细胞分裂间期和分裂期ERK活性研究

细胞分裂间期和分裂期ERK活性研究 3 细胞分裂间期和分裂期 ERK 活性研究 史怀平 ,李芳 ,江中良 ,胡建宏 ,李青旺 ( ) 西北农林科技大学 动物科技学院 ,陕西 杨凌 712100 ( ) [ 摘 要 ] 【目的】研究分裂间期和分裂期细胞外信号调节蛋白激酶 ER K活性 ,以期了解细胞的生理活动 。( ) 【方法】培养 CO S7 、Hela2 H2B 和 Cho2E GFR 细胞 ,用有或无诺考达唑 Noco dazole处理后获得分裂期和分裂间期细 ( ) 胞 ;再用表皮生长因子 E GF或 A G1478 处理 ,分别收集分裂期和分裂间期细胞 ,裂解后制备蛋白样品 , SDS2PA GE 后 进行免疫杂交 ,检查蛋白的表达情况 。【结果 】细胞经 E GF 刺 激后 , E GFR 在分裂间 期和分裂期出现明显磷 酸化 。 ( ) MA P K 通路下游蛋白 ER K 磷酸化水平在分裂间期显著高于分裂期 P < 0 . 05。E GF 质量浓度可影响 E GFR 的活 性 ,但对 ER K 磷酸化并未产生明显的影响 ;在相同条件下 ,1 ng/ mL E GF 处理的 ER K 磷酸化水平与其他质量浓度的 ( μ) E GF 处理差异不显著 P > 0 . 05。0 . 5 mol/ L A G1478 可明显抑制 E GFR 活性 ,并导致 Hela2H2B 细胞的 ER K 磷酸 μ化水平降低 ;而 A G1478 浓度为 2 . 5 mol/ L 时 , CO S7 细胞的 ER K 磷酸化才明显被抑制 。【结论】E GF 介导的 ER K 磷酸化水平在细胞分裂间期高于分裂期 ;抑制 E GFR 活性后可影响 ER K 磷酸化 ,但这种作用存在细胞差异性 。 [ 关键词 ] 上皮生长因子 ; ER K ; A G1478 + () [ 中图分类号 ] Q556 . 9文章编号 ] 167129387 20110520001207 [ [ 文献标识码 ] A ER K a ctivit y in c ellula r int e rp ha se a nd mito si s S H I H uai2pi ng ,L I Fa ng ,J IA N G Zho ng2lia ng , H U J ia n2ho ng ,L I Qi ng2wa ng ( )Col le ge o f A ni m al S cience an d Tec h nol o g y , N ort h w est A & F U ni ve rsi t y , Y an g l i n g , S h aan x i 712100 , Chi na Abstract :【O bjective】Thro ugh t he i nve sti gatio n of ER K activit y i n cell ula r i nt erp ha se a nd mito si s i n re spo n se to E GF ,t he cell ula r p hysical c ha ract eri stic were mea sured . 【Met ho d】CO S7 , Hela2H2B a nd Cho2E GF R cell s were cult ure d. Af t er cell s were t reat e d wit h o r wit ho ut noco dazole ,i nt e rp ha se cell s a nd mito tic cell s were o bt ai ned . The n t reat ed wit h o r wit ho ut E GF a nd A G1478 ,t he cell s were collect ed a nd l ysat ed re2 sp ectivel y. The p ro t ei n e xp re ssio n wa s det ect ed t h ro ugh SD S2PA GE a nd i mmuno blo t ti ng.