无花果干提取液抑菌活性的研究

无花果干提取液抑菌活性的研究 无花果干提取液抑菌活性的研究 江西农业大学2011,33(5):0999—1005 ActaAgricuhuraeUniversitatisJiangxiensis E—mail:ndxb7775@sina.corn 无花果干提取液抑菌活性的研究 郭紫娟,张凤英,董开发,陈沙 (江西农业大学食品科学与学院,江西南昌330045) 摘要:研究不同提取条件下无花果中活性物质的抑菌作用.以常见致病菌和易污染食品的微生物为供试菌,用 抑菌圈直径来衡量抑菌效果,二倍稀释法测最低抑菌浓度(MIC).在单因素试验基础上进行均匀设计优化无 花果干中抑菌活性物质的提取条件.在乙醇体积分数55%,浸提温度6O?,浸提时间5h,液固比20的提取 条件下,提取物的抑菌效果较好,对金黄色葡萄球菌的MIC为2.5mg/mL,对大肠杆菌,产气肠杆菌,酿酒酵母 的MIC为3.125mg/mL,对沙门氏菌,溶血性链球菌,志贺氏菌的MIC为6.25mg/mL;无花果干水提液对黑曲 霉有最大抑菌圈直径16.0mm.无花果干水提取物对真菌有较好的抑菌效果,乙醇提取物具有明显的广谱抑 菌效果. 关键词:无花果干;提取物;抑菌;MIC 中图分类号:$482.292文献标志码:A文章编号:1000—2286(2011)05—0999—07 AntimicrobialActivitiesofFigCrudeExtracts GUOZi-juan,ZHANGFeng—ying,DONGKai—fa,CHENSha (CollegeofFoodScienceandEngineering,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang3300 45,China) Abstract:Objective:Tostudytheantimicrobialactivitiesofdriedfigcrudeextractsindifferentextracted conditions.Methods:Usinguniversalbacteriaandfungiasindicatorsinfood,withoxfordcupmethodthedi— ameterofinhibitionzonewasmeasuredandwithdoubledilutionmethodtheminimuminhibitoryconcentration (MIC)wasmeasured.Andtheoptimalextractionconditionswereobtainedbyuniformdesign.Results:the optimaltechnologicalparameterswereat55%ethanolvolumefractionandat60oCfor5hwithliquid——solid ratioof20,theMICofextractsagainstStaphylococcusaureuswas2.5mg/mL,theMICofextractsagainst Escherichiacoli,Enterobacteraerogenes,Saccharomycescerevisiaewas3.125mg/mLandtheMICofextractsa— gainstSalmonella,HemolyticStreptococcus,Shigellawas6.25mg/mL.TheinhibitionzoneforAspergillusni- gerreached16.0mmwhenwaterwastakenastheextractingagent.Conclusion:waterextractsoffighadan obviousinhibitoryeffectonfungiwhileethanolextractshadabroad— spectrumeffectonbacteriuminvitro. Keywords:driedfig;extracts;inhibition;MIC 无花果系桑科植物,落叶灌木或小乔木,全国各地均有栽培.无花果干既是鲜食果 品又是一种药 材.果实含有丰富的糖类,蛋白质,氨基酸,有机酸,酶类以及微量元素,可食率高达 92%以上;又具有 健脾消食,润肠通便,降血脂,降血压,利咽消肿,补充营养,防癌抗癌等药食两用的功 效-9].《本草纲 目》载:"无花果味甘平,无毒,主开胃,止泻痢,治五痔,咽喉痛."目前,国内外研究多集 中在无花果的抗 收稿日期:2011—05—05修回日期:2011—08—12 基金项目:国家自然科学基金(31060226) 作者简介:郭紫娟(1989,),女,硕士生,主要从事食品化学与天然产物研究,E—mailguozijuan89@126.com;$通讯 作者:董开发,副教授,E—mail:dkfdh@163.coin. 