SARⅡ628双胚苗水稻自然同源三倍化后DNA甲基化与基因表达研究（可编辑）

SARⅡ628双胚苗水稻自然同源三倍化后DNA甲基化与基因达研究（可编辑） SAR?628双胚苗水稻自然同源三倍化后DNA甲基化与 基因表达研究 分类号』?:: 密级?? 学号墼鲤垫 学位论文 双胚苗水稻自然同源三倍 化后甲基化与基因表达的研究 彭海 指导教师姓名:吴先军教授四川农业大学 汪旭东研究员四川农业大学 周开达院士四川农业大学 专业名称: 申请学位级别:盛? 生物毡堂皇筮王生趁芏 论文提交日期:竖生篮且目论文答辩日期:竖生竖耳 学位授予单位和日期: 四刖盔些太堂竖生旦 耳 答辩委员会主席 评阅人:一 年月论文独创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得塑农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名:氦』勿 妒;年月订 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业人学有关停留、使用学位论文的规定,即?学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ,炒年月彭日 研究生签名:勤知 导师签名: 年 月 日摘要 近年来,植物多倍体进化与基因表达研究已成为多倍体研究的前沿,取得的 主要成果是多倍化后迅速发生了基因表达多态性分化,包括多倍体群体内不 同单 株闻多态性表达与器官特异性表达变化。然而研究主要集中于小麦、 棉花、芸苔等偶数倍的人工异源多倍体,同源多倍体 甲基化与基因表达变异研究仅有少数几个例子:如酵母 和拟南芥等:自然多倍体中也仅少数几个最近起源的多倍体如大米 革、婆罗门参和千里光,知道并能获得其起源亲 本而对其进化与表达有所研究;自然发生的同源三倍体水稻甲基化与基因 表达变化研究几乎没有,然而同源多倍体与水稻多倍体都与进化相关,因而 同源 多倍体与水稻多倍体基因表达与进化的研究也不应该被忽视。 本研究中采用双胚苗水稻?..中自然发生的同源三倍体为研究材料, 利用同裂酶和分析了三倍化后甲基化变异;利用基因芯片、 与三种方法相结合分析了三倍化后基因表达变化基因芯 片分析中兼顾了单倍化后基因表达变化。结果表明自然同源三倍化 后当代甲基化与基因表达都迅速发生了不同程度的变异,取得主要结果如 下: 一、甲基化变异分析:三倍化后甲基化程度变化不大,由.%变化为 三倍化后的.%;个甲基化变异位点中甲基化程度上升、下降与不定的 比例分别为.%、.%和.%,甲基化程度下降多于上升;甲基化 变异遍布于整个基因组且存在位点特异性。 二、芯片分析结果:芯片分析从两个角度进行,一是单倍体、二倍体和三倍 体联合分析;二是对三倍化过程单独分析。联合分析主要结果如下:大部分 染色体对倍性敏感程度不一样,即有些染色体上的位点在倍性变化时更容易 发生 表达变化;倍性敏感位点倍性变化时表达发生变化的位点存在成丛分布; 倍性敏感位点在功能上分却不均衡;单倍化中表达变异频率高于三倍化但 表达量与功能都差异不大:单倍化与三倍化中都有相当比例沉默与激活的极 端表达调节类型且激活多于沉默,类似地,表达量上升也多于下降;单倍化 与三倍化对同一基因有类似的影响,与基因组剂量效应不一致。三倍化过程 中基因表达分析结果如下:三倍化敏感位点在染色体间分布也不均衡但不存在成 蛋白 丛分布;三倍化后甲基化合成酶与 表达变化不大,仅表达沉默,显示了甲基化信号传递受阻;三倍化 后较多的乙烯合成位点表达上升;三倍化后较多的转录调控位点表达发生变 化,其中具有结构域的表达全部上升;重组修复因子一在三 倍化后启动表达。 三、分析:三倍体单株问表达变化能力接近,但激活能力 差异造成了器官阗表达变化能力的差异;部分位点在群体内单株问存在多态 性表达与多态性表达变化:部分位点存在器官特异性沉默或激活。 四、分析:部分位点结果与芯片结果不一致;三 分之一的表达变异位点在三倍体群体内单株问呈多态性表达,更多位点呈多 态性 表达变化,多于分析中的比例;存在各种器官表达变化模式, 各种模式位点数分布与存在一定差异。 最后对研究材料、方法与不足,以及三倍化后基因表达调控可能机制等方面 进行了讨论。与多倍化后甲基化变异与基因表达变化研究领域的其它研究比 较, 本项研究具有较大创新,主要体现如下:材料独特,弥补了多倍体进化与基 因表达研究中对自然发生的多倍体、同源多倍体、奇数倍多倍体以及水稻多 倍体 研究的不足;方法上利用了基因表达研究中三种较准确的新方法来保证结论 的准确性;在一些基本问上,获得了与其它多倍体研究中不同的结果,主 要包括:三倍化并没有引起较大甲基化变异;三倍化中基因激活多于沉默;倍 性 变化中绝大部分基因表达与基因组剂量效应相背离。 关键词:双胚茁、三倍体、二倍体、甲基化、基因表达,水稻 ,. ..; ; ; . .一 ? , , .; , ?. 一 . : ,%.%, ; ,.%,.% .%, ; . : .撇 .. : , . ; ? ; ; ; .;.:、 晰 ; ? 掣 ; ? ; ;, : . ; . ;:删 ;? , ;卫氏. , , .他: ;、 ; 蚰昭. :. 第一部分文献综述 一、多倍体的形成、遗传、表达调节与进化 .