用软件进行统 结果均大于.,说明两条剂量反应曲线的斜率与截距均无显著性差 计分析, 别,因此两直线均未偏离直线性,且两条直线基本吻合,表明结晶紫染色法可 以 用于.样品的活性测定。 ... 法的精密度 由表可知,法测定效价的日内精密度在%以内,日间精 密度在%以内,符合要求小于%。军事医学科学院博士学位论文 第一部分缓释微球的研究 ... 法的回收率 由表?可知,在血清及释放介质中的回收率均在%之间, 且均小于%,符合要求。 .?肭? 讨论 间接竞争法中显色系统的种类选择对免疫分析方法灵敏度有重要的 影响。本文中方法显色的底物为常用的。但性质不够稳定,在 空气中易被氧化而使配制的显色液本底升高;实验中均为现配现用,以使阴 性对 照保持在相对较低水平。信号放大系统采用的是辣根过氧化物酶,该酶对 微生物污染、叠氮化钠、次氯酸以及氯化芳香族化合物都高度敏感,在准备 待测 样品的过程中需要特别注意。 具有抗病毒活性,当未加的对照孔出现~%的细胞病 变,而未加病毒的细胞对照依然完好,此时若与某一稀释度的样品共育 的细胞仍有%左右不出现病变,则表示该样品内含有保护细胞的足够., 其稀释度即为样品中含有的效价。但由于各实验室所用细胞和病毒种类 不同,测定条件各异,所得活性单位会有很大不同。放必须经国际参考品进 行校正后得出统一的单位,即用国际单位?表示。第一部分缓释微球的研究 军事医学科学院博士学位论文 结论 首先成功建立了检测晓含量的法。当浓度在 ~/范围内时,样品的吸光度值与浓度呈良好的线性关系 .,样品的回收率在.?.%之间,批内变异系数为.%,批间变 异系数为.%,最低检测限可达./,该方法准确可靠,重复性好,可 用于.含量的检测。 法测定效价过程中,一定浓度范围内细胞孔的吸光度值与样品 稀释倍数的对数值成直线关系,由此可以通过结晶紫染色法测定样品的效价。 法测定叶效价的日内精密度在%以内,日间精密度在%以内, 在血清及释放介质中的回收率均在~ %之间,且均小于%, 符合要求,说明法测定.的效价准确、可靠。军事医学科学院博士学位论文 第一部分.缓释微球的研究 第二节胶粉的制备及影响因素考察 为在微球的制备、贮存及