反相高效液相色谱法测定利托那韦血浆药物浓度

反相高效液相色谱法测定利托那韦血浆药物浓度 反相高效液相色谱法测定利托那韦血浆药 物浓度 --—— 1434..——药物杂志ChinJPharmAnal2006,26(10) 反相高效液相色谱法测定利托那韦血浆药物浓度 胡玉荣,刘晓艳,阿有梅,张振中,乔海灵 (1.郑州大学药学院,郑州450052;2.郑州大学基础医学院,郑州450052) 摘要目的:建立人血浆中利托那韦的含量测定方法,用于其血药浓度测定并进行临床药代动力学研究.方法:采用反相高 效液相色谱一二极管阵列检测器分离测定血浆巾的利托那韦浓度.色谱条件:HypersilC柱(4.6mmx200mm,5Ixm),流动 相为0.05mol?L的磷酸盐缓冲液(pH=5.6)一乙腈(5O:50);流速为1.0mL?min,利托那韦的检测波长为210nm.9例 健康志愿者单剂量口服600mg利托那韦口服液,用高效液相色谱法测定给药后不同时间点血浆中利托那韦的浓度,计算其药 动学参数.结果:利托那韦在0.078—40.0Ixg?mL浓度范围内呈良好的线性,最低检测浓度为0.02Ixg?mL,.低,中,高 浓度的方法同收率分别为90.65%,98.60%,100.1%,RSD均小于5%.健康人体药动学研究,利托那韦的药一时曲线符 合一室模型.结论:本方法灵敏度高,专属性强,准确,简便,适用于利托那韦的人体药代动力学研究. 关键词:利托那韦;血药浓度;反相高效液相色谱 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254—1793(2006J10,1434—03 liP---HPLCdeterminationofritonavirconcentrationinplasma HUYu—rong,LIUXiao—yan,AYou—mei,ZHANGZhen—zhong,QIAOHai—ling (1.PharmaceuticalCoHegeofZhengLhouUniversity,Zhengzhou450052,China; 2.MedicineCollegeofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China) AbstractObjective:ToestablishanRP— HPLCmethodforthedeterminationofritonavirinhumanplasmaand applicationofpharmacokineticstudyofritonavirin9healthyvolunteers.Methods:RP— HPLCmethodwasused. TheseparationwascarriedoutusingHypersilC18(4.6mm× 200mm,5m)columnwithmobilephaseof0.05 mol?L,phosphatebuffer(pH5.6)一 acetonitrile(50:50)Theflowratewas1mL?min.Thedetectionwave— lengthforritonavirwas210nm.Asingleoraldose600mgofritonavirwasgivento9healthyma le.Results:Thelin— earrangeforritonavirwas0.078— 40.0g?mL(r=0.9999).Thelimitofdetectionforritonavirwas0.02g ?mL,.Therelativerecoverieswere90.65%,98.60%and100.1%.andRSDf0rintra— dayandinter—daywere bothlessthan5%.Thepharmacokineticanalysisofritonavirwasstudied.Itwasfoundtobefitt edtoaone—COB. partmentmode1.Conclusion:Themethodissensitive,accurateandsimple,andsuitableforth estudyonpharmaco— kineticofritonavirinbody. Keywords:fitonavir;concentrationinplasma;RP—HPLC 利托那韦(ritonavir)为人免疫缺损病毒(HIV) 蛋白酶的抑制剂,它可使病毒负荷明显降低,cD细 胞计数显着增高….利托那韦El服吸收好,与J衄清 蛋白的结合率约98%l2J.该药主要通过肝脏细胞 色素P450(CYP)氧化酶系统代谢,3A4酶 (CYP3A4)是参与该药代谢的主要同功酶.利托那 韦可以单独应用或与核苷类似物合用来治疗晚期 HIV感染'.