枯草芽孢杆菌F-2抗植物病原真菌活性物质的研究

枯草芽孢杆菌F-2抗植物病原真菌活性物质的研究 枯草芽孢杆菌F-2抗植物病原真菌活性物质 的研究 浙江大学(农业与生命科学版)33(1):34,39,2007 JournalofZhejiangUniversity(Agric.&LifeSci.) 文章编号:1008—9209(2007)01—0034—06 枯草芽孢杆菌F一2抗植物病原真菌活性物质的研究 鲁小城,赵宇华,方萍 (1.浙江大学生命科学学院微生物研究所,浙江杭州310058;2.浙江大学环境与资源学院农业化学研究所,浙江杭州310029) 摘要:枯草芽孢杆菌F一1和F一2与尖孢镰刀茵的对峙实验中,F一1没有抑茵作用,而F一2表现出强抑 茵效果.为了分析测定F一2的抑茵活性物质,对F一1和F一2胞外代谢物粗提液的HPLC谱图进行比较, 发现F一2具有F一1所没有的特征代谢产物.使用LC—MS对F一2的特征产物进行分析,推测主要产物的 分子量为1477.0,1489.1和1505.1.进一步采用MALDI-TOFMS对F一2粗提液进行分析,发现F一2产 生两组分子量相差14Da(CH2)的同系物.其中一组的分子量依次为1462.8,1476.8,1490.8,1504.8和 1518.9,通过质量指纹谱技术鉴定为脂肽抗生素CFengycinB.另一组的分子量依次为1432.8, 1446.8,1460.8,1474.8和1488.9,与C1mFengycinA对应分子分子量相差2Da,推测可能是 FengycinA的一种异构体,其碳链中具有一个双键,具体性质有待进一步分析. 关键词:枯草芽孢杆菌;脂肽抗生素;质量指纹谱技术;LC—MS;MALDI—TOFMS 中图分类号:Q939.92文献标识码:A LUXiao—cheng,ZHAOYu—hua,FANGPing(1.InstituteofMicrobiology.CollegeofLife Sciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China2.InstituteofAgriculturalChemistry. CollegeofEnvironmental&ResourceSciences,ZhejiangUniversity.Hangzhou310029,China) StudyonantifungalactivesubstanceofBacillussubtilisF-2.JournalofZh~iangUniversityfAgric.8L LifeSci.),2007,33(1):34—39 Abstract:EffectsofBacillussubtilisF一1andF一 2oninhibitingthegrowthofFusariumoxysporumf, sp. cucumerinum(F.0.c)werestudiedbyaco— cultureexperiment.Theresultsshowedthatthegrowthof F.0.CcouldbestronglyinhibitedbythespecificmetabolitesofBacillussubtilisF一2. butnotbyBncZ"s subtilisF一1.ItwasguessedbyLC— MSdeterminationthatthepossiblemolecularweightsofthespecific metaboliteswere1477.0,1489.1and1505.1.ItwasfurtherfoundbvMALDI— T0FMSthattherewere twogroupsofhomologueswithadifferenceof14DainmolecularweightsintheextractofBncZZ"s subtilisF一 2.Inthefirstgroup,therewere5kindsofhomologueswiththemolecularweightsof1462.8, 1476.8,1490.8,1504.8and1518.9,respectively,whichwereidentifiedaslipopeptideantibiotics FengycinB(C,4— 18)bythemethodofmassfingerprinting.Inthesecondgroup,themolecularweightsof 