【doc】四唑盐比色法测定血清黄嘌呤氧化酶

【doc】四唑盐比色法测定血清黄嘌呤氧化酶 四唑盐比色法测定血清黄嘌呤氧化酶 二7_7—277 第28卷第3期 l993年 河南医科火学 30URNALOFHENANMFDICALUNIVERS1TY 四唑盐比色法测定血清黄嘌呤氧化酶 王诗蔓堂—钱书虹史安利(河南省临床检验中心) 关键词;塞堡墨堡墼 黄嘌呤氧化酶(ECI,2,3,2 色 广泛分布于人体心,肺,肝等组织细胞浆内, 以小肠粘膜最为丰富,血清XOD主要来自肝 细胞.XOD分子中含有八个硫化物,两个 FAD与钼原子.在催化黄嘌呤和次黄嘌呤转 变为尿酸时可产生超氧离子.当心肌,肺,小 肠等组织缺血,病毒性肝炎等疾病时组织酶 活性升高致自由基生成过多组织受损,血清 酶活性也有改变.目前对XOD活性的改变和 疾病发生机理的关系日益重视.以往文献报 道血清酶活性测定法多需精密仪器且手续繁 杂,为此我们修改与建立一简便易行可靠的 比色法. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1试剂与仪器:黄嘌呤(上海制药厂), 还原型辅酶I(NADHBochriegerMannheim Gm6H),吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS中国科学 院上海生物化学研究所),硝基四氯畦蓝 (NBT上海前进试剂厂),磷酸氢二钾与磷酸 二氢钾(北京红星化工厂),曲拉通X一100(上 海化学试剂厂Rohn—m~)ss进口分装),UV260 分光光度汁. 1.1.2对象:健康人53倒其中男32倒,女 2l倒,年龄20岁至60岁. 1.2方法酶促反应体系中含血清0.Iml, I.66X10mol/L黄嘌呤磷酸缓冲液2ml, 显色剂(含0.652mmol/LPMS与I.226 mmol/LNBT)0.2ml,总体积为2.3ml,用曲 拉通x—100为增溶剂,37?孵育15mitt,加入 ?安阳市第二^民医跪 ,欠7. 0.35mmol/L盐酸2ml终止酶的活性.标本 空白用oH8.0,0.1mol/L磷酸盐缓冲液2 ml代底物液.比色波长530nm.血清XOD活 性单位定义;I升血清与黄嘌呤在37?中作 用,每分钟能使l~tmol/LNBT还原为甲腊的 酶活性为l单位(u/L).计算公式: 血清XODU/L= 显色剂用量(L)×显色剂浓度(retool/L)×1000 0.1×l0/L×I5 2结果 2.1酶动力学中某些因素的观察 2.1.1底物浓度与反应速度:选黄嘌呤为底 物配成19种不阿浓度的底物磷酸盐缓冲液 (0.059×10,35.76X10tool/L),测定同 一 血清XOD活性,结果显示在低浓度区 (0.059×10,1.78X10,tool/L),反应速 度与底物浓度的关系遵循米氏方程,Km为 I.28×10.mol/L反应速度在底物为1.78 X10,4.47×10mol/L范围内减慢,当 底物浓度高于1.78xlomol/L时,溶液中 出现沉淀. 2.1.2DH的影响:文献报道用黄嘌呤磷酸 盐缓冲液测定酶活性其晟适pH不同(7.3, 8.3)[,作者用10种不同pH(7.2,l0.0)黄 嘌呤磷酸盐缓冲液测定血清XOD活性的oH 曲线,以标本吸光度减去标本空白吸光度后, 酶活性最适pH为8.0. 为进一步观察oH对甲曙呈色及标本中 非特异性物质的影响,用分光光度计将6种 pH底物液和血清反应的标本管与标本空白 管进行扫描,它们的光吸收曲线明在pH ? 277? .吣 州 医科大学1993年第28 7.8以F标本管的吸光度随波长变短而升 高.pH8.08.2,8.4,l0.0时最大吸收值依 次为526,526,534,544Hrfl.标本空白管吸光 度在pH8.0以r最低,非特异反应影响最 小,pH8.2以上时吸光度显着升高,pH8.4 , 10.0时吸收峰值为540nm,为此在测定酶 活性时应选用530nm波长. 