鬼臼毒素二元醇质体体外抗宫颈HPV感染的研究[Word文档]

鬼臼毒素二元醇质体体外抗宫颈HPV感染的研究[Word文档] 鬼臼毒素二元醇质体体外抗宫颈HPV感染的研究 关键字: 鬼臼毒素二元醇质体体外抗宫颈HPV感染的研究 本文为Word文档，感谢你的关注, 【摘要】 目的 研究鬼臼毒素二元醇,|体(POD-BE)体外抗宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染的效果。方法 采用超声注入法制备POD-BE， 采用透析法测定POD-BE包封率(EE%) ， 观察POD-BE形态学、外观性状及稳定性， 运用CCK-8法和流式细胞术(FCM)分别检测POD-BE和POD处理后永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)的增殖和凋亡， 以透射电镜和激光共聚焦显微镜 (LCSM)分别观察细胞的形态变化及药物在细胞的分布。结果 制备的POD-BE混悬液电镜下为类球状小囊泡， 平均粒径(84.6?9.2)nm， Zeta电位(-27.2?4.2)mV。保存在4?冰箱内的POD-BE样本， 6个月内仍保持半透明、质地均匀外观， 未见沉淀及药物结晶析出。3000 r/min离心20 min未发现分层现象。而保存在室温下的样本， 24 h未见任何变化， 3,6个月时出现少许混浊， 震荡后样本恢复均一外观， 未见药物结晶析出。POD-BE组和POD组均呈剂量和时间依赖性地抑制H8细胞的增殖。在相同浓度同一时间条件下， POD-BE组对H8细胞的增殖抑制效果明显强于POD组(P<0.01)。POD-BE组 12、24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为782、595、97 μg/L， 而POD组的IC50则分别为1966、1570、758 μg/L;空白BE组对细胞无明显毒性。与空白对照组相比， POD-BE组和POD组均能明显诱导H8细胞凋亡(P<0.01);然而POD-BE组诱导凋亡的效果则显著强于POD组(P<0.01)。10 μg/L的POD-BE和POD分别处理H8细胞24 h后， 透射电镜下显示: H8细胞被药物处理后其染色质高度凝聚、边缘化， 形成凋亡小体。H8细胞分别被POD-BE和POD处理24 h后， 两组的荧光均现出聚集于细胞核的趋势， 且POD-BE 组较POD组荧光信号强度显著增强， 而空白BE组和空白对 照组未见有阳性荧光信号表达。结论 POD-BE具备理想的理化 性质， POD-BE较POD对H8细胞具有更强的增殖抑制和凋亡 诱导效果。 【关键词】 鬼臼毒素;二元醇质体; 细胞凋亡; 宫颈人乳头瘤病毒 DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.01.001 Research of podophyllotoxin binary ethosomes in external anti-cervical HPV infection ZHONG Shu-bin， WANG Xiao-jie， CHEN Ru-da， et al. Department of Dermatology， Nanhai Affiliated Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510515， China 【Abstract】 Objective To research effect by podophyllotoxin binary ethosomes (POD-BE) in external anti-cervical human papilloma virus (HPV) infection. Methods POD-BE was prepared by ultrasonic injection method， and encapsulation efficiency (EE%) of POD-BE was detected by dialysis method. Observation was made on morphology， external properties and stability of POD-BE. CCK-8 method and flow cytometry method (FCM) were applied to detect POD-BE and multiplication and apoptosis of immortalized human cervical epithelial cell (H8 cell) after POD treatment. Transmission electron microscope and laser scanning confocal microscope (LCSM) were applied to respectively observe morphologic change and drug distribution of cell. Results Prepared POD-BE suspension showed globular small vesicae under electron microscope， with mean grain diameter as (84.6?9.2) mm and Zeta electric potential as (-27.2?4.2) mV. POD-BE samples in 4? refrigerator showed semitransparent and balanced appearance without sediment and drug crystal separation. No stratification appeared after 20 min of centrifugation by 3000 r/min. Samples in indoor temperature showed no changes after 24 h， while there was a