【Re sult 】Af t e r t he cell s were sti mulat ed wit h E GF , E GF R p ho sp ho r ylatio n i n cell i nt erp ha se a nd mito si s wa s i ncrea se d. ( A nd it wa s fo und t hat ER K p ho sp ho r ylatio n i n cell i nt erp ha se wa s hi ghe r t ha n t hat i n cell mito si s P < ) 0 . 05. E GF R p ho sp ho r ylatio n wa s aff ect ed by t he do sa ge of E GF sti mulatio n b ut ER K p ho sp ho r ylatio n al2 mo st no t . A nd unde r t he sa me co nditio n , ER K p hop ho r ylatio n i n re spo n se to 1 ng/ mL E GF wa s no t si gnifi2 ( ) ca nt co mp a re d wit h t hat i n re spo n se to o t he r co nce nt ratio n of E GF P > 0 . 05. E GF R activit y wa s si gnifi2 μca nt l y i nhi bit ed by 0 . 5 mol/ L A G1478 . Ne xt t he re sult s sho we d t hat ER K p ho sp ho r ylatio n of Hela2H2B μμcell s wa s i nhi bit ed i n re spo n se to 0 . 5 mol/ L A G1478 . Neve rt hele ss ,o nl y 2 . 5 mol/ L wa s t he co nce nt ra2 tio n of A G1478 , ER K p ho sp ho r ylatio n i n CO S7 cell s wa s si gnifica nt l y i n hi bit e d【. Co ncl u sio n】E GF2me dia2 t ed ER K p ho sp ho r ylatio n i n cell i nt erp ha se i s hi ghe r t ha n t hat i n cell mito si s. Do w n2st rea m ER K p ho sp ho2 r ylatio n a re aff ect e d af t er E GF R activit y i s i nhi bit ed ,t he re sult s of w hich a re diff e re nt i n diff ere nt cell s. 3 [ 收稿日期 ] 2010210214 ) ( 基金项目 陕西省自然科学基金项目 Key words :E GF ; ER K ; A G1478 [ 1 ] 1962 年 ,Co he n 等从小鼠颌下腺分离出一种 1 材料与方法( 多肽 ,命名为表皮生长因子 Epi de r mal gro wt h f ac2 ) to r , E GF。E GF 广泛存在于人体组织体液中 ,具有 1 . 1 材 料 ( ) 促进细胞增殖分化的功能 。E GF 受体 E GF R是具 鼠 抗 P P2ER K1/ 2 和 抗 体 和 化 学 试 剂1 . 1 . 1 有酪氨酸活性的跨膜糖蛋白 ,分子质量为 170 k u ,属 () Tubuli n 、羊抗 P2E GF R 1086购自 Sa nt a Cr uz Bio2 Er bB 家 族 成 员 之 一 。Er bB 家 族 共 有 4 个 成 员 : ( ( ) ) ( ) Er bB1 即 E GF R 、Er bB2 ne u , H ER2 、Er bB3 t ech 公司 。硝酸纤维素膜 N C 膜和结合第二抗体 [ 225 ] ( ) ( ) H ER3和 Er bB4 H ER4,它们结构相似 ,均由 的 H R P 购自 Bio2Ra d 公司 。ECL 试剂购自 Pie rce 胞外配体结合区 、单链跨膜区及高度保守的胞浆蛋 Che mical 公 司 。E GF 购 自 Up st at e Bio t ech nolo gy 白酪氨酸激酶区组成 ,这种结构既具有受体的功能 , 公 司 。