多倍体及其形成 多倍化在整个真核生物的进化史中都存在 ; ,包括 很多重要的农作物等,在内的开花植物等,; 相对 等,中特别普遍。蕨类植物中的 于开花植物来说有相当多的染色体数目,最近的研究,推测如 同被子植物那样,基因重复在蕨类植物进化中有着重要的角色,或者小规模的重 复是 基因重复的主要形式;或者多倍化的证据被大范围内的染色 体重排、小规模的重复和多倍化后的序列消除所掩盖了。不同于植物多倍体,动 物多倍体较为少见,但也在一些无脊椎动物如昆虫和脊椎动物如鱼、两栖动 物、爬行动物中存在等;等,。但是动物和人类的非 整倍体和多倍体细胞主要是和恶性肿瘤的生长与发生相关等,。 内源多倍体倍体机体内的多倍体体细胞似乎是对动植物发育变化的一种生 理反应等;等,,表明动植物基因组是可变的, 具有弹性的。在后基因组时代中,多倍体是~个吸引人的具有挑战性的生物学研 究领域,取得了很多研究进展,并提出了相当多的新观念。 回顾历史,在年最先引入多倍体这个术语,, 紧接着在年又指出多倍体在被子植物进化中的重要性,。 起初,由于自然界中动植物多倍体材料难以获得,因而多倍体的研究受到了一定 程度的限制。年,和利用秋水仙素减数分裂中细胞分裂的 化学抑制剂等,在植物中诱导多倍体。这种技术成功地在二 倍体和种问杂种的分生组织中诱导了染色体的加倍。加倍二倍体基因组获得的多 倍体就是同源四倍体;加倍种问杂种形成的多倍体就是异源四倍体。利用这种方 法,在实验室中合成了很多人工异源多倍体,如芸苔包括芸苔属个栽培种 ,昱和最中任意两个基因组等,; 等,、棉花亚洲棉×瑟伯氏棉或比克氏棉等,,、小麦一粒小麦×沙融山羊草等,;等,和 小黑麦小麦×黑麦等,.因为确切的知道其起源祖先,人工多 倍体是研究多倍体形成早期基因表达变化与基因组变化很好的材料。在自然多倍 体中,除了少数几个最近起源的多倍体如大米草等,、婆罗门参 等,和千里光等,外,其它自然起源多倍体的祖先或 者找不到了,或者我们根本就不知道它们的祖先是什么。 同源多倍体和异源多倍体的概念最先是和在年引入 等,,并被进一步完善。在《植物分类》这部书中, 将多倍体划分为同源多倍体、节段异源多倍体、双二倍 体从和同源异源多倍体 .。这里的和分别表示起 源于物种和的基因组,下标。”则代表了物种基因组内的亚基因组。但 .提出,任何企图将自然界中复杂的多倍体单纯的划分为同源 或异源多倍体两个极端类型都是不适合的,只会事与愿违,使得研究工作更为混 乱而不是更简单,。 自然起源的多倍体是如何形成的昵通常有两种起源模式可以解释 .; .。“两步法”模式认为异源四倍体是通过两个二倍 体物种杂交后染色体加倍形成。然而在自然条件下,通过合子自然加倍形成多倍 体或者通过顶端分生组织加倍形成多倍性嵌合体都是很稀少的,; “一步法”模式则认为异源四倍体是通过二倍体中未减数的雌雄配子融合而来 的,或者是通过两个同源四倍体杂交而来的,如新合成的拟南芥异源四倍体 等,等,;等,。因为几乎所有的物种都 会通过减数第一次或第二次分裂失败产生较少的不定数量的未减数配子咖等, ,而且很多物种是同源四倍体 .,所以未减数配子的 融合可能是产生多倍体的主要方式。两种模式都可以形成同源四倍体,也就是说, 同一个植株的未减数配子的融合可产生同源四倍体,而同一个物种的染色体加倍 也可形成同源四倍体。显然,仅用这两种模式来解释同源或异源多倍体的形成显 得过于简单了,还有其它的一些关于多倍体形成的更为详尽论述,如三倍体桥、 不同倍性水平的变化等等,;等,. 一些异源多倍体通过多次的多倍化进程和物种间互交形成,比如婆罗门参 等,;和芸苔 ,;而另一些异源多倍体则是通过一次或 少数几次杂交事件形成,比如棉花等,、小麦等, 和拟南芥等,。新形成的异源多倍体也可能与其二倍体或同源多倍 体祖先再次相互杂交而形成一个多倍体、祖先种和它们的中间形式共存的混合带 .;.;等,;等,。在进化 过程中,很多多倍体都经历了二倍化过程,以便其染色体的配对与分离按“二倍 体”的方式进行。二倍化过程会导致大量的基因丢失与基因组重排等, ,结果古多倍体事件只能在大规模的测序中才能被清楚的检测到。拟南芥 和玉米都是四倍体二倍化而来的,或它们都曾是古多倍体,;, ,水稻等,,;等,中含有大量的染色体重复 基因区段,表明其也有多倍化的经历。对古多倍体或节段多倍体 的同源基因调控机制作了精辟的论述。 综上所述虽然高等植物中多倍体相当普遍,但这些多倍体的形成过程却基本 相似,主要通过两条途径产生多倍体。其一是原种或杂种形成未减数配子受精结 合,使染色体数加倍;其二是通过各种方法使原种或杂种合子染色体数加倍.在 自然界中,自发形成的多倍体往往是通过第一条途径产生的,而人为创造多 倍体 则是以第二条途径实现沈显生,。下面具体介绍多倍体的各种产生方式。 .未减数配子 在正常情况下,体细胞经减数分裂形成单倍体配子,两个配子结合就恢复了 体细胞染色体数。但在自然界中,由于某种原因使得减数分裂受阻或减数分裂行 为异常,产生‘不减数配子’,形成的配子与体细胞有相同的染色体数,也被称 为“配子”傅润明,,配子与正常配子或配子相结合就形成多倍 体。这是植物长期进化过程中,生物体在外部环境条件和生物体内环境共同作用 下的结果。配子在植物多倍体形成中起着重要的作用。根据等 不完全统计,在个属的植物中发现过配子,并得出有性多倍体是自然多倍 体形成的主要途径的结论。 .