【doc】 Janus激酶-信号转导及转录活化因子通路对内毒素／脂多糖体外诱导大鼠腹腔巨噬细胞高迁移率族蛋白B1合成释放的调节作用

【doc】 Janus激酶-信号转导及转录活化因子通路对内毒素／脂多糖体外诱导大鼠腹腔巨噬细胞高迁移率族蛋白B1合成释放的调节作用 Janus激酶-信号转导及转录活化因子通路对内毒素,脂多糖体外诱导大鼠腹腔巨噬细胞高迁移率族蛋白B1合成释放的调节作 用 414?中华烧伤杂志2005年月筮2鲞筮塑里!!竺!竺!!::!: - 烧伤后炎症反应- Janus激酶.信号转导及转录活化因子通路对 内毒素/脂多糖体外诱导大鼠腹腔巨噬细胞 高迁移率族蛋白B1合成释放的调节作用 刘辉姚咏明董月青于燕盛志勇 【摘要】目的探讨Janus激酶(JAK)一信号转导及转录活化因子(STAT)通路对内毒素/脂多糖 (LPS)诱导大鼠腹腔巨噬细胞高迁移率族蛋白Bl(HMGB1)合成释放的调节作用.方法取正常 Wistar大鼠腹腔巨噬细胞.培养3d后用LPS刺激,分别于刺激前及刺激l0,30,60,120min时观察 JAK2,STAT1以及STAT3的活化情况,每时相点重复测定4次,以积分吸光度(IA)值表示;另取细胞 分为正常组,LPS刺激组,JAK2抑制组,STAT1抑制组,STAT3抑制组, 培养3d后用LPS刺激后4组 细胞,刺激前2h,后3组分别加入AG490,氟达拉滨及雷帕霉素,观察各组HMGB1基因表达及蛋白释 放情况,每组重复测定4次.结果LPS可诱导大鼠腹腔巨噬细胞JAK2,STAT1及STAT3在短时 间(120min)内活化,其中STAT3活化最为迅速,l0rain即可达到峰值(7.47.4-0.56).JAK2抑制组, STAT1抑制组,STAT3抑制组HMGB1基因表达均明显受抑制,其表达量均明显低于LPS刺激组(P< 0.01),其中JAK2抑制组明显高于正常组(P<0.01),其余两个抑制组则与正常组相近(P> 0.05);但3个抑制组HMGB1蛋白表达量与LPS刺激组基本相同,均明显高于正常组(P<0.01). 结论JAK—STAT通路可在LPS刺激下早期活化,部分参与了诱导HMGBl合成的信号调控过程. 【关键词】脂多糖类;高迁移率族蛋白类;巨噬细胞;Janus激酶一信号转导及转录活化因 子通路 TheroleofJanuskinase—signaltransducerandtranscriptionactivatorpathw ayintheregulationofsynthesis andreleaseoflipopolysaccharide—inducedhighmobilitygroupbox 一,proteinLIUHui.YA0Yong—ming. DONGYue—qing.YUYah.SHENGZhi-yongFundermentalDepartmentofBurnInstitute.304thHospital Af氍1iatedtoPLAGeneralHospi~1.Beijingiooo37.P.R.China Correspondingauthor:YAOYong—ming.Email:cff@sina.com.Tei:010— 66867398 【Abstract】 ObjectiveToinvestigatetheroleofJanuskinase—signaltransducerandtranscri ptionacti— vator(JAK—STAT)pathwayintheregulationofsynthesisandreleaseoflipopolysaccharide—inducedhigh mobilitygroupbox—lprotein(HMGB1).MethodsPeritonealmacrophagesharvestedfrommaleWistar ratswereincubatedfor3daysbeforetheexperiment.TheactivationofJanuskinase.2(JAK2),signaltrans— ducerandactivatoroftranscription—l(STAT1)andSTAT3wasobservedbef oreandl0.30.60andl20 