Noco dazole 、Bla sti dici n 和 A G1478 购 自又具有 将 胞 外 信 号 直 接 转 化 成 胞 内 效 应 的 能 力 。 Cal bioche m 公 司 。DM EM 购 自 GIB CO 公 司 。其 E GF R 胞外域与配体结合后 ,可刺激其自身发生磷 他试剂除特别说明外 ,均购自 Si gma 公司 。 酸化及转磷酸化作用 ,通过胞内侧激酶反应将胞外 信号传至胞内 ,发挥其生理功能 。由于信号蛋白功 CO S7 细 胞 、Hela2H2B 细 胞 和 细胞1 . 1 . 2 能的多样性 ,活化后的信号蛋白可形成特异的多成 Cho2E GF R 细胞 ,置于体积分数 5 % CO2 、37 ?条件分信号复合物 ,激活多条信号途径 ,其中包括丝裂原 下培养 , 所 用 培 养 液 为 加 有 青 链 霉 素 和 体 积 分 数( ) 活化蛋 白 激 酶 MA P K途 径 、磷 酸 肌 醇 3 激 酶 5 %犊牛血清的 DM EM 。Hela2H2B 细胞培养时 ,还 [ 629 ] ( ) γ( γ) P I3 K途径和磷酸脂酶 C21 PL C21途径。 需 加 入 质 量 浓 度 为 2 ng/ mL 的 Bla stidici n ; Cho2 在 不 同 的 组 织 和 细 胞 系 中 , Ra s/ Raf / M E K/ E GF R 细 胞 培 养 时 , 还 需 加 入 质 量 浓 度 为 400 MA P K 信号途径介导着许多细胞的功能 ,如细胞增 μg/ mL 的 G418 。[ 10212 ] 殖 、分化 、转化和生存。E GF 激 活大 鼠肉 瘤蛋 1 . 2 E GF 对 ER K 磷酸化的影响( ) ( 白 Ra s是通过生长因子受体结合 蛋 白 2 Gro wt h 为了检测分裂期和分裂间期 CO S7 、Hela2H2B ) f acto r recep to r2bo und p ro t ei n 2 , Gr b2介导完成的 。和 Cho2E GF R 细胞 ER K 的磷酸化情况 , 将其在有 1068 1086 Gr b2 通过 Y和 Y位点直接与活化的 E GF R 结 ( ) 或无诺考达唑 200 ng/ mL 下处理 24 h 后 ,再用质 合 ,或者先与酪氨酸磷酸化的 Shc 结合后 ,再间接地 ( 量浓度 50 ng/ mL 的 E GF 分别刺激 0 即血清饥饿 [ 13214 ] 与活化的 E GF R 结合。在 Gr b2 与 Ra s 的鸟苷( ) ) S F,5 ,15 ,30 ,60 和 120 mi n ,然后分别收集分裂 ( ) 酸交换因子 So s结 合后 , 随 之转 移 到质 膜并 激活 期和分裂间期细胞 ,加细胞裂解液 ,制备蛋白样品 , [ 15216 ] Ra s , 启 动 Ra s/ Raf / M E K/ M A P K 信 号 途 径。 备用 。 ( ) 活化的 Ra s 使 Raf MA P K K K易位到质膜并激活 [ 17220 ] 取经有或无诺考达唑处理 24 h 的 CO S7 、Hela2( ) 之,随后活化的 Raf 磷酸化 M E K MA P K K。 ( ) H2B 细胞 ,用不同质量浓度 50 ,10 ,5 ,1 ng/ mL 的M E K 是少见的双特异性激酶 ,能使苏氨酸和酪氨酸 残基活化 。M E K 通过活化环中 Thr2Gl u2Thr 基序 E GF 处理 15 mi n ,同时设未经 E GF 处理的细胞为 ( 的磷酸化作用 ,使细胞外信号调节蛋白激酶 Ext ra2 对照 ,分别收集分裂期和分裂间期细胞 ,加细胞裂解 ) cell ula r si gnal2re gulat e d ki na se , ER K 磷 酸 化 。 液 ,制备蛋白样品 ,备用 。 ER K 是丝2苏氨酸 激 酶 , 有 50 个 以上 的底 物 , 其主 1 . 3 E GF R 活性受抑对 ER K 磷酸化的影响[ 21 ] 要功能是调节转录因子 c2Fo s 和 c2J un 的活性。 为了了解在 E GF R 活 性被 抑制 条件 下 分裂 期 虽然 E GF 刺激的细胞信号通路已被广泛研究 ,但仍 和分裂间期细胞 ER K 的磷 酸化 情况 , 将 培 养好 的 有许多问题没有解决 。