合子染色体数目加倍 理论上,生物体的所有细胞均来自于受精卵,在遗传上具有相同的潜能。但 事实上,在完整的植物体中体细胞的变异却经常发生许智宏,,常见的变 异有染色体数目加倍,体细胞染色体数目加倍是由于有丝分裂异常造成,如在细 胞分裂过程中,外界条件改变使得纺缍体不能形成,染色体不能被拉向两极而停 留在一个细胞内,产生多倍体细胞裴新树,。此多倍体细胞一旦成为新的 生长点,特别是在受伤或瘤处,就成为新多倍体植株的重要源泉,, 另外,体细胞加倍在合子及幼胚中受到外界不适环境如高温刺激时也会产 生。 .人工诱导多倍体 ..物理方法 高温,低温、离心、超声波、射线照射等都可以诱导多倍体产生。用高温处 理玉米 厶正在发育的胚,得到同源四倍体植株,频率为?%。将 枸杞未受粉的子房置于低温下后培养,得到了 株四倍体植株,株非整倍体植株秦金山等,。将桃 、 李 在减数分裂前期进行?、小时热激处理,获得 了%左右的花粉,比对照%高出了倍张新忠等,.在中粒种咖 啡花粉母细胞减数分裂时期,应用骤变低温一?直接处理区器官,可获得 大量二倍性花粉粒余风英等,,此外,变温处理、反昼夜生长、干早处 理等均有诱导产生配子的报道。 ..切伤、摘心或嫁接法 植物组织被切伤或嫁接后,往往在切口处产生愈伤组织,某些愈伤组织细胞 的染色体能自然加倍,因此在愈合处发生的不定芽因染色体加倍而发育成多 倍体 枝条,。例如番茄 用切伤的方法诱导 多倍体的频率就高达%:而二倍体变四倍体的成功率高达%。用反复摘心法 和切伤作用一样,也可以产生多倍体。在茄科植物中常见,如把茄属植物的梢端 切断,再除去长出的侧芽,从切断部长出的不定芽发育成的枝条,有%为四倍 体,。用种间或属间植物进行嫁接,有接口愈合的地方常常产 生多倍体,例如用番茄 嫁接马铃薯 ,往往会产生多倍体植株。 ..化学方法诱导多倍体 化学方法诱导多倍体是目自『广泛应用的最有效的方法。操作简便、诱导作用 专一、诱变谱广,是一种迅速发展的作物育种方法。据报道,用化学诱变剂处理 作物种予、幼苗和无性繁殖器官都获得了多倍体植物。常用的化学诱变剂有秋水 仙素等,近来,还发现几种除草剂、和也具有使 染色体加倍的功能等,。秋水仙素的作用在于抑制细胞分裂时 纺锤体形成,使两个姊妹染色单体不能向两极移动而留在一个细胞里,这样细胞 的染色体就加倍了,而同时对染色体的结构无显著的影响,秋水仙素加倍对任何 作物均能运用沈得绪,,秋水仙素的出现,开创了一个人工诱变多倍体的 新时代。 秋水仙素是对正在分裂的细胞产生作用,常常选用萌动或萌发的种子、幼苗, 正在生长的嫩梢、芽,以及处于减数分裂的花蕾为处理材料,用一定浓度的秋水 仙素或乳剂对材料进行浸渍、涂抹、滴液、注射等方法处理诱导。此方法在国内 已广泛应用,多种植物均有成功事例周广芳,。应用%浓度的秋水仙素 滴液法直接处理咖啡 花蕾获得了..%的二倍性花 粉余凤英等,。在桑树 .初蕾期,用秋水仙素诱导性配子二倍 化后,得到了三倍体苗木,发生率为.%苏超等,,但研究发现活体 条件下诱导染色体加倍,受环境干扰大,易产生嵌合体,并常常发生回复突变。 随着组织培养技术的发展,很多物种可以通过组织培养再生植物,使秋水仙 素在离体条件下诱导单个细胞染色体加倍成为可能。即以单个细胞或少数细胞为 诱变材料,再由诱导加倍的细胞分化成植株。离体组织细胞染色体加倍方法容易 控制试验条件和重复试验结果,提高了工作效率,减少或避免了常规处理产生嵌 合体的干扰,获得同质的多倍体周广芳,。离体材料一般是愈伤组织、胚 状体、茎尖组织雷家军等,,也有用叶片裴新树,、子房 等,、原生质体等,和茎段韩礼星等,等材料的报道。 此方法在苹果 张 石荫平等,、葡萄 淑爱等,、草莓雷家军等,以及柑橘产李 传生等,等果树上都取得了一定进展。此外,在组织培养条件下诱变后的 植株,用试管苗进行根源染色体鉴定比在田间诱变后挖取根部逐株鉴定简便得 多,可以在短期内快速鉴定大批株系,从而筛选出多倍体。筛选出的多倍体可以 立即应用组织培养技术在短期内迅速繁殖出大量的试管苗,以进行阳问鉴定,生 产试验和示范推广,而且繁殖出来的种苗纯度高、质量好,没有病虫,这对于提 商植物的产量和质量十分有利。 ..花粉检出法 花粉粒直径大小与染色体倍性之间存在着极显著的相关性,已在多种作物中 得到证实沈显生,;李敖等,。正常的二倍体植株产生未减数的花粉, 这些未减数花粉粒比已减数的正常花粉粒大,可在显微镜下挑选出来,给正常二 倍体植株授粉,得到三倍体。例如,在二倍体桃的大量花粉中挑选出个大花 粉粒,再给二倍体桃授粉,得到株同源三倍体 :。在杨树上,将花粉用的筛子过筛后,大花粉粒的纯度从?冁 提高到?以上,用大花粉得到三倍体朱之睇等,。 ..体细胞杂交法 用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞,得到大量无壁的原生质体。通过化学或 物理学方法诱导同种或异种植物原生质体相互融合,成为异核体,异核体内的与 较低核进一步融合为共核体,经再生细胞壁成为杂种细胞,杂种细胞经培养成为 愈伤组织,再诱导分化为杂种植株。通过这种方法得到多种同源或异源多倍体植 株。柑橘 种类及近缘属间体细胞,染色体计数显示是双二倍体 ,并且染色体数目稳定史永忠等,.等,,但 也有例外,哈姆林甜橙与蚝壳刺融合的植株不是四倍体,而是三倍体 等,,柑橘种间体配融合再生出.