小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究-临床医学论文

小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究-临床医学论文 作者:常娟娟，江一平，王明权 【摘要】目的对性成熟前小鼠的窦前卵泡采用不同的方法进行玻璃化 冷冻，探讨不同冷冻方法对卵泡复苏率的影响。方法用?型胶原酶和 脱氧核糖核酸酶?分离10,14dICR雌鼠的卵巢，共进行A、B两个 实验，每次实验对获得的卵泡分为4组，1组作为新鲜对照组，其余 3组采用不同的冷冻方法处理,试验A采用常规玻璃化法、,205?玻 璃化法和液氮网篮法;试验B采用,205?玻璃化法、液氮网篮法和 ,205?面玻璃化法，卵泡复苏后进行台盼蓝染色，计算各组卵泡 复苏率。结果液氮网篮和,205?玻璃化冷冻的冷冻效果一致，两种 方法的卵泡复苏率差别无统计学意义;常规玻璃化的冷冻效果最差， ,205?表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好，其冷冻小鼠窦前卵泡的复 苏率达(83.02?4.10)%。结论,205?表面玻璃化是一种较好的冷冻窦 前卵泡的方法。 【关键词】卵泡;卵子;冷冻;组织保存;小鼠，近交ICR ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofdifferentmethodsontherecoveryrateofpreantralfollicleofimmaturemiceaftertheyweretreatedwithvitrificationandfreeze thawing.MethodsCollagenaseIandDNaseIwereusedtoseparatetheovariantissueoftheICRfemalemice(10, 14dofage).Twoexperiments(AandB)werecarriedout,ineachofwhichthefolliclesobtainedaftercleaningweredividedintofourgroups,oneasacontrolgroup,theotherthreegroupsgivenvitrifiablecryoprotectionwithdifferentmethods.I nExperimentA,conventionalvitrification,,205? vitrificationandmetalnetwereused,whileinExperimentB,,205? vitrification,metalnetand,205? surfacevitrificationadopted.Afterrecovery,follicleswerestainedwithtrypanblue,andtherecoveryrateswerecalculated.ResultsInthetwoexperiments， theeffectofmetalnetand,205? vitrificationareconsistent.Therewerenotsignificantdifferencesbetweenthem.Theeffectofconventionalvitrificationwastheworst.Inaddition,theeffectof,205?surfacevitrificationwasthebest,witharecoveryrateof(83.02? 4.10)%.Conclusion,205? surfacevitrificationisadesirablewaytofreezepreantralfollicles. KEYWORDS:ovarianfollicle;ovum;freezing;tissuepreservation;mice,inbredICR 卵巢组织、细胞的冷冻保存技术是生殖工程的重要内容之一，可为体 外授精、显微授精和体细胞核移植等需要储备和供应卵源的实验提供 技术保障[1]。在既往的研究中，冷冻复苏的卵母细胞和卵巢组织都 有部分能够发育到囊胚或者生育幼仔[26]，说明冷冻复苏后的卵 母细胞及或各级卵泡保持了正常的发育潜能。但采用常规程序冷冻法 和常规玻璃化冷冻法保存的卵巢组织、细胞，复苏率不高且方法繁琐 [4]。本研究采用从小鼠卵巢分离的窦前卵泡为，探索建立适宜 的窦前卵泡快速玻璃化冷冻保存技术，为卵泡保存和生殖工程提供技 术基础。 