江西农业大学第33卷 癌抗肿瘤方面,它的抗癌功效也得到世界各国公认.然而,有关无花果干的提取液抑菌活性及抑 菌效果方面研究较少. 本文以常见致病菌大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,沙门氏菌,溶血性链球菌,志贺氏菌,产气肠杆菌和 易污染食品的枯草芽孢杆菌,酿酒酵母,黑曲霉等微生物为供试菌,通过单因素试验和均匀试验,以抑菌 圈直径为指标,研究无花果干提取物的抑菌作用和抑菌活性物质的提取条件.可让人们进一步了解无 花果干作为药食两用果品的开发应用前景,以及为直接开发利用新型环境友好型抑菌剂和安全健康的 高端食品防腐剂和药食两用的食品提供一定的理论参考. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1无花果干浙江安吉产,由鲜无花果晾晒而成,未放任何添加剂. 1.1.2供试培养基牛肉膏蛋白胨培养基,PDA培养基,黄豆芽培养基?. 1.1.3菌种大肠杆菌(Escherichiacoli),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),产气肠杆菌(Enter— obacteraerogenes),沙门氏菌(Salmonella),溶血性链球菌(Streptococcushemolyticus), 志贺氏菌(Shigel一 ),酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和黑曲霉(Aspergillusniger),均由江西农业大学食品科学与工程 学院微生物实验室提供. 1.2试验方法 1.2.1菌悬液的制备菌种活化之后用接种环挑取适量菌体或孢子放入无菌水中制成含菌量大于 10CFU/mL的菌悬液或孢子悬浮液备用. 1.2.2无花果干提取液的制备水提取液的制备:称无花果干适量,表面消毒,碾碎后加适量水,60? 水浴浸提3h,过滤,滤液即无花果水提取液,放冰箱保存备用. 乙醇提取液的制备:称适量果干,表面消毒,破碎,以一定体积比例加入不同浓度的乙醇溶液,一定 温度下水浴浸提若干小时,过滤得滤液,于旋转蒸发仪上蒸发除乙醇,得果干醇提液,于冰箱中4?保 存备用. 1.2.3抑菌实验方法牛津杯法.将牛津杯,移液管等器皿灭菌后.于无菌室中用移液管吸取 0.1mL菌悬液涂平皿,每皿放置3个牛津杯,再吸取无花果干提取液注满牛津杯,以无菌水为对照,每 种菌设置2个平行.然后将平皿置于36cc培养箱(真菌28?)中培养1—2d,按时取出.十字交叉法 测量抑菌圈直径,数据取平均值. 判断:牛津杯直径为9mm,抑菌圈直径大于10mm才被评价为有抑菌效果,直径为0mm表示 提取液可能对供试菌有促进生长的作用. 1.2.4乙醇提取液提取条件的研究在单因素的基础上,对乙醇体积分数,浸提温度,浸提时间,液固 比四个因素进行均匀设计优化提取工艺.混合水平均匀试验因素水平见表1. 表1混合均匀设计因素水平U10(10×5) Tab.1Mixed—leveluniformdesignfactorandleveltableUl0 1.2.5最低抑菌浓度(MIC)测定方法-17]二倍稀释法.取均匀试验最佳提取条件下的无花果干品 醇提液,配成50mg/mL固形物的原液.在7支小试管中加入液体培养基各2mL,第1管中加入上述样 品原液2mL,混匀后取2mL加入第2管,依次倍比稀释,自第5管吸2mL弃去,第6管作为阳性空白 对照,第7管作为阴性空白对照.然后在前6管中加人事先制备好的菌悬液0.1mL,混匀后放在适宜 第5期郭紫娟等:无花果干提取液抑菌活性的研究?100l? 温度的培养箱中培养,观察效果. 结果判断:在阳性对照管中有菌生长和阴性对照管无菌生长的条件下,以试验组管无菌生长的样品 最低稀释度为MIC. 2结果与分析 2.12种提取剂对无花果干提取液抑菌活性影响 无花果干水提液和乙醇提液对各种微生物的抑菌效果见表2. 表2无花果干提取液抑茵活性 Tab.2Theantibacterialcirclediameterofdriedfigextractsagainstmicroorganisms 从表2可知:无花果干60?水提液抑制细菌的效果不显着,但对真菌的抑菌效果相对较好:对酿酒 酵母为12.0mm,对黑曲霉为16.0mm.无花果干50%乙醇提取液对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌的抑 菌圈直径明显大于水提液,对酵母和黑曲霉的抑菌效果也较好.结果表明无花果水提液对真菌有较强 的活性,而乙醇提取液具有一定的广谱抑菌效果.