%的三倍体胚状体邓秀 新等,。 ..胚乳培养法 被子植物的胚乳是精子和两个极核融合的产物,大多数为三倍体细胞。植物 的胚乳组织细胞也具有一般植物细胞的全能性傅润明,;吕柳新,. 根据这一原理,将植物成熟或未成熟的胚乳组织的细胞分离出来,在培养基上培 养,可得到三倍体植株,。 另外,在组织培养过程中,植物体细胞染色体容易发生数目和结构变异张 冬生,。愈伤组织随着继代培养代数的增加,常出现大量多倍体及非整倍 体细胞许智宏,,例如花药培养中,单倍体变为二倍体的现象很常见,也 有三倍体植株产生的报道曹孜义,,这与培养基中的激素成份、培养条件 和培养时问的长短有很大的关系许智宏,,研究还发现不同植物种类或同 一种植物的不同组织、器官,经过离体培养后,都可能发生染色体的变异,进而 再生多倍体植株商效民,。组织培养被看作是柑橘类 多倍体诱导的一个重要途径梁国鲁,. .多倍体的遗传分析 多倍体的遗传模式受减数分裂时期同源配对程度的影响,多倍体中同源配对 从完全二倍化的双二倍体中的二体配对到同源多倍体中的多体配对都存在 ,;,,;,。然而也存在一些中 间类型的同源染色体的配对如区段异源多倍体,,这些区段 异源多倍体不适合于二体遗传模式,在一定程度上容易被认为是同源多倍体中的 多体分离模式,,。这样的情况在一些植物基因组研究中出 现过等,;等,;等,。 因而,多倍体的遗传机制和遗传模式对于物种的进化分析和群体遗传分析都 是很重要的,应该利用不同的遗传模式和参数来计算多倍体的遗传变异系数和多 倍体的群体结构、估计自交和基因漂流的程度、估计通过基因组内和基因组间相 互作用而导致的适应性变化等,:,;等, ;,。通过理论推算和模拟,可建立同源四倍体群体结构参数 等,;等,。由于异源多倍体的细胞学行为和双二倍 体相似,因而可以参照二倍体物种的相关遗传参数进行分析如,和 ,。应该注意的是,因为分子标记不够丰富,多倍体的遗传模式 甚至于其遗传特征在一些情况下不能被检测到等,,另外,物种 多倍化后也可能经历了一系列的遗传调控,如通过突变或序列多样性进化而 导致 的基因沉默、表观遗传、转坐激活等等,;等,;等, 。大多数这些非孟德尔遗传现象都影响了编码区,一些非编码区如微卫星 重复序列也可能受到影响等,. 多倍体物种起源时,对重复位点分离模式分析常常采用杂交并对后代分离情 况进行调查的方式进行,;,;,,; ,;等,。对于大多数栽培种,这样的方式是可行的 等,,但由于野生种中人工杂交的困难,这种方式就难以应用了等,;等,。另一 方面,当起源的二倍体祖先种已经不存在时 等,,从二倍体亲本来获得遗传信息也不太现实,;, 。在异构酶位点的亲本一后代的遗传分析基础之上,遥过贝叶斯规则对非栽 培的四倍体种的遗传模式进行了分析,,等检测了 分子标记在野生的四倍体和五倍体玫瑰杂交后代中的遗传。最近等 通过贝叶斯规则在不分析杂交后代的情况下区分了两个禾本科多倍体种的 不同 遗传方式。 多倍体进化中遗传与表观遗传的变异 被子植物多倍体进化是一种普遍的现象,的物种特别是禾本科都与多倍 化相关,,;,;,;等,. 全基因组测序表明:在拟南芥等,;,和水稻 ,,中含有大量的染色体重复基因区段,表明多倍化是拟南 芥和水稻的进化动力。虽然认为大多数多倍体是异源多倍体杂种起源的 ,, ,,但也有很多研究表明在高等植物进化 中有同源多倍体出现,,,;等,。下面 是多倍化与棉花中进化关系的示意图 ?由簟曩确. .‘垦蛐 瓣之??溉专冉妻戳 叩\。嚣堋夕;%嚣’爱勰 注:多倍体大约在万年前与基因组杂交时出现,多倍体出现后就逐渐分 化为现有的个种。 近年来,多倍体基因组进化与表达研究已经成为多倍体研究的前沿 等,:等,;,;等,。这方面大 量的工作集中于异源多倍体如拟南芥等,:等,、芸苔 等,:等,;等,,以及作物中的小麦 等,;等,;等,;等,和棉花等,;等,;等,,同源多倍体特别是水稻多倍体基因 组的表达与进化研究较为少见。这些研究中较重大的发现主要是多倍化过程 中存 在迅速的基因组重排事件等,;等,;等,,, 基因丢失事件等,;等,;等,,或基 因沉默事件部分是因为表观遗传如甲基化等,;等,; 等,。 .异源多倍体中遗传与表观遗传变异 要成为一个正常的异源多倍体,两个功能基因组必须在一个细胞中起作用。 正常生长发育两个不同基因组的遗传稳定性与恰当的转录时间与转录水平。 达到这种稳定性的方法之一是通过表观遗传变化改变染色质结构从而改变整个 基因组的表达,例如:超甲基化的基因一般转录水平会下降。一般异源多倍体中 的甲基化水平不论在重复序列或单拷贝序列上都不同于二倍体亲本如等, ;等,;等,;等,,;而遗传 变化如序列消除也可能影响着基因组的稳定性如等,。遗传变化 或表观遗传变化是否是随机发生的还有争论,在一小部分利用不同亲本新合成的 面包小麦多倍体中,不同个体中许多相同的序列都被迅速的消除了等,; 等,;等,,这些非随机的变化暗示着这些序列是有目标 性的被特异的消除了。然而其它的一些不同亲本或多倍体基因组的研究中确有较 大出入,变化可能只出现在两种物种杂交的某个杂种中,也可能出现在两种物种 杂交产生的多倍体中,但在另一次同样的杂交中又不能重复这样的结果。等 认为这些情况表明基因组上的变异是随机发生的,并且这些变化可产生新 的可遗传的变异。