1材料与方法 1.1动物来源 出生10,14d的ICR雌鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司，SCXK(沪)2003003]。 1.2仪器及试剂 Vitmaster玻璃化快速冷冻仪(URVD000036，英国IMTLtd);ɑ MEM(32571，美国Gibco公司);牛血清白蛋白(BSA，A3311，美国Sigma公司);?型胶原酶(collagenase?，265，美国Gibco公司);1mg/mL脱氧核糖核酸酶(DNase?，10104159001，瑞士Roche公司);HEPES(H6147，美国Sigma公司);乙二醇(EG，E9129，美国Sigma公司);海藻糖[DTrehalosedihydrate，T0167，美国Sigma公司];聚乙烯吡咯烷酮(PVP，0507，美国Amresco公司);台盼蓝干粉(Trypan，T6146，美国Sigma公司);含卵泡分离液的双腔培养皿(353037，美国Falcon公司);清洗皿:含体外操作液的35mm培养平皿(353001，美国Falcon公司)。 1.3方法 1.3.1溶液配制 基础液:采用添加4mg/mL牛血清白蛋白的αMEM作为卵泡分离液、体外操作液、玻璃化冷冻液和复苏液的基础液;卵泡分离液:于基础液中添加3mg/mL?型胶原酶、1mg/mL脱氧核糖核酸酶?;体外操作液:于基础液中添加25mmol/LHEPES;平衡液 (equilibrationmedium，EM)[7]:于基础液中添加4%乙二醇;玻璃化冷冻液(solidsurfacevitrification，SSV)[7]:于基础液中添加35%乙二醇0.4mol/L海藻糖、5%聚乙烯吡咯烷酮;复苏液:包括?、?，分别为基础液中添加0.3mol/L、0.15mol/L海藻糖;台盼蓝染液(0.4%):0.4g台盼蓝干粉溶于100mL生理盐水。 1.3.2分离窦前卵泡 颈椎脱臼法处死小鼠，消毒腹部皮肤，打开腹腔，找到卵巢，取出双侧卵巢，放入PBS中清洗，转移2,4个卵巢至0.5mL的卵泡分离液中，在体式显微镜下用尖镊撕碎并用滴管吹打后，放入37?、体积分数为0.05的CO2培养箱中3min。每隔3min取出培养皿，滴管吹吸，每次吹吸后都要观察是否有卵泡掉出，如有掉出，随即转移至清洗皿的基础液中清洗2遍，操作时动作尽量精细，以维持卵泡基底膜完整。 1.3.3分组 共进行A、B两个实验，每次实验对获得的卵泡分为4组，1组作为新鲜对照组，其余3组采用不同的冷冻方法处理。 1.3.3.1实验A 采用常规玻璃化法、,205?玻璃化法和液氮网篮法分别进行冷冻保存操作。分为A1:新鲜卵泡对照组，将直接对卵泡进行台盼蓝染色，计数死、活细胞数，以计算卵泡的存活率;A2:常规玻璃化组，卵泡转移至50μL的EM中4min;再转移卵泡至SSV中，连续转移3次(卵泡与SSV接触时间25,30s);转移含卵泡的SSV100 μL至冷冻管中，随即直接投入液氮罐保存;A3:,205?玻璃化组，卵泡转移至50μL的EM中4min;再转移卵泡至SSV中，连续转移3次;转移含卵泡的SSV100μL至冷冻管中，将冷冻管投入Vitmaster玻璃化快速冷冻仪(-205?)装置中，继而转入液氮罐中保存;A4:液氮网篮组，卵泡转移至50μL的EM中4min;再转移卵泡至SSV中，连续转移3次;将卵泡小液滴(共100μL)滴到和液氮直接接触的网篮上(-196?)，小液滴立即形成透明的小冰珠;转移小冰珠至预冷的冷冻管中，密封后投入液氮罐保存。福建医科大学学报2009年9月第43卷第5期常娟娟等:小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究 1.3.3.2实验B 采用-205?玻璃化法、液氮网篮法和,205?表面玻璃化法分别进行冷冻保存操作。分为B1:新鲜卵泡对照组，操作方法同A1;B2:-205?玻璃化组，操作方法同A3;B3:液氮网篮组，操作方法同A4;B4:,205?表面玻璃化组，卵泡转移至50μL的EM中4min;再转移卵泡至SSV中，连续转移3次;转移含卵泡的SSV100μL至事先放置于快速冷冻仪(-205?)装置中预冷的的冷冻管中(表面温度-205?);冷冻管密封后投入液氮罐保存。 1.3.4卵泡复苏方法 两个实验的复苏方法相同。从液氮罐中取出冻存管，立即放入37?水浴锅，摇晃至冰珠完全融解(<2min);转移融解的冻存液至1 滴500μL的复苏液?(0.3mol/LTrehalose)中3min;再转移至复苏液?(0.15mol/LTrehalose)中3min;转移卵泡至M2中，清洗1,2遍后台盼蓝染色。 