所以以乙醇为提取剂研究无花果干抑菌物质的最佳 提取条件. 2.2不同体积分数的乙醇对无花果干提取液抑菌活性的影响 设定提取温度60?,提取时间3h,料液比1:15,探讨不同体积分数的乙醇对果干提取液抑菌效果 (表3). 表3乙醇体积分数对无花果干提取液抑菌活性的影响 Tab.3Effectofethanolvolumefractionontheantibacterialactivityofdriedfigextracts 从表3数据可知,乙醇体积分数在40%,80%时提取液对前3种菌具有明显的抑菌效果:对大肠 杆菌的抑菌直径达12.0,19.0mm,对金黄色葡萄球菌为12.0,12.5mm,对酿酒酵母为16.0,18.0mm. 当乙醇体积分数为50%,60%时,浸提液对黑曲霉表现出较强的抑制作用,最大抑菌圈直径为12.0, 江西农业大学第33卷 15.0film.60%的乙醇提取液对各种供试菌的抑菌效果均较好. 2.3温度对无花果干乙醇提取液抑菌效果的影响 以60%乙醇为溶剂,设定浸提时间为3h,料液比1:15,探讨不同温度对无花果干提取液抑菌效果 的影响(表4). 表4温度对无花果干乙醇提取液抑菌效果的影响 Tab.4Effectoftemperatureontheantibacterialactivityofdriedfigethanolextracts 从表4数据可知,当温度低于35?,无花果干浸提液对4种菌的抑菌效果较差;当温度为35, 60?时,果干浸提液对各供试菌显示出良好的抑菌效果,对大肠杆菌的抑菌圈直径达18.5,19.5mm, 对金黄色葡萄球菌最大为15.5mm;对酿酒酵母最大为16.5mm.而提取液对黑曲霉的抑菌效果较 差,仅在55—60?时有13.0mm的最大抑菌圈直径. 随温度的升高,无花果干中抑菌效果无明显的规律,笔者认为是由于抑菌活性物质的提取除了溶剂 效应以外,虽有一定热效应,但同时也有部分活性物质受热而使活性降低,抑菌圈直径减小.尤其当温 度超过75?时,由于温度太高,乙醇挥发加剧,使整个溶剂系统极性过大,影响乙醇浸提效果,或者产 生了挥发的物理变化,损失了部分抑菌活性物质,使得抑菌效果降低. 2.4浸提时间对无花果干乙醇提取液抑茵活性的影响 以60%乙醇为提取剂,浸提温度55?,设定液固比为15,探讨不同时间的无花果干提取液的抑菌 效果(表5). 表5时间对无花果干提取液抑菌活性的影响 Tab.5Effectoftimeontheantibacterialactivityofdriedfigethanolextracts 从表5可知:随着浸提时问的延长,总体而言,在8h内由于浸提时间相对较长时原料和溶剂之间 的相互作用较彻底,使得抑菌活性物质溶出的较多,所以提取液对前3种菌的抑菌效果:浸提时间较长 第5期郭紫娟等:无花果干提取液抑菌活性的研究?1003? 时,抑菌圈直径相对更大.但对黑曲霉却是例外,在浸提时间为2h提取液对黑曲霉有最大抑菌圈,直 径达16.0mm,随后抑菌圈直径反儿随时间延长而变小.这有可能是因为对黑曲霉有抑制作用的活性 物质需在相对较短的时间内提取,在55下延长浸提时间会破坏抑制黑曲霉的活性物质从而导致抑 菌效果的降低.由此可推测无花果干中含有多种有效的抑菌活性成分且提取条件各不相同. 2.5液固比对无花果干提取液抑菌活性的影响 以60%的乙醇为提取剂,浸提温度为55?,浸提时问为7h,探讨不同液固比对无花果干提取液抑 菌活性的影响(表6). 表6液固比对无花果干提取液抑菌活-陛的影响 Tab.6Effectofliquid—solidratioontheantibacterialactivityofdriedfigethanolextracts 从表6可知:液固比为2—25,无花果干粗提液对几种菌(除黑曲霉外)均显示出良好的抑菌效果. 在液固比15时大肠杆菌有最大抑菌圈直径19,0mlTl,金黄色葡萄球菌为20.0mm, 酿酒酵母l5.5mm, 黑曲霉在液固比5时为15.0mm.抑菌效果由大到小:金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,酿酒酵母,黑曲霉. 液固比不宜太低,也不宜太高.太低时难以保证无花果干中的抑菌活性物质转移到提取溶剂中,而 且乙醇是挥发性物质,造成物料黏度过大,过滤困难,提取不完全,从而导致抑菌活性较低;太高会使抑 菌物质浓度降低,降低抑菌效果. 2.6均匀设计优化无花果干中抑菌活性物质提取条件 单因素试验表明,乙醇浓度,浸提时间,浸提温度,液固比均对无花果干中的抑菌活性物质的提取具 有不同程度的影响.由于试验因素对各种供试菌均有一定的抑菌效果但无明显的抑菌活性趋势,且各 种抑菌活性物质的最佳提取条件不同,再加上试验因素水平较多,以及微生物实验的不确定性.本研究 仍以抑菌圈直径为指标,增加沙门氏菌,溶血性链球菌,产气肠杆菌,志贺氏菌为供试细菌,探讨无花果 干乙醇提取液的抑菌活性并采用均匀设计对提取条件进行优化(表7). 