在芸苔多倍体中也发现通过同一杂交形成的多倍体株系间 存在 可遗传的表型差异如开花期等,,,;等,, 以及一些分子层次上的变异等,。最近,在对个新合成的芸苔多倍 体的研究中发现很少量的序列和较高频率的甲基化变异迅速的发生在多 倍体代,并且甲基化发生的频率与甲基化发生的位点密切相关等, 。在异源多倍体形成与进化的研究中,都表明同一起源的异源多倍体在形 成后会出现功能分化,进而物种分化,然而有趣的是,最近一种灰树蛙 被认为是三种四倍体祖先种问相互杂交而形成的一个物种,。 ..新合成的异源多倍体中基因组的迅速与动态性遗传变异 认为:“染色体组的多倍化对于基因水平的进化进程几乎 没有作用,甚至于减缓了基因进化”,然而分子方面的证据却显示,作为对基因 组问互作而引发“基因组恐慌”的反应,多倍化对基因组变异和基因表达变化普 遍存在着动态性的作用,。利用分析,等首先报 道了人工合成的芸苔异源四倍体中基因组范围内的基因重组等,, 并检测到了基因组片段的非加性遗传,变化类型包括父母本片段的缺失和父母本 没有的新片段的出现。小麦中基因组或染色体特殊序列在新形成的异源多倍体中 被高频率的消除了等,;等,,在对 杂.种.的分析表明:来自于一个亲本的多达%的序列 在新合成的多倍体中被消除了等,,类似的现象在新合成的普通 小麦一黑麦多倍体中也观察到,%的普通小麦编码序列在代后依然存在, 但只有.%的黑麦序列在?代后还存在等,,。芸苔异源四倍 体中这些变化似乎大部分由同源染色体问的相互易位或非对等交换引起 等,;等,。有意思的是,这些结构上的变化需要在。到沭才 能检测到,同源基因组似乎在多倍体形成早期是静止的没有或很少变化,而 在接下来的世代中,大范围内基因组重排引起了低结实率等,和 开花期的变化如等,,类似的花期变异在芸苔自然进化中被选择 并保留了下来等,。 不同于芸苔异源多倍体,小麦异源多倍体在。形成后基因组的%迅速的 发生变化主要是物种特异染色体组序列的消除,而在接下来的三代。却 很少再见到同源基因组的变化等,;等,。等 提出异源多倍体在形成后就立即进入了一个“革命时期”迅速的遗传或 表观遗传变化,之后的世代就进入了“进化时期”缓慢的序列变异和 重排等,。与小麦和芸苔形成鲜明对照的是人工合成的棉花异源 多倍体在基因组序列上只有很少的变化。等发现几乎所有检测的, 个片断都符合加性遗传。分子聚类分析也表明异源多倍体棉花中的同源 位点以相对相同的速率进化着等,.同样,大米草多倍体基因组也以很低的频 率进化着等,。这些资料表明与芸苔和小麦不同, 棉花与大米革的基因组对种间杂交后的染色体加倍具有较高的耐受力,因而 它们 也代表了多倍体一种分枝进化方向,;等,。拟南芥异 源多倍体中观察到的基因组与染色体变化介于人工多倍体棉花与小麦之间,检测 到的基因组变化频率相对较低约%等,,等,. 然而不正常的减数分裂可以高达%,这些不正常的减数分裂与人工异源拟南芥 多倍体的花粉败育和低结实率相关等,,也与一些基因组特殊 区域如位点的迅速基因组重排相关等,,所观察到的不同异 源多倍体中基因组不同的变化水平也可能是自然生存选择的结果,那些能克服减 数分裂异常与生殖障碍的个体更能生存下来。 染色体间交换可能由控制同源配对的一些位点所调控,如小麦中的 等,和芸苔中等,,或者重组修复通 路也可能被激活来纠正那些在同源或异源多倍体中可能出现的大量非同源染色 体配对,在人工异源多倍体拟南芥中可能是/家族的同源体, 其参与了修复与转录调控等,。在人工同源或异源 拟南芥四倍体中被激活了,然而在二倍体和自然异源四倍体月.中却变 化很少等,,表明重组与修复在多倍体形成早期在维持基因组稳 定上起作用。 ..异源多倍体中转座子激活与甲基化的表观遗传变异 大约%的人类基因组与%的植物基因组为转座子成份等, 。虽然他们在各自基因组中大都处于静止状态,然而它们可能被激活来应 对逆境胁迫等,或“基因组冲击” ;,处于 不同进化状态的基因组的结合类似于“基因组冲击”,其会激活异源多倍体 中静 止的转座子,。事实上,包括转座子和逆转座子在内的转座成 分在拟南芥和小麦异源多倍体中确实被激活了等,,等, :等,。小麦中 逆转座子的激活导致了对相邻基因 的“过读”,从而产生下义或反义的转录产物等,. 利用的转座子显示技术, 等发现大于%的含有 ?新逆转座子产物在双二倍体与异源多倍体同义出现,而在两个亲本中都 没有出现; 或者在双二倍体中不出现,而至少在两个亲本之一中出现,而且, 相邻基因或者被过量的“过读”的正义产物所激活,或者被负调控的反义产 物通 过干扰的方式沉默了,这些资料表明转座子的激活可以对异源多倍体中相邻 基因产生顺式或反式调节转录等,. 利用基因芯片分析技术,等发现在拟南芥人工异源多 倍体中,类似于的逆转座子和两个属于家族的类似于/的转座 子被激活了等,。另外,转座子在同源多倍体正 冲与人工异源多倍体中存在不同的表达模式。的激活与转座子编码序 列中和去甲基化相关,在同源四倍体亲本中被甲基化,而在异源四倍体 中去甲基化并且激活,这说明异源多倍化过程引起了基因组结构和染色体构 型的 混乱从而引起了转座子等,和蛋白基因等,, 等,的沉默或激活。可以想象,在新形成的大米草等,多 倍体和人工拟南芥等,异源多倍体中所检测到的甲基化与基因 表达变化和表型变异相关。值得注意的是,新合成的拟南芥异源多倍体对甲 基化抑制剂比其亲本更为敏感等,,表明或许因为异源 多倍体形成中的结构重建活动,甲基化与其它的染色质修饰在异源多倍体中 被激活了。 