1.3.5台盼蓝染色 新鲜卵泡或冷冻复苏后的卵泡与0.4%的台盼蓝染液等体积混合，5,10min内观察卵泡的染色情况，并分别计数被染成蓝色(死卵泡)、未染成蓝色(活卵泡)的卵泡数;分别按下式计算存活率和复苏率: 存活率=[活卵泡数/(死卵泡数+活卵泡数)]×100% 复苏率=(冷冻复苏后卵泡存活率/新鲜卵泡存活率)×100% 1.4统计学处理 采用SPSS11.5软件处理数据。单因素方法(onewayANOVA)比较组内复苏率，各组均数以最小显著差法 (leastsignificantdifference,LSD)、SNK、Duncan进行两两比较和显著性检验。 2结果 2.1形态学观察 倒置显微镜下可见，分离出的窦前卵泡大部分呈圆形或卵圆型，有完整的颗粒细胞层，色泽明亮，层次分明，颗粒细胞层周围光滑;颗粒细胞层数较少的卵泡及卵母细胞清晰可见，位于卵泡的中间或略偏一侧，镜下表现为圆而明亮，胞质均匀;颗粒细胞层数较多的卵泡 在镜下看不清卵母细胞，其颗粒细胞密而紧凑，紧紧包围着卵母细胞，其外围与膜紧密相连，外观光洁明亮均质。少量卵泡表现为基底膜模糊或破损，卵泡细胞松散或游离到卵泡外，卵母细胞逸出卵泡，变形或崩解。冷冻前后卵泡在形态上无明显差别。 2.2台盼蓝染色结果 活卵泡未被染色，死卵泡被染成蓝色(图1)。 2.3不同方法复苏率比较 不同方法冷冻复苏小鼠窦前卵泡的复苏率见表1。A,B实验中，液氮网篮和,205?玻璃化冷冻的冷冻效果一致，两种方法的卵泡复苏率差别无统计学意义;常规玻璃化的冷冻效果最差，,205?表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好。表1不同冷冻方法对小鼠卵泡复苏率的比较(略) 3讨论 在辅助生殖医疗实践中，以往常用程序化慢速冷冻法来冻存胚胎或生殖细胞。但该法需昂贵的高精密程序降温仪、操作复杂繁琐(全程约需2.5,3h)、耗液氮量多，并且无法完全避免冰晶形成，使冷冻效率难于提高，尤其不利于进行卵泡和卵巢碎片等较大体积的组织冷冻。近年发展起来的玻璃化冷冻技术具有简便、快速、经济等优点，尤其是可以避免细胞内外形成冰晶，不仅提高了冷冻效率，也大大提高了较大体积组织冷冻的可行性，因此成为生殖工程领域的一个研究热点[8]。玻璃化冷冻技术是采用适当高浓度的冷冻保护剂，结合某些高分子物质配制成玻璃化冷冻保护液来预处理细胞，并以快速的制冷速 度，使细胞内外液体形成玻璃化状态以避免冰晶的形成。 玻璃化冷冻操作的关键是保证极快的降温速率。采用开放性操作，将悬液滴于金属环、网并直接投入液氮是公认降温速率最快的方法[9 11]，但因悬液直接接触液氮可能造成污染而不实用。因此，目前普遍采用的玻璃化冷冻操作方法，是将混悬有细胞/组织的玻璃化冷冻保护液(以下简称“悬液”)加入塑料冷冻管中，而后将冷冻管迅速直接投入液氮。这种做法会导致冷冻管在投入液氮的瞬间使液氮沸腾，造成管壁周围产生大量气泡而形成一层不易导热的屏障，从而使降温速率受到削弱，最终使玻璃化冷冻技术的效率难于理想地发挥。为了克服这个缺点，Dinnyes等建立了固体表面玻璃化的冷冻方法，将悬液滴在预先浸裕于液氮中的金属杯的内表面，使悬液直接接触到,150?,,180?的固体表面，有效地提高了冻存效果[7];Huang等采用了一种新的装置，通过抽真空使液氮温度进一步降低至,205?，从而使加快了冷冻管及其悬液的降温速率，也达到了更好的玻璃化冷冻效果[12]。本研究将上述两种方法相结合，建立了,205?表面玻璃化操作方法，用于冷冻保存小鼠窦前卵泡，并通过比较实验来考察其冷冻保护效果。 本研究参照文献[7]的玻璃化冷冻保护液，比较了常规玻璃化法、液氮网篮法、,205?玻璃化法、,205?表面玻璃化法等4种不同冷冻操作方法的冷冻保护效果。其中，液氮网篮法是开放性操作方法，采用在液氮的液面安置一个不锈钢网篮，将悬液滴在网篮表面，使悬液直接接触液氮(理论温度,196?)。实验结果表明，液氮网篮法和, 205?玻璃化法的冷冻卵泡复苏率均高于常规玻璃化法，而,205?表面玻璃化的复苏率又优于前两者，是4组比较实验中最佳的操作方法。液氮网篮法相当于将组织直接和液氮接触，而,205?玻璃化组的冷冻温度较低，故两者都加快了热交换速率，提高了冷冻速率。,205?冷冻是一种特殊的超速冷却的玻璃化，超冷却液氮的冷却速率可以达到100000?/min，远高于常规玻璃化的冷却速率(2500?/min)，因此冷冻保护效果优于常规玻璃化法。但,205?玻璃化法的冷冻保护并不优于液氮网篮法，其原因可能就在于冷冻管的使用削弱了超冷却液氮的降温速率。在,205?表面玻璃化法，笔者将冷冻管预先浸裕到液氮中，而后抽真空使系统达到,205?。这样就使卵泡组织悬液滴入冷冻管时直接接触到近于,205?