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甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响

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甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响 甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原 表达的影响 中华眼底病杂志2002年12月第18卷第4期ChinJOculFundus— Dis,December20 — 02,Voi18,No.4 甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中 Mtiller细胞胶质纤维酸性蛋白和 增生细胞核抗原表达的影响 翟黎东何守志张笑呜 299 ? 实验研究? 【摘要】目的研究甲泼尼龙对视网膜激光损伤...
甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响
甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响 甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原 表达的影响 中华眼底病杂志2002年12月第18卷第4期ChinJOculFundus— Dis,December20 — 02,Voi18,No.4 甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中 Mtiller细胞胶质纤维酸性蛋白和 增生细胞核抗原表达的影响 翟黎东何守志张笑呜 299 ? 实验研究? 【摘要】目的研究甲泼尼龙对视网膜激光损伤后MOiler细胞胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidicprotein,GFAP)和增生细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的影响.方法4O只 Sprague—Danley(sD)大鼠随机分为治疗组和对照组,治疗组大鼠在视网膜激光光凝损伤后连续3d腹腔注 射剂量为30mg/kg的甲泼尼龙,对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水;分别于激光光凝术后3,7,l4,28d各 处死5只动物,取出眼球,用AFA固定液进行组织固定后做石蜡包埋,切片,用免疫组织化学方法测定 GFAP和PCNA的表达.结果激光光凝损伤后3d,治疗组和对照组视网膜MOiler细胞均表达 PCNA,治疗组PCNA表达明显较对照组弱,3d后PCNA表达消失;激光光凝损伤后3d,治疗组和对照 组视网膜MOiler细胞均表达GFAP,在各时间点治疗组GFAP表达明显较对照组弱.结论甲泼尼龙可 减轻MOiler细胞激光损伤后PCNA和GFAP的表达,最终影响视网膜激光光凝损伤的瘢痕修复,这为研 究视网膜激光损伤和防护的机制提供了实验证据. 【关键词】纤维蛋白/分析;增殖细胞核抗原;视网膜/病理学;MOiler细胞;甲泼尼龙; 动物,实验 中图分类号:R774.12R362—23 TheeffectofmethyIprednisoIoneontheexpressionofglialfibrillaryacidicproteinandproliferatingcell nuclearantigeninMOilercellsofratsretinaeinjuredbylaserzHAILidong,HEShouzhi,zHANG Xiaoming.DepartmentofOphthalmology,GeneralHospitalofPLA,Be诤ng100853,China [Abstract]0bjectiveToinvestigatetheeffectofmethylprednisoloneontheexpressionofglialfib— rillaryacidicprotein(GFAP)andproliferatingeellnuclearantigen(PCNA)inMOilercellsofrats’retinae injuredbylaser.MethodsFortySDratswererandomlydividedintotwogroupsandinflictedwithlaser photoc0agulation.Theratsintreatmentgroupweregivenmethylprednisolonebyintraperitonealinjection withadoseof30mg/kgfor3days.Atthe3rd,7th,14th,and28thdayafterphotocoagulationrespectively, theeyeswereenucleated,fixedandcutintosections.ImmunohistochemicalexaminationwasusedtOdetect theexpressionofPCNAandGFAP.ResultsAfterphotocoagulationtheMOilercellsexpressedPCNA bothinthetreatmentandcontrolgroup,andtheexpressionofPCNAdecreasedsharplyafter3days.The expressionofPCNAintreatmentgroupwaslessthanthatincontrolgroup.Afterphotocoagulationthe MOilercellsalsoexpressedGFAPandtheexpressionofGFAPlastedforatleast28days.andtheexpres— sionofGFAPexpressioninthetreatmentgroupwaslessthanthatinthecontrolgroup.Conclusion MethylprednisolonecanreducetheexpressionofGFAPandPCNAinMOilercellsofrats’retinaeinjured bylflser. [KeywordslFibrin/analysis;Proliferatingcellnuclearantigen;Reitna/pathology; Moilercell;Methylprednisolone;Animals,laboratory 激光光凝治疗后常发生视网膜色素上皮(retinal pigmentaryepithelium,RPE)下的纤维增生膜,导致 光斑扩大,而这种纤维增生膜主要由肥大增生的 Mailer细胞的突起构成l1].胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)是Maller细胞骨架蛋白,在损伤后才表达, 并与Mailer细胞的肥大,增生和迁移有关系[33.在对 基金项目:全军”十五”医药卫生科研基金资助项目(02M014) 作者单位:100853北京,解放军总医院眼科(翟黎东,现在北京英智眼科 医院) 大鼠脑海马回的研究中发现大剂量甲泼尼龙可以抑制 星形胶质细胞GFAP的表达[43,但甲泼尼龙对视网膜 激光损伤中Mailer细胞GFAP表达的影响尚未见报 道.我们对此进行了初步观察,现将结果报道如下. 1材料和方法 1.1材料和设备 小鼠抗大鼠增生细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体 (北京中山生物技术有限公司);链霉亲合素一生物素化 300中华眼底病杂志2002年12月第18卷第4期ChinJOculFundusDis,Dec!:!!:!: 过氧化物酶复合物(strepto—avidin_biotinperoxidase complex,SABC)试剂盒(武汉博士得生物工程有限公 司);小鼠抗猪GFAP单克隆抗体(加拿大BioGenex 公司);氩离子激光器(NOVAS2000,Coherent公 司);MIAS一300图像分析仪(国产). 1.2实验方法 成年健康SD大鼠40只,体重180,220g,雌雄 不限,由解放军总医院实验动物中心提供.随机分成治 疗组和对照组,每组各20只.实验前30min两组大鼠 均腹腔注射浓度为3.5%水合氯醛10ml/kg,双眼复 方托品酰胺充分散瞳,眼前放一53D前置镜,进行双 眼视网膜激光光凝.每只眼在视盘1.5,2.0个视盘直 径外4个象限均匀光凝40个点.光凝时间0.20S,光 斑为50tzm,能量400mw,治疗组20只大鼠在光凝后 1h内按30mg/kg剂量腹腔注射浓度为1的甲泼尼 龙,其后每日注射1次,连续3d.对照组大鼠亦连续3 d每日腹腔注射等量的生理盐水. 1.3组织切片 激光光凝后3,7,14,28d任选5只大鼠,水合氯 醛腹腔注射麻醉后取出双眼眼球,固定(固定液450 ml:95%酒精150ml,10中性缓冲甲醛100ml,冰醋 酸50ml,蒸馏水150m1)15,20h后,于赤道部矢状 切开,小心取出品状体,玻璃体,后半部眼球在75酒 精中继续固定3,5h.组织脱水,透明,浸蜡,包埋.组 织蜡块在冰水中制冷后,眼球均从冠状位沿视神经向 周边视网膜方向切削0.5mm,然后做5tzm厚的连续 切片.蜡块置于44C蒸馏水中展开,65’C左右的烤片 机上烘烤10min,制片完成.用SABC免疫组织化学 染色法测定PCNA和GFAP,3,3一二氨基联苯胺室温 显色.显微镜下控制反应时间,待显色完全后,用蒸馏 水洗涤.苏木素轻度复染,中性树脂封片. 1.4图像分析与统计学处理 应用MIAS一300图像分析仪,用200倍显微镜,每 个激光损伤灶为一个视野,随机选取5处视野.对治疗 组和对照组的PCNA免疫组织化学染色结果进行定 量检测,测定阳性反应物的面积和灰度,然后在SAS 软件下进行统计学处理. 2结果 2.1PCNA表达 激光光凝损伤后3d,治疗组和对照组激光光斑处 可见成片的PCNA阳性染色细胞,包括Mtiller细胞, RPE细胞,脉络膜血管细胞和炎性细胞.对照组较治 疗组染色面积大,灰度深(表1;图1,2).在7,14,28d 治疗组和对照组激光光斑处均未见PCNA阳性表达. 表1激光光凝损伤后3dPCNA染色 2.2GFAP表达 激光光凝损伤后3d,治疗组激光光斑边缘只有少 量GFAP阳性表达,对照组激光光斑边缘有相对较多 的GFAP阳性表达.但在治疗组和对照组的激光光斑 两侧的Miiller细胞都有围绕激光光斑的扇形GFAP 阳性表达区域(图3,4).损伤后7d,治疗组和对照组 激光光斑中央都出现GFAP阳性染色,激光光斑周围 Miiller细胞扇形GFAP阳性表达区域向激光光斑方 向缩小(图5,6).激光光凝损伤后14d,治疗组和对照 组激光光斑仍显示GFAP强阳性染色,周围的Mtiller 细胞扇形GFAP阳性表达区域继续缩小,颜色变淡. 损伤后28d,激光光斑仍显示GFAP强阳性染色,周 围Miiller细胞GFAP染色基本消退.在各个时间点 对照组免疫组织化学染色面积均比治疗组大. 3讨论 PCNA是一种细胞周期调节蛋白,与机体的生 长,生理性再生,创伤修复,细胞程序性死亡及肿瘤发 生密切相关.其合成水平反映了细胞增生率及DNA 合成率,并与多种细胞周期调节因子密切相关[. 在视网膜损伤中,损伤的程度与非神经元细胞增 生有直接关系,损伤越重,这些细胞增生修复程度越 强[6].我们观察到激光光凝损伤治疗组的PCNA阳性 染色面积小于对照组,染色强度也弱于对照组.这说明 治疗组在损伤后非神经元细胞的增生程度较对照组 弱.Tim等_7证实了大剂量甲泼尼龙对视网膜激光光 凝损伤有防治作用.因而治疗组视网膜非神经元细胞 增生程度较对照组减弱. 视网膜不同损伤实验中,PCNA阳性表达持续时 间各不相同[6].这可能和损伤引起的刺激程度不同有 关.我们只在损伤后3d观察到PCNA阳性染色结果, 其余7,14,28d3个时间点PCNA表达均为阴性.这 说明激光光凝损伤引起的刺激作用可能较短暂. 许多研究认为视网膜在受到损伤后,Mtiller细胞 开始表达GFAP】,而GFAP的表达是Miiller细胞进 入反应状态的标志,并与Mtiller细胞的肥大,增生和 中华眼底病杂志2002年12月第18卷第4期ChinJO!nd!!!!!!:!:!:3O1 图l治疗组激光光凝损伤后3dPCNA染色像.激光光斑处阳性细胞较少(黑箭)PCNA染色×200图2对照组激光光凝损伤后3d PCNA染色像.