本实验观察了不同pH对反应体系中含 与不含PMS的呈色影响,作者用9种不同 pH(7.4,9.6)黄嘌呤磷酸盐缓冲液进行了 试验,获得了两条酶活性不同,形状相似的 pH曲线,反应体系中含PMS者酶活性明显 高于不含PMS者. 2.1.5酶浓度与反应速度:将同一血清稀释 成不同浓度,按I=:步骤测定酶活性,表明血清 酶活性在45u/L以F时酶活性与反应速度 呈线性关系(r=0.9999). 2.2实验条件的选择 2.2.1标准曲线:根据Nachas_等【报道和 酶活性单位的定义.配制一系列浓度的NBT 显色剂(相当于血清酶活性32.6,65.2, 97.8,130.4,1630U/L)分别与NADH作用, NBT还原量(~rnol/L)与吸光度关系为Y= 112.35b+0.0088 2.2.2光吸收曲线:白各标本管吸光度扣除 空白管后,吸收峰值为530Drfl与文献E2.53报 道,致. 2.2.5显色剂中PMS与NBT浓度的选择: ?PMS浓度:以6种浓度PMS(0.326, 3.9lmmol/L)的显色剂0.2ml进行显色反 应,标本管与标本空白管的吸光度均随PMS 浓度增大而升高,扣除空白后,表明PMS浓 度在0.326,】.304mmoll/L范围内测得酶活 性值最大,非特异反应影响最小,本法选用 O.652mmol/L.?NBT浓度:本法选用7种浓 度NBT的显色剂,显色后在】.226, 2.452mmol/L范围内呈色水平高,非特异反 应小.认为采用1.226mmol/L为适宜.?曲 拉通X一100浓度:本文观察了白蛋白与不同 :程度曲线拉通x—l00对反应体系呈色反应 ? 278? 的影响,两种化合物均能使溶维成为均匀稳 定的腔体,以曲拉通X一1OO制成5种浓度 (0.2,0.4,0.6,0.8与1.O)溶液, 呈色娃示曲拉通x一100浓度增高.标本管与 空白管的吸光度随之升高,对后者干扰作用 更为明显,作者认为以0.4做为测定血清 酶活性的浓度为佳. 2.5方法学中某些指标的溯定 2.5.1呈色稳定性:本法呈色后避光保存, 色洋在3h内保持不变 2.5.2重复试验:取血清平行测定1O次,酶 活性3.33U/L时批内CV为5.酶活性 l5.07U/L时为4.64. 2.5.5非特异反应试验:本试验原理基于氧 化还原反应,可受血清中某些还原性物质的 影响,作者在试管的反应体系中加不同量的 半胱氨酸与还原型谷胱甘肽,以观察其对测 定酶活性时的影响程度.结果表明两种化台 物对空白影响大于标本管,其总效应使测得 酶活性偏低. 2.4参考值男32例血清XOD活性为 0.921士O.8U/L.女21例.1.007士0.94U/ L,无性别问差异(P>O.05),53例健康人参 考值为0.969士0.900U/L. 5讨论 XOD为一种非特异性需氧脱氢酶,可作 用于多种底物如嘌呤,嘧啶,蝶啶类等化合 物,其中以黄嘌呤和次黄嘌呤为主,对其催化 反应速度最快.次黄嘌呤经催化两步反应生 成琢酸,而黄嘌呤仅一步反应若以次黄嘌呤 为底物其浓度高于lmmoi/L时可致中间产 物积蓄影响酶活性测定为此我们选用了黄 嘌呤底物浓度在0.059×l04,1.78×10 moi/L范围内反应速度干【『底物浓度服从米氏 方程,Km为1.28×1Omoi/L,本法选用l3 Km黄嘌呤为测定酶活性的底物浓度,获得 反应速度为Vm的92.4 磷酸盐缓冲液的pH对酶活性,四唑盐 的转变,甲婿的呈色,非特异性反应均有影 第28卷第3期河南医科大学V0I28+NO.3 1993年JOURNALOFHENANMEDICALUNIVERSITY1993 响:?血清中存在某些还原性物质(如糖, SH基化台物)和PMSNBT显色则产哇非特 异性反应,在碱性溶液巾更为着.奉实验结 果对此进一步证实.?NBT的氧化还原电位 为一0.05Vl.