本试验研究了分裂间期和分 裂期 CO S7 、Hela2H2B 和 Cho2E GF R 细胞 ER K 的 分裂间期 CO S7 和 Hela2H2B 细 胞 , 首先 用 不同 浓 磷酸化情况 ,旨在分析 MA P K 通路对细胞周期的影 ( 度 Hela2H2B : 0 . 001 ,0 . 005 ,0 . 01 ,0 . 05 ,0 . 1 ,0 . 5 ,响 为临床控制肿瘤及细胞增殖提供基础性材料 。 μμ) 1 ,2 mol/ L ; CO S7 :0 . 01 ,0 . 1 ,0 . 5 ,1 ,2 mol/ L 的 E GF R 活性抑制剂 A G1478 预处理 30 mi n ,同时设 未经 A G1478 处理 的细 胞 为 对 照 ; 再 用 50 ng/ mL 的 E GF 刺激 15 mi n ,收集细胞 ,加细胞裂解液 ,制备 蛋白样品 , 备用 。将 CO S7 和 Hela2H2B 细胞在 有 μ 或无 诺 考 达 唑 下 处 理再 用的 A G1478 预处理 30 mi n ,同时设未经 A G1478 处理ER K 磷酸化水平在分裂间期明显高于分裂期激的 () 的细胞为对照 ;最后用 50 ng/ mL 的 E GF 分别刺激 图 1 、2 、3 , P < 0 . 05;在分裂间期 ER K 磷酸化水平 ( 不同时间 CO S7 : 0 , 5 , 15 , 30 mi n ; Hela2H2B : 0 , 5 , 随 E GF 刺激细胞时间的延长基本呈下降的趋势 ,其 ) ( ) 15 mi n,同时设未经 E GF 处理的细胞为对照 ,分别 中 Hela2H2B 细胞 表现 尤 为突 出 图 2 ; 但 在分 裂 收集分裂期和分裂间期细胞 ,加细胞裂解液 ,制备蛋 期 , ER K 磷酸化水平却随 E GF 刺激细胞时间的延 白样品 ,备用 。 长而呈逐渐上升的趋势 ,如 CO S7 和 Cho2E GF R 细 () 为了能明显抑制 ER K 磷酸化 , 将培 养好 的分 胞 图 1 、3。总之 ,在 E GF 刺激下 , ER K 磷酸化水 (μ) 裂间期 CO S7 细胞用不同浓度 0 . 5 ,1 ,2 mol/ L 的 平在细胞分裂间期 高于 分 裂期 , 分 裂期 ER K 磷 酸 A G1478 预处理 30 mi n ,同时设未经 A G1478 处理 化被不同程度地抑 制 , 且 ER K 磷酸 化水 平 可能 与 的细 胞 为 对 照 ; 再 用 50 ng/ mL 的 E GF 刺 激 15 E GF 刺激细胞时间的长短有关 。 mi n ,收 集 细 胞 , 加 细 胞 裂 解 液 , 制 备 蛋 白 样 品 , 备 2 . 2 E GF 质 量 浓 度 对 分 裂 间 期 和 分 裂 期 细 胞 用 。将经有或无诺考达唑处理 24 h 的 CO S7 细胞 ER K 磷酸化的影响 μ用 由图 2 . 5 mol/ L 的 A G1478 预处理 30 mi n , 同时设 4 和图 5 可知 , 在 CO S7 、Hela2H2B 细 胞 未经 A G1478 处 理的 细 胞 为 对 照 ; 再 用 50 ng/ mL 分裂间期和分裂期 , E GF R 磷酸化水平均随 E GF 质 量浓度的降低而呈 下降 趋 势 , 而 ER K 磷 酸 化水 平 的 E GF 分别刺激 0 ,5 ,15 ,30 mi n ,同时设未经 E GF 处理的细胞为对照 ,分别收集分裂期和分裂间期细 并未随 E GF 质量浓度的降低而下降 ,不同质量浓度 ( 胞 ,加细胞裂解液 ,制备蛋白样品 ,备用 。E GF 引 起 的 ER K 磷 酸 化 水 平 差 异 不 显 著 P > ) 1 . 4 ER K 磷酸化水平的检测0 . 05。这 说 明 , 当 E GF 质 量 浓 度 为 1 ng/ mL 时 , ER K 就能 极 大 地 发 生 磷 酸 化 , 细 胞 由 此 开 通 了 将 上 述 制 备 的 蛋 白 样 品 经 7 . 5 % , 10 % 的 SD S2PA GE 电泳后 ,电转到 N C 膜上 ,然后在封闭液 MA P K 通路 。 中封闭 30 mi n 。将转有蛋白的 N C 膜分别在含有 ( ) Tu buli n 、P P2ER K1/ 2 、P2E GF R 1086第 1 抗体的 封闭液中作用过夜 ;洗掉未结合的第 1 抗体后 ,加带 有 H R P 的抗羊和抗鼠的第 2 抗体作用 1 h ;洗掉未 结合的第 2 抗体 ,加 ECL 试剂作用 5 mi n ,根据检查 蛋白的含量 ,在暗室对 X2光片适当曝光 , 洗片后观 察结果 。 