推测多倍体进化过程中甲基化引发的转座子沉默是对基因组重排的一种 防御机制等,,小麦大量的种特异性序列的删除等, :等,和芸苔中大量的同源染色体的交换等, 等,可能都是转座事件的一种暗示。然而现有的小麦双二倍体资料 面 并不支持转座假设等,,在六倍体小麦 及其二倍体和四倍体近缘种和 中,控制籽粒硬度 等,和叶锈抗性等,的特异 位点的序列重排可能由同源序列间异常结合引起。因而,有或没有转座子参 与的 同源染色体间的重组可能是我们观察到的异源多倍体同源染色体间交换的 一般 机制。 .自然异源多倍体与人工异源多倍体进化差异 以上研究大部分都集中于人工异源多倍体的研究,仅少数几个例子中对自然 形成的多倍体进行了研究,如大豆多倍体等,和婆罗门 和岔 参杂种等,。在 异源多倍体的进化与表达研究中,等等,发现大多数异 源多倍体在它们的基因组中只有一个亲本的重复类型。对于两个亲本的拷贝都保 留的情况中,大多数都倾向于一个亲本表达。在人工合成的多倍体与一些二倍体 杂种中,没有显示出的偏亲表达,这表明多倍化与杂交都不会立即导致大豆 中的核仁显性等,。在婆罗门参中,近来的一些研究表明在 ×和 杂种问存在不同的甲基化模式等, ,虽然对于这些自然形成的多倍体如大豆和婆罗门参的研究提供了一些对 生化有重要作用的信息,然而这些研究没有能够回答在多倍体群体内部各个体间 有无相类似或不同基因组进化和表达的模式。最近,在对新形成仅年形成历 史的婆罗门参自然多倍体进行研究中发现:个体间在进化和重复位点的表达上 是不一致的,存在偏亲表达,中所显示出来的多态性大多来自亲本片 断的消失等,。 .同源多倍体基因表达与进化 多倍体由于有同源多倍体与异源多倍体之分,对于同源多倍化特别是自然同 源多倍化后基因表达的变化研究较少。在酵母等,中,通过芯片 研究发现,仅个基因表达受倍性的调节,其中个受倍陛的诱导,个受倍性 的抑制。在拟南芥同源多倍体中,基因表达与倍体的倍性相关的基因也只有 个,表明在这两种物种中,受倍性调节的基因只是一小部分。同源多倍体诱导 基因表达变化是通过基因组剂量效应来完成,,在同源多倍化过 程中,剂量补偿效应,是除细胞大小,外的其它 基因表达调控的机制。玉米中通过倍体叶片中的个基因的分析表明:大部 分检测基因的转录水平随基因的剂量增加而增加,但也有少数例外,并且仅 重复 染色体的一个臂或一段而不是整个染色体组重复对基因表达的影响更大等, 。另一个利用异源三倍体玉米的研究也表明基因的表达水平依赖于染色体 或染色体组的剂量效应等,。 对于自然束源的同源多倍化后的当代的研究未见报道。 多倍体中重复位点在进化中的命运及其功能分化 一般认为:多倍体中基因的重复是新功能基因出现的基础原料等, ;,;等,,重复基因之一可能突变从而获得独 特的功能等,;?等,。当异源多倍体中基 因组都重复的时候,同源基因的进化可能存在多种命运,理论上有三种可能: 重复拷贝序列和功能都保留下来:一个拷贝功能保留,而另~个拷贝的功能 消失或沉默了;两个拷贝的功能出现了分化,:和, ;等,。预测自然群体中重复基因比单基因具有更高的多态性 这一预测被的理论支持,并且随着重复基因的功能多样化分化, 重复基因间功能相互补偿的作用越来越弱,,然而等 研究表明,一些复杂蛋白质的关键功能的重复基因多样化相当缓慢,它们似乎形 成了一个功能缓冲体系,在诸如多倍化等基因组混乱的情况下起着重要的作用, 从而对一些连锁群中基因组的周期性重复进化有益。最近,, 的研究表明,在十字花科和百花菜科基因组中同源基因间拷贝数具有相当大的相 关性,这暗示着类似的进化机制影响了这两个独立进化连锁群中基因的拷贝数. 基因的重复在进化过程中可能被模糊化了。 多倍化后产生的重复区段常按同一方向排列,这支持了和其它人提出 的假说:基因组内重复区段是全基因组重复而留下的痕迹,而不是个别区段零星 的重复结果等,;等,,虽然全基因组重复是产生新基 因的有效机制,然而所有基因的突然加倍会造成多倍体生理过程困难,通过人工 多倍体研究表明:全基因组的重复会在遗传稳定性、基因调控和发育上引发问题 等,;等,;等,;等,;等, ;等,,多倍化会诱发遗传恐慌和表观遗传事件发生,包括 消除和基因沉默等,:等,;等,; 等,;等,。异源多倍体中不同染色体组的结合不仅增加 了重复基因的功能分化等,;等,,也产生了异质结合和 新的相互作用,从而产生了新遗传和表型变异。多倍体有巨型化现象,在酵母中 认为是因为.期延长等,,而在黑麦中厶和 .坤,并没有发现同源四倍体与相应二倍体比较细胞周期有延长的情 况,更大的叶片和叶片细胞是由同源四倍体中更快的细胞伸长速度造成 ,。 异源多倍体中结构与表达变化调节机制 在异源多倍体研究中获得的越来越多的基因表达与基因组资料全面引发了 对异源多倍体中新基因变异与表达多样性可能原因的思考等,; 等,;,;,。这些观点广泛从多倍体基因组进化、 遗传和表观遗传、生理反应和性状变化等角度进行了深入的探讨。在合成的异源 多倍体与其祖先种之间所观察到的表达变化包括基因抑制基因沉默是其极端类 型、遗传显性、亚功能化和新基因的出现。一些表达变化是因为序列变异 如序列消除、染色体问交换和重排,而另一些则可能是转录或转录后调控。二倍 体中染色质修饰与同源基因的调控也可以应用到异源多倍体同源基因表达调控 中来。