5kindsofhomologueswere1432.8,1446.8,1460.8,1474.8and1488.9,respectively, whichwere estimatedastheisomerofFengycinA(C14.18)asonly2Dadifferenceinmolecularweights. Keywords:Bacillussubtilis;lipopeptideantibiotics;massfingerprinting;LC-MS;MALDI- TOFMS 收稿日期 基金项目 作者简介 通讯作者 2006—07—11 教育部博士点资助基金(20050335006). 鲁小城(198O一),男,浙江杭州人,硕士研究生,从事环境微生物方面的研究.E— mail:xiaocheng@zju.edu.CR 赵宇华,男,教授,博士生导师,主要从事环境微生物方面的研究.E— mail:yhzhao1958@yahoo.com.cn 第1期鲁小城,等:枯草芽孢杆菌F一2抗植物病原真菌活性物质的研究 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)被认为是 一 种具有潜在的,能有效抑制植物病原真菌并 促进植物生长发育的有益菌.目前,已陆续从不 同的枯草芽孢杆菌菌株中分离得到具有抑制植 物病原真菌生长作用的脂肽类物质,包括表面 活性素(Surfactin),伊枯草菌素(Iturin)和芬枯 草菌素(Fengycin)[1].Surfactin表现出抗病 毒,抗肿瘤和抗支原体活性,作用机理是破坏 病毒的脂膜.此外,它能有效地增强IturinA的 抗真菌活性.Iturin和Fengycin具有强抗真菌 活性,机理是影响真菌细胞膜的表面张力,导致 微孔的形成,从而使细胞内K及其它重要离 子渗漏,最后引起细胞死亡. 本实验室分离得到1株具有抗植物病原真 菌活性的枯草芽孢杆菌F-2.本研究通过 HPLC,LC—MS和MALD1一TOFMS等现代化 分析仪器对F-2的胞外代谢物粗提液进行了定 性分析,测定了F-2所产生的抑菌代谢物的活 性成分及类型,从而为F一2在农业生产中推广 应用提供理论依据. 1材料与方法 1.1菌株及其培养 菌株F一1和F一2为实验室分离保藏,通过 生理生化及16SrDNA同源性分析,鉴定均为 枯草芽孢杆菌,且同源性高(数据未发表).培养 使用KMB培养基,菌株先用平板活化和KMB 培养液预培养,然后将初级发酵液5mL接种 至含有50mLKMB培养液的250mL三角瓶 中,30?,150r.min条件下培养48h.拮抗用 植物病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专属型 (Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum,F. O.c),培养使用PDA培养基. 1.2F-1,F-2拮抗作用测定 采用平板对峙法:在28?生化培养箱中培 养5d的F.O.C病菌PDA平板边缘挑取0.7cm 菌饼,接种在新的PDA平板中央,留取空白对 照,然后在距平板中心2.25cm处的四角分别点 接F_1,F-2.每个处理重复3皿,置28?下培养, 分别在培养60,72,84,96,108,132,156h时观察 并拍照. 1.3F-1,F-2胞外代谢物的提取 F-1,F-2摇瓶培养结束后,将发酵液倒入 50mI灭菌离心管中,4000r.min离心20 min,去除菌体细胞.将上清液倒入另一50mI 灭菌离心管中,加入6too1.LHCI调节pH 至2.0,然后于4"C静置过夜.4000r.rain离 心,弃上清液,加入1mL已调至pH7.0的甲 醇,用灭菌搅棒搅匀,4?静置萃取8h后,于 4000r.min离心10min,将上清液倒入1.5 mL灭菌离心管中,即为F一1,F-2胞外代谢物 粗提液.置于一20?冰箱备用. 1.4F-2粗提液拮抗作用测定 制备拮抗用F.O.C平板,方法同1.2.然后 在距平板中心2cm处的四角分别放置直径 0.7cm灭菌圆形滤纸片.将F-2粗提液10L 滴加至滤纸片上.另用已调至pH7.0的甲醇 10L滴加至另一平皿滤纸片上作为对照.每 个处理重复3皿,置于28?下培养,分别在培 养36,60,84,108,132,156h时观察并拍照. 