1 . 5 数据统计分析 所有试验至少重复 3 次 。蛋白条带通过 Ima ge J 软件进行分析 , 获得的数据用于评价蛋白的表达 ( ) 水平 。数据用“平均值 ?差 Mea n ?S E”表示 , 并采用 SP SS16 . 0 软件进行差异显著性分析 。 2 结果与分析 2 . 1 E GF 作 用 时 间 对 分 裂 间 期 和 分 裂 期 细 胞 ER K 磷酸化的影响 图 1 E GF 作用时间对分裂间期和分裂期 CO S7E GF 通过与 E GF R 结合使 E GF R 激活并转变 细胞 ER K 磷酸化的影响 + . 表示进行该项处理 ; - . 表示不进行该项处理 ; ( ) 为磷 酸 化 E GF R P2E GF R , 从 而 启 动 MA P K 通 ( ) 柱状图上标不同小写字母表示差异显著 P < 0 . 05。下图同 路 , 导 致 细 胞 发 生 生 物 学 反 应 。本 试 验 发 现 , 用 Fig. 1 ER K p ho sp ho r ylatio n in interp ha se and mito si s of E GF 刺激 CO S7 、Hela2H2B 和 Cho2E GF R 细胞后 , CO S7 cell s in re spo nse to diff erent E GF2t reated time ( E GF R 在分裂间期和分裂期被明显磷酸化 图 1 、2 、+ . Mea n s t reat ed ; - . Mean s unt reat ed ; The val ue s wit h ) 3,这将影 响 到下 游蛋 白 的活 性 。研 究还 发 现 , 在diff erent let t er sup er scrip t s i n t he hi sto gra ms mea n ( ) significa nt diff erence P < 0 . 05. The sa me a s belo w E GF 刺激下 , ER K 在分裂间期明显被磷酸化 ,而分 裂期磷酸化水平很低 。统计分析结果表明刺 图 2 E GF 作用时间对分裂间期和分裂期 Hela2 H2B 作用时间对分裂间期和分裂期 Cho2E GFR E GF 图 3细胞 ER K 磷酸化的影响 细胞 ER K 磷酸化的影响 Fig. 2 ER K p ho sp ho r ylatio n in interp ha se a nd mito si s of ER K p ho sp ho r ylatio n in interp ha se a nd mito si s of Fig. 3 Hela2H2B cell s in re spo nse to diff erent E GF2t reated ti me Cho2E GFR cell s in re spo nse to diff erent E GF2t reated time 图 5 E GF 质量浓度对分裂间期和分裂期 Hela2 H2B 细胞 图 4 E GF 质量浓度对分裂间期和分裂期 CO S7 细胞 ER K 磷酸化的影响 ER K 磷酸化的影响 Fig. 4 ER K p ho sp ho r ylatio n in interp ha se a nd mito si s of Fig. 5 ER K p ho sp ho r ylatio n in interp ha se a nd mito si s of CO S7 cell s in respo nse to diff erent co ncent ratio ns of E GF Hela2H2B cell s in re spo nse to diff erent co ncent ratio ns of E GF ( ) 异显著 P < 0 . 05 。说 明 在 A G1478 浓 度 不 小 于2 . 3 E GF R 活性受抑对细胞 ER K 磷酸化的影响 由 图 6 可 知 , 当 A G1478 浓 度 不 小 于 0 . 01 μ0 . 01 mol/ L 时 , E GF R 活性即被抑制 。