易被还原+pH愈高还原速度 愈快,能自发地转变为紫色至蓝色化合物.? 双四氮唑盐可生成单甲嚼与双甲睛.前者呈 黄红色,后者为蓝,黑色,这两类甲婿的形成 与介质的pH有密切关系?,本实验结果表明 在不同pH介质中底物经酶作用生成甲艚的 最大吸光度;在pH7.2,7.6环境中位于蓝 色区,pH8.0,8.2为526nm,pH10.0为 540rim.在pH11环境中+溶液色泽呈蓝黑 色,此结果与文献报道一致[s.73. 血清)COD在含与不含PMS,不同pH反 应体系作用后+得出两条形状相似的pH曲 线,用不含PMS显色剂测酶活性仅为含PMS 的l/3,结果表明黄嘌呤分子中的e电子转 移在XOD作用下经过两条途径:?由PMS 递体转移至NBT;?在PMS不存在情况下由 其他氧化还原链中某些成分传递一. 甲艚溶解度小易于沉淀,在反应介质中 加入明胶,白蛋白,EDTA],吐温一80,曲拉通 x一1001等作增溶剂后,使溶液呈胶体状,且 能促使PMS—NBT的氧化还原反应,防止还原 型PMS重被氧化E2,73,本实验表明以曲拉通 x—l00最为适宜 PMS曝露在目光下3,5min溶液由淡 黄变绿,后棕色再转变为紫色,其原因可能为 半醌式化合物形成所致],为此应避光并在 低温F保存.高浓度PMS溶液在一4c中贮 存2个月不变质. 参考文献 1MajklcN.Spectroohotometricassayofxanthine0x1一 dasewRh2.2一azin~dl(3一ethylberztlfazolble一6 suphonate)(ABTS)aschromogen.ClinChimAeta. 1987.162:29 2FriedR.Colorimet6r把determmationofxanthinede hydrogenasebytetrazoliumreactionAnalBiochem. 1966.16:27 3吴晓生.比色法测定黄嘌呤氧化酶.生物化学与 生物物理进展.1986,5:55 4NachasMM+MarguilesSIandSdiignanAM-Acol- orimetricmethodforestimationofsuccinicdehydro- genaseactivity,JBiolChem.1960+235:499 5方丁主编.同工酶在医学上的应用.第1版.北 京;人民出版社.1982.51 6吴果诚,叶耀征.张建国+等.乳酸脱氢酶"非脱氢 酶效应的探讨中华医学检验杂志,I983+6:32 7陈惠黎主编.生物化学检验技术.北京:人民卫生 出版社.]990.197 (1992?03?O5收稿) 互隔交链孢霉毒素诱发人胎食管上皮组织c—Ha—ras点突变的研究 董伟华郑智敏刘桂亭(河南医科大学希理生理学教研室) 林达许道松马涧泉(中山医科大学生物化学教研室) 体外培养的^胎儿食管上皮组织经互隔交链孢 霉毒素AME或AOH短时同(4h)处理后.提取该组 织高分子量DNA;同时提取未经处理的^胎儿食管 上皮组织DNA(空白对照)以及食管癌组织和癌旁组 织DNA.提取的高分子量DNA作为模板进行PCR反 应.扩增含c-Ha—ras癌基因第12位密码子的104bp 片段该片段中第12位密码子处存在限制性内切酶 Hpa?的酶切位点.扩增产物经HpaI酶解反应后进 行琼脂塘凝胶电泳分析结果电泳结果显示.经Hpa I酶解后+空白对照组,癌组织和癌旁组织DNA的特 异性扩增产物104bp片段消失,经AME,AOH处理 的人胎食管上皮组织DNA的扩增产物一1O4bp片段 仍然存在.结果说明,AME,AOH短时间作用后.人胎 食管上皮组织e-Ha?ras基因l2位密码子发生了突 变;Ha-ras基因突变可能是癌变过程中的"早期事 件";AME和AOH在_人食管癌发生中的作用以及分 子生物学作用机制值得深入探讨. ? 279?