minsafterLPSstimulation(4determinationsateachtimepoint)anditwasexpressedasAvalue(absorp. tion).Inaddition,thecellsweredivide(1intonormalcontro1.LPSstimulation.JAK2inhibition(with AG490treatment2hoursbeforeLPSstimulation),STATlinhibition(withfludarabinetreatment2hoursbe— foreLPSstimulation)andSTAT3inhibition(withrapamycintreatment2hoursbeforeLPSstimulation) groups.ThecellsinallgroupsexceptcontrolgroupwerestimulatedwithLPS3daysafterculture.Theex— pressionofHMGBlgeReanditsproteinreleaseineachgroupweredeterminedfor4timesandwereex— pressedasAvalue.ResultsLPScouldactivateJAK2.STAT1andSTAT3within2hours.especiallythe activationofSTAT3appearedmorequickly,peakingatl0minutesafterLPSstimulation(7.47?0.56) PretreatmentwiththeinhibitorsofJAK—STAFpathwaycouldmarkedlyred ucetheexpressionofHMGBlmR— NA(P<0.01),butexertednoeffectonHMGBlrelease.ConclusionJAK— STATpathwaycanbeacti— ratedearlyduringendotoxinchallenge,anditmayplayaroleintheregulationofHMGB1synthesis. 【KeywordslLipopolysaccharides;Highmobilitygroupproteins;Macrophages;Januskinase— signaltransducerandtranscriptionactivatorpathway 基金项目:国家重点基础研究发展规划资助项目(G1999054203— 2);国家杰出青年科学基金资助项目(30125020) 作者单位:100037北京,解放军总医院第一附属医院全军烧伤 研究所基础部 通信(讯)作者:姚咏明,Email:c—ff@sina.corn,电话:010— 66867398 新近研究表明,高迁移率族蛋白Bl(HMGB1) 作为一种晚期炎症介质参与了脓毒症的病理生理过 程.目前关于HMGBl的许多问题尚待阐明(如 其信号转导机制).笔者既往的研究显示,Janus激 酶(JAK)一信号转导及转录活化因子(STAT)通路可 能与HMGB1诱生相关.本实验拟采用大鼠腹 烧伤杂志2005年12H2I彗里I:llIJ-川!.-w-.c_,u 腔噬细胞体外培养模型.探时JAK—SI’AT城路 内毒素多精fLPS)诱导HM(.B1台成释破中的垌 控作崩ni机制 材料与方法 一 主爱试剂及细胞培养 I主试剂:JAK2特异jI1I制利.-%649(), STAT3磷酸化抑制制雷巾n霉素c名西莫司,美 国Calbiochem公司),ITATI特抑制剂氰迭托 滨(德同ring公司),LPSf美同Sigma公司j,免 抗磷酸化JAK2多克隆抗体f荧罔SantaCruz公ii】), r4寡核件酸澈酶(羹ltl~]eg8公r).一P腺 三磷艘(北京亚辉.物I.程公司)寡卡戋自’艟探针 (北京盟科生物技术仃限责仃i1]1:包括走鼠 STA’rI,STA1’3双链寡微苷酸探乍1序列(均为24 bp),大鼠HMGBl序列f扩增片段为68(1k,F?iI.. 大鼠}f油醛一3一磷酸脱氧酶序刊f(A).扩增片段为 309bp) 2.腹腔巨噬细胞的分离与培养:选用清沽缎雌 性Wistar太鼠8O只(北京医科大学实骗动物中 心).体照220,300g,参见文献[6]方,缚只上鼠 可得刮约2×10’个细胞.接种至底面积为75一m的 去LPS培养瓶或以1×I[r/m]接种于24L培养扳 -预先用”c0照射J371:卜体积分数5qf CO,孵辅巾培养备用 一 . 