1.5F-1,F-2粗提液的HPLC检测 HPLC系统为Agilent1100Series, AgilentZorbaxEclipseXDB—C18色谱柱(4.6 mm×250mm,5"m).梯度洗脱,条件参见文 献[4].溶液A为0.05的甲酸溶液,溶液B 为100的乙腈.梯度变化的时间为:?0—3 min,A100—100,B0—0;?3—60rain, A100—0,B0—100;?60—62min,A0 —100,B100—0;?62—70rain,A100— 100,B0—0.20"L进样,流速1mL.min,, 254nm波长检测. 1.6F-2粗提液的LC—MS检测 IC—MS系统为Agilent1100SeriesLC/ MSD,AgilentZorbaxExtend—C18色谱柱(2.1 mm×150mm,3.5"m).梯度洗脱,条件同 1.5.10I进样,流速0.3mL.rain-.,254nm 波长检测.电离方式采用电喷雾(ESI),正离子 模式,质量检测器为四极质量分析器,检测范围 为5OO,1800Da. 1.7F-2粗提液的MALDI-TOFMS检测 MALDI—TOFMS系统为美国应用生物系 统公司的VoyagerDETMSTRMAIDI—TOF 质谱仪,条件参见文献[5—8].使用337nm氮激 浙江大学(农业与生命科学版)第33卷 光源解吸附电离,基质为a一氰一4一羟肉桂酸(a— cyano-4一hydroxycinnamicacid),工作溶液为a一 氰-4-羟肉桂酸的饱和溶液,溶剂为包含0.19/6 三氟乙酸的70乙腈水溶液.将粗提液1L 置于靶板上,其上覆盖1L基质工作溶液,自 然风干.采用正离子检测和反射模式,加速电压 和反射电压分别为20和23.4kV脉冲离子模 式,检测范围为900,1600Da. 2结果与分析 2.1F-1,F-2拮抗作用分析 如图1所示,F-1对病原菌F.O.C没有抑 制效果(图1B),而且可以与之共同生长,并在 某种程度上促进病原菌的生长,使病原菌菌落 长成方形.而F-2具有明显的抑制病原菌生长 的作用(图1C),使其菌落的生长被抑制在中心 而长成方形,并在156h的观察期中有效地把 病原菌控制在平板中心区域之内.证明F-2具 有抑制F.O.C生长的作用. 2.2F-2粗提液的拮抗作用分析 在最初的生长时期内,F.O.C已被成功地 抑制在中心区域,并且抑制作用明显,而仅用甲 醇未发现对真菌的抑制效果(图1D).从而证 明本提取方法有效地提取了抑菌成分.但是, 随着抑菌物质被逐渐消耗,特别是132h后, F.O.C的生长已不受抑制,并覆盖滤纸片生长 (图1E). A:空白对照;B:F一1拮抗平板;C:F一2拮抗平板;D:甲醇拮抗平板;E:F一2粗提 液拮抗平板 图1132h拮抗实验照片 Fig.1Photosof132hantagonismexperiment 2.3F-1,F-2HPLC色谱图对比分析 由于F-1,F-2均为枯草芽孢杆菌,故推测 它们组成型的代谢产物一致,而谱图中不同部 分即为表征两个菌株不同特性的特征代谢产 物.如图2所示,谱图峰形的差异主要在26, 39min之间的部分,峰形其它部分则无明显差 异.在2.2中已证实F-2的粗提液有明显的抑 菌效果,故可推测这部分的代谢物差异即为决 定F-2有抗真菌活性而F-1无抗真菌活性的本 质原因.进而为下一步LC-MS液质联用分析 提供了观测范围的依据. 2.4F-2LC-MS联用谱图分析 如图3所示,在HPLC26,39min范围 内,质谱有4个响应峰,保留时间分别为 26.607min,33.037min,35.021min和 38.776rain,对峰值解析的数据详见表1.由于 四极质量分析器对肽的检测精度不高,而且 MS测定中没有使用质量标准品作参比标注, 故上述判断并不完全准确,需使用MALDI— TOFMS作进一步精确测定. 2.5F-2MALD卜ToFMS谱图分析 如图4所示,9OO,1400Da范围并没有高 强度的峰,而主要的峰集中在1450~1550Da. 故取此范围,通过工作站软件滤除相对强度2 以下的杂峰并合并H的同位素,得到图5.从图 中整理出两组分子量相差14Da,即一个亚甲 基CH的同系物系列,数据详见表2.由表2 可知,F-2抗真菌物质主要是C1.Fengycin B,此外还有一组同系物可能是C..Fengycin A,但是分子量与其相差2Da,推测可能是在 其脂肪酸碳链中存在一个双键而缺失2个H 所致. 