few suspension in 3,6 months without drug crystal separation after shock. Both POD-BE group and POD group showed H8 cell proliferation inhibition with dosage and time dependence. Under the condition of same concentration， POD-BE group showed stronger proliferation inhibition effect on H8 cell than POD group (P<0.01). POD-BE group had median inhibitory concentration (IC50) in 12， 24 and 48 h respectively as 782， 595 and 97 μg/L， which were respectively 1966， 1570 and 758 μg/L in POD group. Blank BE group showed no obvious cytotoxicity. Comparing with blank control group， POD-BE group and POD group showed obvious induction on H8 apoptosis (P<0.01)， and POD-BE group had stronger apoptosis induction effect than POD group (P<0.01). After H8 treated by POD-BE and POD respectively by 10 μg/L for 24 h， transmission electron microscope showed high chromatin condensation， marginalization and formed apoptotic body in H8 cell. After 24 h treatment by POD-BE and POD in H8 cell， both groups showed fluorescence focused on cell nucleus， and POD-BE group had obviously stronger fluorescence signal than POD group， while there was no positive fluorescence signal expression in blank BE group and blank control group. Conclusion Due to its ideal physicochemical property， POD-BE provides more stronger proliferation inhibition and apoptosis induction effects on H8 cell than POD. 【Key words】 Podophyllotoxin; Binary ethosomes; Apoptosis; Cervical human papilloma virus 尖锐湿疣(condyloma acuminatum， CA)是由人乳头瘤病毒(human papilloma virus， HPV)感染引起的性传播疾病， 而高危型HPV是导致女性宫颈癌的主要原因[1]。鬼臼毒素(podophyllotoxin， POD)酊剂是治疗CA最有效的一线药物， 在临床上应用广泛。但其靶向性和黏附性差， 对皮肤及黏膜的刺激性大， 不,m宜用于阴道和宫颈CA的治疗， 且对HPV潜伏感染疗效不佳， 因而其临床应用和疗效发挥受到了限制。随着纳米医药学的发展， “醇质体”(ethosomes， E)作为一种新型的药物载体， 以其良好的组织相容性和靶向缓释特性， 正日益成为局部药物治疗的研究热点[2]。在“醇质体”处方中， 引入丙二醇， 则变成“二元醇质体”(binary ethosomes， BE)。本课题组在既往研究及相关研究的基础上[3， 4]， 利用纳米技术制备了靶向性更强的POD-BE， 以H8细胞(HPV16阳性)为靶细胞， 通过研究其对细胞增殖和凋亡的影响， 为宫颈HPV的临床防治提供实验依据。 1 材料与方法 1. 1 POD-BE的制备和包封率(EE%)测定 采用超声注入法制备POD-BE。取处方量鬼臼毒素、卵磷脂、胆固醇用无水乙醇/丙二醇混合溶剂溶解， 在密闭条件下边搅拌边用注射器加入超纯水， 磁力搅拌1000 r/min， 将注射器中的超纯水以180 μl/min的流速注入磷脂混悬液中， 注入完后再搅拌30 min， 温度始终维持在30?。然后在冰水浴条件下超声处理1 min， 再经过过滤即得POD-BE。POD-BE包封率(EE%) 测定采用透析法测定[4]。 1. 2 POD-BE形态学、外观性状及稳定性观察 将稀释至一定浓度的POD-BE滴加在覆盖碳膜的铜网上， 以 3%磷钨 酸负染， 使用透射电镜观察其粒径大小和形态， 并照相。然后分别将样品置于4?及室温下储藏， 在 24 h 及6 个月时检测其粒径及包封率， 并3000 r/min离心20 min， 观察是否分层或出现沉淀。 1. 3 H8细胞培养和POD-BE的增殖抑制效应 将H8细胞株(中国医学科学院基础医学研究所提供)在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行常规传代培养。取浓度为2.5×105/ml的对数生长期的H8细胞接种于96孔板中， 每孔200 μl。实验分为POD-BE组、POD组、空白BE组(加入等体积的空白BE混悬液)、空白对照组(加入等体积的培养液)， 其中POD-BE组、POD组分别设0.1、1、10、100、1000 μg/L浓度组。每孔均设3个复孔。分别培养12、24、48 h后， 加入10 μl浓度为5 mg/ml的CCK-8溶液， 以酶标仪检测各孔OD值(λ=450 nm)。