然而,关键的问题是:在同时存在两个特种异源多倍体细胞中,表达变化 中同源基因是如何识别和区分的。表达模式一旦建立就可以通过染色体修饰如甲 基化固定下来等,。阻止甲基化的化学抑制剂等, 和对甲基化转移酶的负向调节等,可以使沉默基因重新激活。 异源多倍体为研究进化中由遗传或表观遗传引起的基因组分化、同源基因及 其产物的分化、以及调控网络的分化等生物功能通路重建机制提供了一个独特的 研究系统。可以想象在不同时日,利用不同品牌的汽车部件柬组装一个具有新功 能的机器是多么复杂。解开异源多倍体调控网络分化之谜即使不比这更复杂也与 其差不多。多倍体中所观察到的变异可能由遗传机制与序列相关、表观 遗传机制与序列无关或二者共同引起。遗传变异包括易位和转座、序列消除 和插入、非同源染色体配对与非加性调节,而表观遗传现象则包括了非加性基因 调节、转座子激活、同源基因的沉默与亚功能化。在多倍体中观察到的动态变异 的遗传与表观遗传机制之间存在内在的杂乱的联系。近十年束所获得的遗传与基 因表达资料为解决从 .不始很多研究者关于多倍体 进化与机制的疑问提供了新的见解。例如,选择机制是什么如哪个祖先的哪个 基因被选择性的转录和或转录后调控为什么异源多倍体中某些基因改变 了,而另一些重复基因则成了多余的,可有可无的哪部分基因表达变化与表观 遗传和或基因组重排有关染色质结构的变异或路径的变异只是影响单 个的位点还是许多基因的位点还是整个网络通路都受到了影响同源基因在发 育调控与组织特异性表达中扮演了什么角色基因表达的分化影响了重复基因 在进化上的命运吗核与细胞质的不相容性影响了基因表达的变化吗异源多 倍体中如何克服自交不亲和性与自然衰退节段多倍体与多倍体在基因表达上 有类似的效应吗异源多倍体是如何调整细胞周期、有丝分裂、染色体配对、减 数分裂、细胞生长与器官发育的最后,为什么多倍体在进化上如此成功 .异源多倍体中转录组表达重额程序化 ,和,在最初 通过一种核仁显性的现象暗示:种间杂种存在双亲基因表达调控的改变,在种问 杂种或异源多倍体中,核仁显性导致了双亲之一的位点选择性沉默 ,。和他的同事提出了“增强子一不平衡”模式 等,:活跃的具有更多更强增强子的基因比不活跃的具有更少更弱增 强子的基因对于有限的转录因子更具有竞争力。与此相一致的是,六倍体小 麦中显性基因问比隐性基因间具有更大空间推测为增强子,。 然而在拟南芥和芸苔异源多倍体中,不同基因的表达与增强子或种特异性转 录因子的有无并没有关系等,。体外短暂的转录分析表明拟南芥和 芸苔的启动子可以与另一个种的聚合酶转录体系起作用等, 。拟南芥和芸苔异源多倍体中沉默的基因可以被甲基化或组氨酸 去乙酰化的化学抑制剂所激活,表明基因是通过推测与使染色质不活跃相关 的甲基化或组氨酸去乙酰化所沉默的等,。总的来说,资料表明 基因沉默作用于染色体的特定位点并进一步导致了其它基因的协同沉默 ,。 编码同源蛋白的基因在种间杂种或异源多倍体中是如何调控的呢为了回 答这一问题,几个研究组采用显示技术在拟南芥人工异源多倍体和自 然多倍体见等,,等,、棉花等, 和小麦等,;等,人工异源多倍体中揭示了新的基因表达 模式。通过同源四倍体 铂自然异交的四倍体爿.:之.问杂交 获得人工异源四倍体拟南芥等,;等,,丘是通 过 与.祖先种在大约万年年前自然杂交而成等,。最初对表达变化的调查表明: 丘中大约.%的基因表达不 同于爿.和.中的基因表达等,。人工合成的异源四 倍体拟南芥等,比五姜有更多的差异表达基因,大约% 的片段存在变化,这些变化的可能与基因抑制、基因激活和基因功能分工相 关。这些片段中,大约%来自于亲本爿.、%来自于亲本月.、% 来处于双亲、%与两个亲本无关新的表达模式等,。在另外三个 不同的异源四倍体中也存在类似的变化水平,表明在异源多倍体进化过程中,基 因经历着类似的调控机制。 表达的变化可能在异源多倍体形成后立即出现,也可能在以后的自然世代中 随机出现等,,等,。对于一些包括在内的基因,只需 要卜代就可以建立不同的表达模式沉默或激活;而对另一些基因,需要两 代以上,有时五代来建立表达模式。虽然表达可能是随机建立的,但与自然多倍 体月.伽?相比,在自交过程中对特定位点也有倾向于沉默或表达的趋势 等,。而且某些基因的表达在同一家族不同个体间高度可变,这对于一个 成功多倍体群体的形成与适应性都是有利的。 如果基因的沉默与激活是在自交后代中形成的,那么这种表达状态能否在不 同的发育时期维持呢现有资料表明作为对发育程序变化的一种功能分化上的 反应,重复基因或同饵基因可能会在不同器官或组织中改变它们的表达模式。异 源多倍体中沉默的基因在花器官中被再次傲活了,这暗示了激活和沉默的基 因如何在发育中扮演角色等,,这也对小孢子花粉中基因 的沉默是因为减数分裂时抑制基因分离的观念提出异议,。 棉花中即使不是大部分也有相当多不平衡表达的基因表现出了器官特异性表达 模式等,。有意思的是,一些同源位点中的一个位点如 在一个器官中沉默,而另一个位点却在另一个器官中沉默。沉默模式与基因型无 关而且在人工和自然多倍体棉花中都存在等,,暗示了进化中重 复基因的迅速功能分工与稳定遗传。异源多倍体形成后同源基因迅速的发育调控 让我们想起了进化时问表中重复基因功能分化的理论预测等,。 异源多倍体中同源基因表达迅速的多样性分化成为了遗传变异和表型多样性的 永不枯竭的蓄水池,从而有利于多倍体的进化与自然选择。 