利托那韦血药浓度测定方法及药动学 研究国内未见报道,而国外报道的方法较烦琐,因 此,我们建立了人体血浆中利托那韦的HPLC测定 方法,并对利托那韦在健康人体内的药动学进行了 实验研究.该方法灵敏,专一,准确,精密,简便,适 用于临床利托那韦血药浓度检测及其药代动力学研 究. 1仪器与药品 Agilent1100高效液相色谱仪系统:由G1315B 二极管阵列检测器,G1313A全自动进样器,Agilent l100高效液相色谱化学工作站组成,美国Agilent公 第一作者Tel:(0371)65209010;Fax:(0371)66658088;E—mail:huyr@zzu.edu.cII 药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(10)——1435--—— 司生产XW一80A型旋涡混合器,上海琪特分析仪 器有限公司;I'GL一16G高速台式离心机,上海博通 经贸有限公司生产. 利托那韦口服液(美国AbbottLaboratories,批号 16694AW21,80mg?mL);利托那韦对照品(厦门 迈克制药有限公司,含量为99.6%);甲醇,乙腈(色 谱纯,天津四友生物医学技术有限公司);磷酸二氢 钾(分析纯,天津市福晨化学试剂厂);试验用水为 新鲜双蒸水;窄白血浆(郑州市血液中心提供). 2色谱条件 色谱柱:HypersilCl8柱(4,6mm×200mm,5 m);流动相:0.05mol?L磷酸二氢钾(用磷酸调 pH至5.6)一乙腈(50:50);流速:1mL?min,;柱 温:25oC;检测波长:210nm;进样量:20L. 3对照品储备液的配制 精密称取利托那韦对照品1.0g,置100mL量 瓶中,乙腈溶解并定容摇匀,配成浓度为10mg? mL的储备液. 4血样预处理 取静脉血至肝素化试管中,3500r?min离心 10rain,分离出血浆,精密吸取0.5mL血浆于干净 试管中,再加入乙腈3mI,涡旋混合1rain,离心10 min(3500r?min),取上清液2mL于40?水浴 氮气吹干,残渣用100L流动相溶解,振荡1rain 混匀后精密吸取20L进样测定. 5工作曲线的制作 精密量取上述对照品储备液适量,分别加入 0.5mL空白血浆中,配成血浆浓度分别为0.078, 0.16,0.62,2.50,10.O0,20.O0,40.O0g?mL的 对照品血浆,按"4"项下操作,取20L进样,进行 HPLC分析.以测得的利托那韦峰面积(Y)对血浆 药物浓度(C)进行线性回归,得T作曲线方程: Y=0.0074C一0.0367r=0.9999(=5) 结果表明利托那韦的血药浓度在0.078,40.00g ?mL范围内呈良好的线性关系.最低检测浓度 为0.02g?mL,色谱图见图1. 6专属性 空白血浆,空白血浆加对照品(20.O0? mL)和给药后2h血浆样本,按"4"项下操作,得 色谱图见图2.可见在上述色谱条件下,利托那韦 的峰形对称,保留时间约为10min,且血浆中的杂质 不干扰样品的测定,因此本法具有良好的专属性. 7回收率与精密度 精密配制含利托那韦0.16,2,50,20.O0g? 1.f 罔1利托那韦最低检测浓度(O.02Ixg-一一?I..)高效液相色谱陶 FiglHPLCehromatogramoffitonavir(0.02Ixg?mL一) I.利托那韦(rilonavir) 051015t/min C 图2利托那韦高效液相色谱图 Fig2HPLCc|~omtograrasofritonavir A空白血浆(blankplasma)B.空白血浆中加入利托那韦(fitonavir inblankplasma)C.受试者口~][/600mg利托那韦El服液后2h的血 浆样本(humanplasma2h"afteroraladministration600mgritonavir) 1.利托那韦(ritonavir) mL的系列对照品血浆,各浓度均为5份,按"4" 项下操作;另配制相应浓度的对照品溶液,不经萃 取直接以等量进样,分别测其峰面积,两组峰面积 进行比较,计算血浆中利托那韦的提取回收率. 结果见表1. 精密配制低,中,高3种浓度为0.16,2.50, 20.00g?mL的对照品血浆各5份,按"4"项下 操作,以曲线方程计算出的检出鼍与加入量 的比值,求得方法回收率,并计算日内羞.以同样 的方法连续测定5d,计算13问差.结果见表1. 结果表明测得的13内及日问RSD均小于5%.可 见本方法有较好的准确性,符合生物样本测定方 法的要求. 一 1436一药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(10) 8稳定性试验 8.1提取后的样品稳定性试验取低,中,高3种 浓度为0.16,2.50,20.00-mL的质控血浆,按 "4"项下步骤处理后放于室温下自动进样器中,分 别在0,8,16,24h测定,比较不同时间测定的浓度. 