第l期鲁小城,等:枯草芽孢杆菌F-2抗植物病原真菌活性物质的研究37 上谱图为F-2HPLC色谱图;下谱图为F-1HPLC色谱图 图2F-I,F-2胞外代谢物粗提液HPLC色谱图 Fig.2HP1CchromatogramoftheF-l,F-2extract 上图为ES1MS响应强度谱图;下图为HPIC色谱图 图3F-2胞外代谢物粗提液LC-MS联用谱图 Fig.3I.C-MSspectrogramoftheF-2extract ????0州????0 ????0 nll 38浙江大学(农业与生命科学版)第33卷 重量 ……,.…一,,一.…...…………....LI.i.11… 80 重50 暑40 10 Mass(m/z) 图4F-2胞外代谢物粗提液MALDI-TOFMS质谱图(9OO,1600Da) Fig.4MAIDITOFMSspectrogramoftheF一2extract(900,1600Da) 145014701490 Mass(m/z) l5l0l530 图5F-2胞外代谢物粗提液MALDI-TOFMS质谱处理图(145041550Da) Fig.5MAIDI—TOFMSspectrogramoftheF一2extractafterdisposal(1450,1550Da) 表2MALDI-TOFMS数据分析 Table2MAIDI—TOFMSdateanalysis 1550 脯 (m/z 比 )嘉匹配分子脯(m结合形式分子量匹配,…准确分子鱼结合形式分子量一…准确分子虽 系列一系列二 1455.8[M十Na]1432.8iCl4FengycinA1434.761485.8[M十Na]一1462.8CI4FengycinB1462.79 1469.8[M+Na31446.8iCl5FengycinA1448.781499.8[M+Na3—1476.8C15FengycinB1476.81 1483.8[M+Na]1460.8iCl6FengycinA1462.791513.8[M+Na31490.8C16FengycinB14 90.82 1497.8[M+Na31474.8iCl7FengycinA1476.811527.8[M+Na31504.8C17FengycinB15 04.84 1511.9[-m+Na31488.9iCl8FengycinA1490.821542.9[M+Na31518.9C18FengycinB15 18.86 第1期鲁小城,等:枯草芽孢杆菌F一2抗植物病原真菌活性物质的研究 3讨论 枯草芽孢杆菌分泌的表面活性素,伊枯草 菌素和芬枯草菌素三类脂肽类抗生素,由于结 构相似,分子量相近,且同系物众多,用HPLC 方法分离鉴定效果差].目前,使用基质辅助激 光解吸飞行时间质谱(MALDI—TOFMS)结合 质量指纹谱的技术,已被成功地应用到上述三 类物质的定性鉴定上_s?,并以此技术为基础, 发展出了以分析测定其产生的次级代谢产物的 种类,从而快速,有效地鉴定枯草芽孢杆菌菌株 的实用新技术[6]. 本研究通过比较枯草芽孢杆菌F一1和F一2 胞外代谢物粗提液的HPLC谱图,找到F一2所 特有的代谢产物.并使用LC—MS和MALDI— TOFMS对其作进一步质谱分析,发现F一2的 特征代谢物包含两组分子量相差14Da(CH) 的代谢同系物.一组同系物的分子量依次为 1462.8,1476.8,1490.8,1504.8和1518.9,通过 质量指纹谱技术被鉴定为CFengycinB,为其 主要抗真菌物质.另一组同系物的分子量依次为 1432.8,1446.8,1460.8,1474.8和1488.9,与 Cl4_18FengycinA对应分子分子量相差2Da, 推测可能是FengycinA的一种异构体,其脂肪 酸碳链上具有一个双键.国内外尚未见此系同 系物的相关报道,具体结构与性质有待进一步 分析. 本研究还找到了抗真菌物质Fengycin在 HPLC测定中的特征出峰及保留时间,为今后 测定产Fengycin菌株抗真菌能力的强弱提供 了研究方向.另外,枯草芽孢杆菌F一2作为强抗 真菌物质Fengycin的产生菌,具有成为防治植 物丝状病原真菌生防菌的潜在特性,是一株极 具实际应用价值的菌株,其具体特性也有待进 一 步的研究. 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