最近,等运用斑点基因芯片技术研究了拟南芥人工异源多倍体与其双亲 间转录子的差异等,。在后代中,这两个祖先种中 超过的转录子被差异性的表达了,其中%和%的基因分别在 和见 高表达,这可能代表了自从这些祖先种分化后万年间“种特异性”的 调控变化的结果等,。在拟南芥人工异源多倍体中,超过%的基因 表达偏离了中亲值显示了非加性基因调控,从而导致了不同于亲本的基因激活、 抑制和新表达模式。异源多倍体中大约%的非加性表达的基因是。种特异性” 基因,如此明显多的比例显示了:异源多倍体在形成中转录分化需要全面的进行。 另外,异源多倍体中绝大多数非加性表达的基因处于被抑制状态,异源多倍体中 超过%被抑制的基因是丘种特异性的,这也与核仁显性, 以及人工和自然多倍体中彳.表达的全面抑制等, 相一致。而且差异表达基因在功能上归入了包括新陈代谢、能量、细胞 防御、信号传导、衰老和植物激素调节在内的很多生物通路 上。值得注意的是,在和芯片分析中,几乎没有发现编码转 座予的基因等,,等,,表明种间杂交并不能够诱导基因 组范围内的转座子激活,或者也可能转座子在以后的自交世代。中被固定了 下来。 有意思的是和相关的基因表达变化为表型进化提供了一种缓冲能 力等,,乙烯的生物合成也发生了变化,乙烯表达的变化可能 会诱导对乙烯反应基因的表达变化,对乙烯反应的基因包括了发育与适应性 相关 的很大范围,如种子发芽、花叶的衰老、果实的成熟、细胞程序化死亡以及 生物 与非生物胁迫抗性等等,。包括乙烯在内的激素调节基因在人工异 源四倍体中协调表达显示了整个基因组范围内调控机制的重新构建。 在另一研究中,等发现开花相关基因在异源六倍体 与其双亲 :倍体和 四倍体, 以及其中问三倍体杂种 艺问表达发生了巨大的变化。因而种问 杂种和异源多倍体中基因调节网络的全面重新“编程”是对物种间不同转录 组的 调整结果,而不是对简单的基因组加倍调整的结果。虽然通过比较杂种。杂交 与异源多倍体基因组加倍之间的基因表达差异束区分杂交与基因组加倍的效应,然而秋水仙素的效应容易混淆。基因组加倍效应。非加性效应基因调节似乎 不仅仅是百万年前祖先种的转录组间分化的调节方式,也是玉米非整倍体 等,、四倍体藜等,以及同一物种问杂种 等,基因表达交化的调节方式。等在许多二倍体与三倍体 玉米的等位位点间发现了基因的非加性表达。二倍体杂种的转录水平与二倍体的 自交程度呈负相关,三倍体杂种也是呈非加性表达且受基因组剂量效应的影响. 现有资料表明:种内、种间和自交系间杂种的表达变异都超过了其起源亲本 等,。我们预计异源多倍体和自交系间杂种的基因表达都与杂 种优势相关,也与遗传距离上相互独立或亲本闻序列分化水平不同的等位基因或 等位位点间的基因组互作相关等,,这些发现有助于理解杂种优势 等,,也有助于理解异源多倍体在进化上为什么如此成功 等,。事实上,异源多倍体为我们提供了一种永久固定种间杂种 .,; .,。 优势的方式等,; .异源多倍体中的转录调控 进化中控制基因表达调节网络的选择性修饰被认为是对小生态环境“殖民” 的原因,也暗示着发育程序和环境改变。外部作用与内部基因表达网络的重新“编 程”共同作用决定了种的特异性。和聚合酶其分类是按其含有的种特 异因子进行的共同进化就是一个很好例子等,:除非加入人特有 的因子,人的基因是不能被鼠的聚合酶提取物所转录的。与此一致 的是,增强子不平衡理论,认为在蟾种间杂种中,强增强子的显 性簇结合了转录因子而使具有弱增强子的簇不能接近转录激活因子,因 而不能被转录。虽然植物中体内外的短暂转录实验并不支持这一理论等, ,然而种特异性转录因子的参与也不应该被忽视,这些因子可能是转录调 控通路中的上游调控因子。如果调控因子与下游的基因都相容,下游基因可以通 过在顺式元件上的反式调节等,而被激活。这种情况下,转录 因子问数量优势与对相应启动子结合位点的竞争将决定同源基因的表达水平 ,。但是,如果仅一种转录因子存在且与下游基因之一不相容, 那么就只有一个同源基因通过顺式或反式作用而被激活。如果两种因子都不存在 或都对下游基因起抑制作用,则转录位点都可能被沉默。转录激活子或抑制子的效应或基因的沉默与激活可能会通过形成特异位点的染色质异构复合物来调节 ,。因为两个不同基因组的结合可能会引发染色质结构的混乱, 所以异源多倍体中染色质也可能重新形成新构象。可以利用能克服遗传冗余的上 游调控予突变体或染色质组蛋白的显性失活突变体来对这一模式进行具体研究 等,。事实上,利用彳.的系等,或阻止 甲基化等,,一些沉默的基因被徼活了,这一过程与特异位点启 动子的去甲基化有关。这一模式也显示:一些关键的调节子如转录因子和包括 甲基化修饰和组蛋白去乙酰化修饰在内的染色质异构复合物因子可能控制着调 控网络中很多下游基因的表达慨等,。转录因子也是果蝇杂 交致死的原因之一等,; 等,.在果蝇祖先进化的 万年问, 桐%的转录组分化了。这些基 因中大部分与性别偏态表达模式的建立有关等,;等,, 除非利用杂种突变体拯救技术,性别偏态表达将导致种间杂种杂交雄性致死或杂 种不育等,,杂交致死可能被与其祖先无关的染色质异构、转 录因子如顺式调节而被克服,。通过同样的方式,一些转录 因子和染色质异构复合物可以在拟南芥异源多倍体的整个基因组范围内对基因 进行非加性调节或种特异性抑制等,。 .异源多倍体中洲介导的基因调节 干扰是