μmol/ L 时 ,CO S7 细胞 E GF R 磷酸化水平降低 , 与 μ 由图 8 可知 ,在 0 . 5 mol/ L A G1478 抑制 E G2( μ) 对照 差 异 显 著 P < 0 . 05 , 而 且 0 . 01 mol/ L ( F R 活性后 , Hela2H2B 细胞 ER K 磷酸化被抑制 图A G1478 处理的 E GF R 磷酸化水平与其他 A G1478 ) 8B,但 是 在 CO S7 细 胞 中 , 分 裂 间 期 和 分 裂 期 的( ) 处理也存在显著差异 P < 0 . 05。由图 7 可知 , 在 Hela2H2B 细胞 中 , 当 A G1478 浓 度 不 小 于 0 . 005 () ER K 磷酸化几乎未受影响 图 8A。μmol/ L 时 , E GF R 磷酸化水平降低 ,与对照相比差 μ由图 9 可知 ,当 A G1478 浓度为 2 mol/ L 时 , ( 分裂期 CO S7 细胞 ER K 磷酸化水平明 显降 低 图 μ) ) 9A。在 A G1478 浓度为 2 . 5 mol/ L 时 ,分裂间期9B。 ( 和分裂期 CO S7 细胞 ER K 磷酸化被明 显抑 制 图 浓度对分裂间期 Hela2 H2B 细胞 A G1478 图 6 A G1478 浓度对分裂间期 CO S7 细胞图 7E GFR 磷酸化水平的影响 E GFR 磷酸化水平的影响 Fig. 6 E GFR p ho sp ho r ylatio n in t he interp ha se of CO S7 Fig. 7 E GFR p ho sp ho r ylatio n in t he interp ha se of Hela2 H2B cell s in respo nse to diff erent co ncent ratio ns of A G1478 cell s in re spo nse to diff erent co ncent ratio ns of A G1478 μ 图 8 0 . 5 mol/ L A G1478 作用下 E GF 刺激时间对分裂间期和分裂期 CO S7 、Hela2H2B 细胞 ER K 磷酸化的影响A . CO S7 细胞 ;B . Hela2H2B 细胞 Fig. 8 ER K p ho sp ho r ylatio n in t he i nterp ha se and mito si s of CO S7 a nd Hela2H2B cell s i n μre spo nse to 0 . 5 mol/ L A G1478 wit h diff erent E GF2t reated time A . CO S7 cell s ;B . Hela2H2B cell s ( ) 图 9 CO S7 细胞中抑制 ER K 活性的 A G1478 浓度检测 A及高浓度 A G1478 对分裂间期和()分裂期 CO S7 细胞 ER K 磷酸化的影响 B ( ) Fig. 9 The co ncent ratio n of A G1478 inhibiting ER K activit y in CO S7 cell s Aa nd ER K p ho sp ho r ylatio n in ()interp ha se and mito si s of CO S7 cell s in re spo nse to high2co ncent ratio n A G1478 B 裂间期和分裂期存在差异 。在分裂间期 , MA P K 通3 讨论路下游蛋白 的 ER K 磷酸 化 在 E GF 影响 下 有所 增 强 ,而分裂期 E GF 并未使 ER K 磷酸化得以增强 ;并 目前研究发现 , E GF 介导的信号通路在细胞分 且 , ER K 磷酸化在分裂间期与分裂期存在显著性差下降 ,而 CO S7 细胞的 ER K 磷酸化水平受到的影响 不明显 。有研究表明 ,抑制剂对蛋白活性的抑制效 异 。本研究中 ,在用不同浓度的 E GF 处理细胞后发 [ 33234 ] 果存在剂量依赖性。本研究检测了影响 CO S7 现 ,1 ng/ mL 的 E GF 可以极大地激活 ER K 磷酸化 , 细胞 ER K 活 性 的 最 适 A G1478 浓 度 , 结 果 发 现 当 其磷酸化水 平与 50 ng/ mL E GF 处 理差 异不 显著 μA G1478 浓度为 2 mol/ L 时 , ER K 活性 出 现较 明 ( μ) () P > 0 . 