结果利托那韦的浓度变化<4%表明血浆样品在 24h内稳定性良好. 8.2多次冻融试验配制低,中,高3种浓度的质 控血浆适量,即时测定;另一20cC冷冻保存,解冻测 定,连续3次,计算经3次冻融后利托那韦测定浓度 的变化.结果利托那韦的浓度变化<10%,表明血 浆样品经3次冻融后稳定性较好. 9志愿者血药浓度的测定 9例健康志愿者,汉族,男性,年龄(21.0?0.9) 岁;体重(63.5?7.0)kg;身高(172.7?3.9)cm.受试 者对试验过程及可能发生的不良反应表示理解并签 约姗睛同意书.试验经学校伦理委员会批准.受试 者试验前禁食12h(不禁水).于次日7:0o空腹单剂 量口服利托那韦口服液600mg,服药2h后方可再饮 水,4h后进统一餐.受试者于给药前,给药后0.5,1, 1.5,2,3,4,5,6,8,l2,24,36h取静脉血4mL于肝素 试管中,分离出血浆,一20?保存待测.按"4"项下 方法测定利托那韦在人体内的血药浓度并绘制平均 血药浓度一时间曲线,见图3.采用药物动力学处理 软件3P87程序对利托那韦的药时曲线进行拟合,求 算出药动学参数见表2.结果表明,本方法适用于测 定人血浆中利托那韦的浓度. 08162432t/h 图3单剂量口服利托那韦口服液600mg后人体内的药时曲线(n =9,.4-5) Fig3PlasmacOncentration—timecureofritonavirsolutionafteroral administrationof600nag 表2单剂量口服利托那韦口服液600mg后 人体内的药动学参数(=9.?) Tab2Pharmacokineticparametersofritonavirsolution inhealthyvolunteersafterasingleoral600mg 药动学参数(pharmacokineticpalameler~)i? Cm'/g?mL一 t【/h Auc?h?mI一 AUC;/w-h?mL tl~t,Jh tl/2k~h 20l?4.9 2.6士O8 197.5?32.8 198.2士35.3 0.3?0.2 5.6士0.7 }宴测值(1estvalue) 1O讨论 血浆中利托那韦的HPLC检测,国外已有报道J. 但提取方法较繁杂,多用固相萃取或HPLC—MS分析 方法,尚使用多种有机溶剂.本文的提取方法仅采用 乙腈进行血浆样品处理,不仅使提取过程简便易行且 灵敏度,选择性,精密度和准确度均符合生物样品分析 方法基本要求J,适用于该药的临床检测. 另据国外文献报道J:空腹口服600mg利托那 韦液体制剂后,c约19g?mL一,AUC约170g ? h?mL,,t1/2ke约5h.本研究中9名受试者的主 要药动学参数结果也与之相近,故本法亦适用于该 药的药动学研究. 参考文献 1DanielAH.Newdrugsof1996.ASAO,1997,37(2):198 2AmilcarT.AnacP,Koko0,eta1.Geticvariationandsusceptibilities top~teazeinhibitorsamongsubtypeBandfisolatesinbrazil.Antimi— crobAgentsChemother,1999,43(2):253 3PiscitelliS,He~erC,MinorJH,eta1.Druginteractionsinpatients infectedwithhumanimmunodeficiencyvirus.CtinInfectDis,1996,23 (4):685 4MarshKC,EidenE,DonMdEM.Determinationofritonavir,anew HIVproteaseinhibitor,inbiologicalsamplesusingreversed—phase high—performanceliquidchromatography.JChromatogrB,1997, 704:303 5HartmannC,SmeyexsV,MazsartDL,et口1.Validation0fbioanalytieal chromatographicmethods.JPharmBiomedAnal,1998,17(2):193 6GutierrezMM,Ros?bergJ,AbramowitzW.Anevaluation0fthepoten— tialforpharmacokineticinteractionbetweenescitalopramandthecyto- chromeP4503A4inhibitorritonavir.c2inTher,2003,25(4)..1200 (本文于2005年5月26日收到)