的超冷表面，既避免了冷冻管投入,205?液氮后产生的氮气层，又排除了液氮温度通过冷冻管壁传导过程造成降温速率降低，使冷冻仪的降温速率得到最佳的发挥。在此超低温环境下悬液发生玻璃化，细胞内外均无冰晶形成，明显减少了冷冻损伤。同时，由于降温速率的提高使悬液迅速玻璃化，也缩短了卵泡在较高温区与冷冻保护液的接触时间，减少了冷冻保护液对细胞的毒性影响。 本研究采用,205?表面玻璃化操作方法进行了15例的重复实验，卵泡的冷冻复苏率达到了(83.02?4.10)%，变异系数只有4.93%，说明实验结果高度稳定。此外，本方法直接在冷冻管中进行玻璃化冷冻，冷冻后直接置于液氮中长期保存，不必象一般固体表面玻璃化那样进行冷冻体转移[7]，也避免了液氮网篮法那样使悬液直接接触液氮而 遭受污染。 【参考文献】 [1]HasegawaA,HamadaY,MehandjievT.Invitrogrowthandmaturationaswellasfertilizationofmousepreantraloocytesfromvitrifiedovaries[J].FertilSteril,2004,81(1):824830. [2]WuJ,ZhangL,WangX.Invitromaturation,fertilizationandembryodevelopmentafterultrarapidfreezingofimmaturehumanoocytes[J].Reproduction,2001,121(3):389393. [3]SeginoM,IkedaM,HiraharaF.Invitrofolliculardevelopmentofcryopreservedmouseovariantissue[J].Reproduction,2005,130(2):187192. [4]DelaPensEC,TakahashiY,KatagiriS.Birthofpupsaftertransferofmouseembryosderivedfromvitrifiedpreantralfollicles[J].Reproduction,2002,123(4):593600. [5]MigishimaF,Suzuki MigishimaR,SongSY,etal.Successfulcryopreservationofmouseovariesbyvitrification[J].BiolReprod,2003,68(3):881887. [6]ClausYA,MikkelR,AnneGB.Twosuccessfulpregnanciesfollowingautotransplantationoffrozen/thawedovariantissue[J].HumReprod，2008,10(23): 22662272. [7]DinnyesA,DaiY,JiangS.Highdevelopmentalratesofvitrifiedbovineoocytesfollowingparthenogeneticactivation,invitrofertilization,andsomaticcellnucleartransfer[J].BiolReprod,2000,63(2):513518. [8]VajtaG.Vitrificationoftheoocytesandembryosofdomesticanimals[J].AnimReprodSci,2000，6061:357364. [9]KimSH,KuSY,SungKC.SimplifiedEMgridvitrificationisaconvenientandefficientmethodformousematureoocytecryopreservation[J].YonsEiMedJ,2006,47(3):399404. [10]孙正怡,何方方,郁琦.冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚 冷冻复苏效果的比较[J].生殖医学杂志,2006,15(3):161164. [11]王雁林,朱桂金,魏玉兰.Cryoloop和CPS超速玻璃化冷冻人三 原核胚胎效果比较[J].中国妇幼保健,2006,21(11):15341536. [12]HuangCC,LeeTH,ChenSU.Successfulpregnancyfollowingblastocystc ryopreservationusingsupercoolingultra rapidvitrification[J].HumReprod,2005,20(1):122128.