05。在细胞被 A G1478 0 . 01 mol/ L 处理 μ显的下降 。于是本研究用 2 . 5 mol/ L A G1478 处 理 CO S7 细胞 ,结果发现分裂期及分裂间期 ER K 磷 后 , E GF R 磷酸化显著被抑制 。本研究结果还发现 , 酸化水平均极大下降 。因此 ,笔者认为 ,抑制剂对一 μ0 . 5 mol/ L A G1478 可 明 显 抑 制 Hela2H2B 细 胞 个信号链中的蛋白抑制存在差异 ,上游蛋白活性降 μER K 磷酸化 ,而 2 . 5 mol/ L A G1478 才可使 CO S7 低后未必会导致下游蛋白活性的下降 ,这预示蛋白 细胞的 ER K 磷酸化水平降低 。 对外界的刺激反应程度不同 ,也可能处在一个复杂 在 E GF 介导的信号通路中 ,很重要的起始阶段 的信号网中 。所以 ,要使信号链中的重要蛋白的活 是 E GF 对酪氨酸蛋白激酶的激活 。酪氨酸激酶是 性明显下降 ,选择特异性抑制剂是必需的 。 一种能将 A T P 磷酸基转移到细胞蛋白的酶 ,这可使 总之 ,本研究结果证实 , ER K 磷酸化在细胞分 相邻下 游 蛋 白 被 激 活 以 至 完 成 所 参 与 的 信 号 调 裂间 期 和 分 裂 期 是 不 同 的 。抑 制 E GF R 活 性 后 , [ 22 ] 控。E GF 可 使 E GF R 磷 酸 酪 氨 酸 残 基 自 磷 酸 ER K 磷酸化水平也将下降 ,但这种作用存在细胞差 化 ,提供胞质分子结合的位点 ,将膜受体信号传递到 异性 ,其原因还需进一步研究 。[ 23 ] 胞质 ,调节细胞活动。本试验结果表明 ,经 E GF 刺激后 ,分裂间期和分裂期细胞 E GF R 均发生明显 的磷酸化 ,这将可能启动 MA P K 通路 。本研究通过 [ 参考文献 ]检查 ER K 磷酸化水平发现 ,在细胞分裂间期 ER K [ 1 ] Co hen S. Isolation of a mouse submaxillary gland prot ein accelera2 磷酸化水平很高 ,而在分裂期磷酸化水平极低 ,2 个 ting inci sor eruption and eyelid opening in t he new2born animal [J ] . 时期存在明显的差异 。据此分析 ,由于 MA P K 通路 J Biol Chem ,1962 ,237 :155521562 . [ 24 ] 对分裂间期非常重要,因此细胞在分裂间期开放 Kraus M H , Issing W , Miki T ,et al . Isolation and charact erization [ 2 ] 了 MA P K 通路 。然而 ,分裂期细胞由于失去跨膜信 of ERBB3 ,a t hird member of t he ERBB/ epider mal growt h factor [ 25 ] receptor family : Evidence for overexp ression in a subset of human 号 ,MA P K 通路 极 大 地 被 阻 止, 进 而 ER K 活 性 [ 26 ] ( ) mammary t umor s [ J ] . Proc Natl Acad Sci U SA , 1989 , 86 23 : 被抑制,这可能也是细胞为即将到来的细胞分裂 919329197 . 准备必需的能量 。 Plo w ma n G D , Culo u sco u J M , Whit ney G S ,et al . Liga nd2sp e2 [ 3 ] E GF 刺激后 ,细胞会启动 MA P K 通路 ,这将激 cific acti vatio n of H ER4/ p180er bB4 , a fo urt h me mber of t he 活 ER K。前人研究发现 ,当 E GF 为 10 ng/ mL 时 , epider mal gro wt h f acto r recep to r f a mil y [ J ] . Proc Nat l Acad [ 27 ] ( ) Sci U SA ,1993 ,90 5:174621750 . 