细胞增殖抑制率= [(对照-本底)-(给药-本底)]/ (对照-本底)×100%。Logit 法计算半数抑制浓度。 1. 4 Annexin V/PI检测细胞凋亡 调整细胞浓度为1×106/ml， 实验分为POD-BE组、POD组和空白对照组(加入等体积的培养液)， 其中POD-BE组、POD组分别加入含终浓度均为10 μg/L POD和POD-BE培养液， 药物干预24 h后， 收集细胞， 按Annexin V/PI试剂盒说明进行检测。 1. 5 电镜观察H8细胞的凋亡形态 取细胞浓度为1×106/ml的H8细胞接种于直径3.5 cm的培养皿中， 分别加入终浓度均为10 μg/L培养皿的POD-BE和POD， 对照组加入等体积的培养液， 培养24 h后， 用透射电镜观察细胞超微结构， 见参考文献[5]。 1. 6 LCSM观察药物在细胞的分布 取对数生长期的H8细胞， 接种于内置有盖玻片的共聚焦显微镜专用培养皿内， 实验分为POD-BE组(加入终浓度为10 μg/L POD-BE培养液)、POD组(加入终浓度为10 μg/L POD培养液)、空白BE组(加入等体积的空白BE混悬液)和空白对照组(加入等 体积的培养液)， 药物作用24 h后， LCSM观察其在细胞的俘获分布。 1. 7 统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件对所得数据进行统计。计量资料以均数?差( x-?s)表示， 各组间比较采用单因素方差分析， 多重比较采用LSD法。P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2. 1 POD-BE的形态、粒径、电位及包封率 制备的POD-BE 混悬液电镜下为类球状小囊泡， 形态圆整， 粒径小而均匀， 平均粒径(84.6?9.2)nm(见图1)， Zeta电位(-27.2?4.2)mV。3份样本中POD的平均包封率为(86.3?2.3)%。 2. 2 稳定性实验 保存在4?冰箱内的POD-BE样本， 6个月内仍保持半透明、质地均匀外观， 未见沉淀及药物结晶析出。3000 r/min离心20 min未发现分层现象。而保存在室温下的样本， 24 h未见任何变化， 3,6个月时出现少许混浊， 震荡后样本恢复均一外观， 未见药物结晶析出。 2. 3 不同制剂的POD对H8细胞的增殖抑制作用 POD-BE组和POD组均呈剂量和时间依赖性地抑制H8细胞的增殖。在相同浓度同一时间条件下， POD-BE组对H8细胞的增殖抑制效果明显强于POD组， 差异具有统计学意义(P 2. 4 POD-BE和POD 诱导H8细胞调亡 与空白对照组相比， POD-BE组和POD组均能明显诱导H8细胞凋亡(P<0.01);然而POD-BE组诱导凋亡的效果则显著强于POD组(P<0.01)。见表1， 图3。 2. 5 POD-BE 诱导H8细胞调亡的形态学变化 10 μg/L的POD-BE和POD分别处理H8细胞24 h后， 透射电镜下显示:H8细胞被药物处理后其染色质高度凝聚、边缘化， 形成凋亡小体。见图4。 2. 6 LCSM观察POD-BE和POD在细胞的俘获分布 H8细胞分别被POD-BE和POD处理24 h后， 两组的荧光均表现出聚集于细胞核的趋势， 且POD-BE组较POD组荧光信号,,度显著增强， 而空白BE组和空白对照组未见有阳性荧光信号表达。见图5。 3 讨论 与脂质体不同的是， 醇质体的囊泡里含有较高浓度的乙醇， 既具备脂质体刺激性小、缓释及良好的靶向性等优点， 又克服了脂质体的包封率低、长期贮存药物易于泄露等缺点[6]。而在其处方中引入丙二醇， 则演变成二元醇质体， 既可减少乙醇的含量， 又进一步增加它的稳定性[4]。于燕燕等[7]发现， 与0.5% POD酊剂相比， 0.35% POD-BE 具有较大的皮肤滞留量及较小的透皮速率， 提高了用药安全性。作者前期的研究已经证实， POD纳米制剂对特定组织表现出良好的靶向性和缓释性， 可大大降低CA的复发率[8， 9]。故推测， 采用BE包裹POD后， 有望增强POD在黏膜组织的局部浓集效果， 清除宫颈HPV潜伏感染， 减少宫颈CA的复发。 纳米制剂的理化特性与该制剂所使用的材料、制备方法等有关。本研究采用超声注入法研制POD-BE， 显示出良好的理化特性， 其粒径仅为(84.6?9.2)nm， 包封率高达(86.3?2.3)%， 且在室温下保存 60 d后， 仍有较好的稳定性。其主要原因可能是:乙醇的添加使醇质体表面带上了负电荷， 从而使粒子间不易聚集[10];胆固醇的加入可有效增加醇质体磷脂双分子层的韧性， 从而使醇质体具有更小的粒径[11];乙醇联合丙二醇， 可有效增加药物的溶解性及制剂的稳定性[12]， 这也较好地解决了脂质体在常温下不稳定这一难题。 H8细胞株因含有HPV16型 E6和E7基因， 且将其接种到裸鼠不能形成肿瘤， 可作为体外研究宫颈HPV感染和癌前病变的细胞模型。本实验以H8细胞作为靶细胞， 旨在研 究POD-BE对细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应。本研究结果显示， 与POD组相比， POD-BE组对H8细胞具有更强的增殖抑制和凋亡诱导效果， 可能在于BE的成分与细胞膜的成分比较相似， POD被其包裹后， 更容易被细胞通过胞饮、膜融合等方式摄入细胞， 并缓慢地释放， 从而使细胞内的药物浓度得以显著提高。LCSM下发现H8细胞被药物处理后荧光表现出聚集于细胞核的趋势， 与POD组相比， POD-BE组的核内荧光强度更强， 这也支持了作者的推测， 荧光强度不同提示二者在细胞的分布和转化可能会不同， 作者会在将来的研究中进一步去论证。 综上所述， 采用超声注入法制备 POD-BE， 成功率高， 制备的样品具有粒径小、分布均匀、包封率高、稳定性好的特点。体外药效学研究表现出较好的抗宫颈HPV感染和治疗宫颈癌前病变的效果， 为下一步研究奠定了基础。 参考文献 [1] Walboomers JM， Jacobs MV， Manos MM， et al. 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