榆测指标 1.观察llAK2活化情M:细胞培养3?I后,以5x 10个细胞为1个刺激单忙.采用10(】l上g/ILPS进 行刺激.分为刺激前及刺激10,306(II20Yi-ill5 时相点,各时l相点重复测定4趺刺激完毕后提取 胞浆蛋『.参照文献[7操作,”汜学发光反脚 剂盒(美闰杜邦公司)进行榆测底片’冲洗后采j_}】 LEICAQ一5001W型罔像分析处理系统(德【 公司)世,彳分析以识分吸兜鹰IM)值表示 2观察STATIL于s11AT3化的情:细胞上卉养 3d后.以2×l0.个细胞为1个刺瀚单协.同f行刺 激处理,刺激完毕后提取胞梭蛋白.应J1:I凝胶龃滞 分析lEMSA)测定S’I’Ar】,STA13的化情 底片州?洗后处理同上.I值表示 3观察AG490j氟选托演段雷帖霉素刊 HMGBI基表达的影响:细胞培养3J后.分为II 常组(不作址理),I.PS刺激组(75,ILPS刺澈) JAK2抑制缒(75Ixg/1L啊:际幂J=}jI()0is,g/lI.PS刺 激外.分盟处j.刺激后8,I2h取各组 细胞的培养』清澉200ttl,{盒删HMGIlI浓度底 片冲洗后处罔!J司Il表 统l十学处理 数据”?表,乘I1Js?d4.0统计软件进行 -索疗葺抒衍 结果 1在1.1’刺激F.大鼠愎腔巨噬细胞.JAK2逐 渐衍化.30I]1in时其l_傅朝屉高下刺激前.60rtl[n 刮达刮峰f.J20rain上”州低f刺激前(P<0.05 或0【JI)I刺激10rain时ST刺融r}Il+?1I’1034?iiiu42I2 IA251J!『I【}544:l】Il2’q9I?II554??26 1?1!l1)2s?l1肿lq60?l_?925??135 ,nT制小n23I?l}f16I9,16?II24q34?【l23 往:坶Il啦故IxI{l”i’.龃均rE越r芝4k.I盘I 与常目【l=辆.P(IJ0I:Li,刺止鞋(IlllI 讨论 I{【;I{I大赞l岛岌,)nIl蛆盅向DNA结 合蛋Ii,广泛仔坎?胞的胞{:寰l,,埘1)A复 I,BI此.JAKSIAT通 路和?M(;BI均LjF-et,II一6,1ll_IIFN一等炎性 细胞肯密联系 本组资料显.1I可诱导九鼠嘘腔Jj噬细胞 JAK—s—IAT通路活化I.PS刺激6(Imiii时,JAK2达 到活化高峰.随后碱弱;S’I’Ar】},ri化呈持续增强趋 势.丁I20111in达到高峰:STAT3活化最为逊速,刺 融10IlliII活化即达峰值.此后逐渐撼驯,仉到l20 tt义I呼度蓠强这可能与IPs引起其他炎细胞 1q的释放.扶而冉次澈活STAT3有戈值得注意 的是,sTATIi-irr化比STAT3晚.日持续增强.提 STATI刘于Ii嗽细胞的炎症反I越的渊捧可能县有重 复意|芏r』I-fI{J资料也表明.脓蓐症大鼠体内主要 脏嚣的STTl广泛活化.圮J毒月r,肺组纵更为明 .且持续叫较长(>12h):『srI’AT3l!l勺活化较 弱.其活化高峰肝不[!fj有报道称,腹腔感染 动物Hl:组皇l【S’IAT3活化较逊谴l3Iij占高峰,随后 速F降..这可能是为肝,肺组织为脓毒症时 单核.,】女 #..忙?:m,:?I” f)fI25565 ‘?JL【lHll’l1 #J目1009l】:34一 ] (J?*E陆K r11&J:?.f: 4【 It!J{%.?‰{-,J十 2?3Iq:65-66 毒信I代”中 #fm31:6 1.m普Ij,$# #i手术? 电辅业nl输砒r-.班lm带}口J”托 鼍瑚I1牝睫LI蕊m龋t&戳椿i1 扮懈?4f】?r~lrll左fJ髓持缍川帅I~Jll上H』 !u膏仲锚世,止晰肆K箍阵常规出取虚 外川r帅他木制神单.安全I丁靠健川 n他T搏r 参考立献 l*m,IIm???”三烧忭Jl86:3 目1._-目『目3mL1_jHll… ‘空编辑:衄馘 amp;伴*m420: 』46I40 Ll~..Jk,KMrh|_Jr)’…l】?”?ll,?J…l1u【I『 【】o…uI’hH-’.n?|【-l?-dir’-_uJ.手术? 电辅业nl输砒r-.班lm带}口J”托 鼍瑚I1牝睫LI蕊m龋t&戳椿i1 扮懈?4f】?r~lrll左fJ髓持缍川帅I~Jll上H』 !u膏仲锚世,止晰肆K箍阵常规出取虚 外川r帅他木制神单.安全I丁靠健川 n他T搏r 参考立献 l*m,IIm???”三烧忭Jl86:3 目1._-目『目3mL1_jHll… ‘空编辑:衄馘