可引起 ER K 明显磷酸化。本研究发现 , 用质量 [ 4 ] Yarden Y , Sliwkowski M X. Untangling t he Er bB signaling net2 浓度不小于 1 ng/ mL 的 E GF 处理细胞后 , 均可导 () wor k [J ] . Nat Ret Mol Cell Biol ,2001 ,2 2:1272137. 致 ER K 的激活 ,而且各处理间的 ER K 磷酸化水平 Citi A , Ya r den Y. E GF2ERBB signalli ng : To wa r ds t he syst em [ 5 ] ( ) 无显著差异 P > 0 . 05。但同时也 发现 , E GF R 活 ( ) level [J ] . Nat Rev Mol Cell Boil ,2006 ,7 7:5052516 . 性随 E GF 质量浓度的降低而呈下降趋势 。因此 ,可 [ 6 ] Ull rich A , Schle ssi nger J . Signal t ra n sductio n by recep to r s wit h ( ) t yro si ne ki na se activit y [J ] . Cell ,1990 ,61 2: 2032212 . 作出假 设 , 用 1 ng/ mL E GF 刺 激 细 胞 时 , 激 活 的 A nder so n D , Koch C A , Grey L ,et al . Bi ndi ng of S H2 do mai n s [ 7 ] E GF R 能充分使 ER K 磷酸化 ,开通 MA P K 通路 ,并 of p ho sp holipa se C ga mma 1 , GA P ,a nd Src to activat ed gro wt h 发挥细胞效应 。 ( ) f acto r recep to r s [J ] . Science ,1990 ,250 4983:9792982 . 蛋白抑制剂常被用来抑制信号蛋白活性 ,以研 [ 8 ] Koch C A , A nder so n D , Mo ra n M F , et al . S H2 a nd S H3 do2 究与其相关的分子的作用机理 。用抑制剂抑制蛋白 mai ns : Ele ment s t hat co nt rol i nt eractio n s of cytopla smic signa2 ( ) li ng p rot ei ns [ J ] . Science ,1991 ,252 5006:6682674 . () 如 E GF R活性后 ,可使许多癌症发生得以控制 ,如 [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] Paw so n T. Prot ei n mo dule s a nd si gnali ng net wo r k s [ J ] . Na2 [ 9 ] 鼻咽癌、胃癌、乳腺癌、平滑肌瘤等 。究 ( ) t ure ,1995 ,373 6515: 5732580 . 其原因 ,主要是因为抑制剂干扰了细胞信号通路中 [ 10 ] Ni shi da Y. Functio n of Raf / MA P ki na se ca scade i n t he regu2 [ 31232 ] 相关信号蛋白的活性 ,使细胞不能增殖。本研 latio n of cell ula r p rolif eratio n a nd diff erentiatio n [ J ] . Ta np a2 μ究发现 ,0 . 5 mol/ L 的 A G1478 可明显抑制 E GF R kushit su Ka ku sa n Ko so ,1996 ,41 :167321679 . 2 的活性 并导致细胞的磷酸化水平 ) ()( ) ([ 24 ] na se 3 ML K3i n B2Raf activatio n a nd Cell p rolif eratio n [J ] . 2/ 2/ S6 K2 2/ 2 Pende M , U m S H , Mieulet V , et al . 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