激光光斑处阳性细胞较多(黑箭)PCNA染色×200图3治疗组激光光凝损伤后3dGFAP染色像激光光斑边缘阳性细胞 较少(黑箭)GFAP染色义200图4对照组激光光凝损伤后3dGFAP染色像.激光光斑边缘阳性细胞多见(黑箭)图5治疗组激光光 凝损伤后7dGFAP染色像.阳性细胞向激光光斑中央集聚(黑箭)GFAP染色×200图6对照组激光光凝损伤后7dGFAP染色像.激光 光斑中央集聚的阳性细胞仍多于治疗组(黑箭)GFAP染色×200 Fig.1PhotographofPCNAstainingofretinaintreatmentgrouponthethirddayafterlaserinjur.Withlessp ositivecellsinlaserphotocoagu— lation(LP)scar(blackarrow)PCNAstain×200Fig.2PhotographofPCNAstainingofretinaincontrolgr ouponthethirddayafterlaser iniury.WithmorepositivecellsinLPscar(blackarrow)PCNAstain×200Fig.3PhotographofGFAPstai ningofretinaintreatment groupatthethirddayafterlaserinjury.WithlesspositivecellsontheedgeofLPscar(blackarrow)GFAPst ain×200Fig.4Photograph ofGFAPstainingofretinaincontrolgroupatthethirddayafterlaserinjury.Withmorepositivecellsonthe edgeofLPscar(blackarrow) GFAPstain×200Fig.5PhotographofGFAPstainingofretinaintreatmentgrouponthe7thdayafterlaseri njury.Positivecellsgathered tothecentralareaofLPscar(blackarrow)GFAPstain×200Fig.6PhotographofGFAPstainingofretinain controlgrouponthe7thday afterlaserinjury.PositivecellsinthecentralareaofLPscar(blackarrow)GFAPstain×200 迁移有关系[6].在对视网膜损伤后GFAP表达的研究 中,明确原发损伤的准确范围很重要.由于激光光凝损 伤范围明确,继发损伤少,因而视网膜激光光凝损伤动 物模型比较适合研究视网膜损伤GFAP表达与激光 损伤的关系L3].Humphrey等口]观察到视网膜激光光 凝损伤后GFAP的表达有两种不同的方式,即在激光 光斑区域有局限和持续的表达,而在激光光凝斑周围 有广泛而短暂的表达.我们观察到治疗组激光光凝损 伤后各时间点激光光斑区域的GFAP表达都较对照 组弱,而周围GFAP的表达范围无明显差别,可见大 剂量甲泼尼龙可减少视网膜激光光斑区域Mailer细 胞的GFAP表达.甲泼尼龙的这种作用可能有两方面 原因,一方面是直接作用,在对大鼠海马回的实验中, 发现糖皮质激素可抑制GFAP基因的表达;另一方面 是间接作用,Mailer细胞的GFAP表达与激光光凝损 伤程度成正相关[3].由于大剂量甲泼尼龙可以减轻视 网膜的激光损伤程度,因而减少了GFAP表达. 4参考文献 1RutledgeBK,WallowIH,PoulsenGL.Sub—pigmentepithelial membranesafterphot0coagulationfordiabeticmacularedema. ArchOphthalmol,1993,111:608—613. HumphreyMF,ConstableIJ,ChuY,eta1.Aquantitativestudy ofthelateralspreadofMtillercellrespsonsestoretinallesionsin therabbit.JCompNeurol,1993,334:545—558. HumphreyMF.ChuY,MannK.eta1.RetinalGFAPandbFGF expressionaftermultipleargonlaserph0tocoagulationinjuriesas, sessedbybothimmunoreactivityandmRNAlevels.ExpEyeRas, 1997,64:361—369. NancyRN,HeinzHo.JeffreyNM,eta1.MessengerRNAforglial fibrillaryacidicproteinisdecreasedinratbrainfollowingacuteand chroniccorticosteronetreatment.MolBrainRes,1990,7:I-7. 周大彪.增生细胞核抗原及其在脑胶质瘤中的研究进展.国外医学 神经病学神经外科学分册,1999,26:242—244. YewDT,YiX,ChanWY,eta1.Arabbitmodelofproliferative Vitreoretinopathyinducedbyinjectionofastrocyticcultures.Cell MolNeurobiol,1999,19:759—773. TimTT,KanjiT,JunF,eta1.Methylprednisolonetherapyinlaser oftheretina.Graefe’sArchClinOphthalmol,1993,231:729—736. JuWK,KimKY,HofmannHD,eta1.Selectiveneuronalsurvival andupregulationofPCNAintheratinnerretinafollowingtransient ischemia.JNeuropatholExpNeurol,2000,59:241—250. (收稿日期:2001—09—14) (ak文编辑:唐健) 2345678
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