表7混合水平均匀设计因素结果U.(10×5) Tab.7Mixed—leveluniformdesignfactorsandresultsU10 5O0OO000O0 H"M控B"加 江西农业大学第33卷 通过DPS数据分析软件对表7中对乙醇体积分数,浸提温度,时间,液固比回归方程的建立,发现 回归方程在统计学上不显着,以及对软件拟合出的较好提取条件进行试验验证发现不能达到预期效果. 采用直观分析法,从表7中的数据可知,在第6号试验提取条件下即乙醇体积分数55%,浸提温度 60cC,时问5h,液固比20时,所得提取液抑菌活性相对较好.8种供试菌有6种菌(即大肠杆菌,金黄 色葡萄球菌,溶血性链球菌,志贺氏菌,酿酒酵母)在此条件下有最大抑菌圈.其中,无花果干醇提取液 对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好,抑菌圈直径达到最大值22.0mm;沙门氏菌在1号试验组中有最大 抑菌圈直径13.0mill.产气肠杆菌在第10号试验条件下有最大抑菌圈直径17.1mm. 已有研究表明,无花果干的果实含丰富的富马酸(Fumaricacid,CH0),具有较强的抗菌作 用,与琥珀酸配合作用,对金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌等有明显的抑制作用;对溶血性链球菌,肺炎双球 菌有中敏至高敏的抑制作用,可减轻由上述病原菌感染所致的各种疾病.与本文中无花果干乙醇提液 对金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的抑菌试验效果(最大抑菌圈直径22.0mm和14.2mm)相符合. 2.7最低抑菌浓度(MIC)的测定 本试验采用均匀设计中的第6号试验所得乙醇提取液测定各供试菌的最低抑菌浓度(表8). 表8无花果干醇提液最低抑菌浓度(MIC)试验 Tab.8Minimuminhibitionconcentrationtestofdriedfigethanolextractsagainststrains " 一 "表示无菌生长,"+"少量菌生长,"++"有较多菌生长,"+++"有大量的菌生长.阳性对照需有菌生长而阴性 对照无菌生长,否则实验无效. " 一 "indicatednogrowthofbacteria,"+"smallamountofbacteriagrowth,"++"moregrowth,"++ +"alargenumber ofbacteriagrowth.Thepositivecontrolshouldbebacterialgrowthandthenegativecontrolwi thoutgrowth,otherwisethesterile wasinvalid. 结果表明,以金黄色葡萄球菌对醇提液最为敏感,MIC为2.5mg/mL,大肠杆菌,产气肠杆菌,酿酒 酵母的MIC为3.125mg/mL,对沙门氏菌,志贺氏菌,溶血性链球菌为6.25mg/mL.与表7均匀试验 结果基本一致. 3结论与讨论 (1)无花果干水提液对常见病原菌未表现出明显的抑菌活性,仅对供试真菌有较好的抑菌效果;而 以乙醇为提取介质时,对细菌,真菌均有抑菌活性. (2)无花果干抑菌物质的最佳提取条件:乙醇体积分数55%,浸提温度60?,时间5h,液固比20. (3)在最佳提取条件下对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好,MIC为2.5mg/mL;对大肠杆菌,产气 肠杆菌,酿酒酵母有较好抑菌效果,MIC均为3.125mg/mL;对沙门氏菌,志贺氏菌,溶血性链球菌抑制 效果一般,MIC为6.25mg/mL. 本文探讨了无花果干提取物的广谱抑菌作用,在一定程度上阐明了我国民间采用水煎无花果汁直 接涂于患处成功治疗寻常疣,痔疮等疾患的原理.无花果中含有的延胡索酸,琥珀酸,丙乙酸,草酸, 第5期郭紫娟等:无花果干提取液抑菌活性的研究?l005? 奎宁酸等物质,具有一定抗炎消肿之功;果实的乳浆中含有补骨脂素,佛柑内酯等活性成分及成熟果实 中的苯甲醛,都具有防癌抗癌的作用,可以预防肝癌,肺癌,胃癌的发生I2.至于本文中无花果干提 取液中的有效抑菌成分具体是什么还有待于进一步研究.植物果实中有许多化合 物的结构和作用方式 较为复杂,其对病原菌的细胞学作用(细胞壁,细胞膜,细胞质)以及对病原菌的分子生物学意义(抑制 DNA合成还是呼吸作用)尚待进一步阐明. 参考文献: [1]李永刚,文景芝,郝中娜.植物源杀菌剂的研究现状与展望[J].东北农业大学,2002,33(2):198-202. 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