基于纳米材料构建甲胎蛋白、癌胚抗原及人绒毛膜促性腺激素电化学免疫传感器的研究

基于纳米构建甲胎蛋白、癌胚抗原及人绒毛膜促性腺激素电化学免疫传感器的研究 基于纳米材料构建甲胎蛋白、癌胚抗原及人绒毛膜促性 腺激素电化学免疫传感器的研究 独创性声明 学位题目:基王纳鲞盐粒抱建里脸蛋鱼!癌墅扭遂区厶纯垂送堡 性鏖邀塞电毡堂免疫笾盛墨鲍叠壅 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了 标注。 签字日期:加，,年审月2D日 学位论文作者(,窿卜，j一连 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行榆索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文:口不保密， 口保密期限至 。 年 月止 导师签名: 学位论文作者签名:?卜??卜雹电 签字日期:矽ff年厶月2D日 签字日期:加,,年么月矿日 目 录 摘 要…………………………………………………………………………………………………………………………(I ABSTRACT……………………………………………………………………………………………………………………((III 第l章绪言…………………………………………………………………………………………1 1(1免疫传感 器…………………………………………………………………………………………l 1(2电化学免疫传感 器………………………………………………………………………………2 1(2(1非标记电化学免疫传感 器………………………………………………………………2 1(2(2标记型电化学免疫传感 器………………………………。……………………………3 1(3纳米材料在免疫传感器方面的应 用……………………………………………………………4 1-3(1碳纳米管在生物传感器方面的应用……………………………………………………(4 1(3(2纳米壳核材料在生物生物传感器方面的应用…………………………………………5 1(4本论文的研究思 路………………………………………………………………………………6 第2章基于碳纳米管,DNA,硫堇,纳米金修饰玻碳电极所制 备的高灵敏的甲胎蛋白免疫传感器 …………………………………………………………………………………………………………………………………………((7 2(1引言……………………………………………………………………………………………………………………………((7 2(2实验部 分…………………………………………………………………………………………。8 2(2(1试剂与材料………………………………………………………………………………((8 2(2(2仪器……………………………………………………………………………………………………………………8 2(2(3免疫传感器的构 建………………………………………………………………………,8 2(2(3测定方法…………………………………………………………………………………9 2(3结果与讨 论………………………………………………………………………………(((…((10 2(3(1扫描电镜表 征…………………………………………………………………………。10 2(3(2修饰电极的循环伏安表 征………………………………………………………………10 2(4实验条件的优 化…………………………………………………………………………………ll 2(5免疫传感器的性 能……………………………………………………………………………(13 2(5(1传感器对AFP的检测…………………………………………………………………(13 2(5(2免疫传感器的选择 性……………………………………………………………………13 2(5(2免疫传感器的重现性和稳定性………………………………………………………。13 2(5(3应用…………………………………………………………………………………………………………………(14 2(6结论……………………………………………………………………………………………………………………………(14 k牛 第3章基于铁氰化镍(半胱氨酸(金的纳米复合物修饰金电极所制备的CEA电化学免疫传感器 …………………………………………………………………………………………………………………………………………16 3(1弓I言……………………………………………………………………………………………………………………………16 3(2实验部 分…………………………………………………………………………………………17 3(2(1仪器与试剂………………………………………………………………………………17 3(2(2NiHCFNPs的制备……………………………………………………………………………………………。17 NPs 的制备……………。17 3(2(3铁氰化镍(半胱氨酸(金的纳米复合物 NiHCF(Cys(Au 7 3(2(4免疫传感器的制 备………………………………………………………………………1 8 3(2(4测定方法…………………………………………………………………………………1 8 3(3结果和讨 论………………………………………………………………………………………l 8 3(3(1修饰电极的CV表征…………………………………………………………………,1 3(3(2修饰电极的E1S表征……………………………………………………………………19 3(3(3修饰电极的CV扫速与电流的关系…………………………………………………一20 3(4实验条件优 化…………………………………………………………………………………一20 3(4(1测试底液pH的优化……………………………………………………………………20 3(4(2孵育温度的优 化…………………………………………………………………………21 3(4(2孵育时间的优 化………………………………………………………………………一21 3(5传感器的性 能……………………………………((:…………………………………………。22 3(5(1线性范围和检测 限………………………………………………………………………(22 3(5(2免疫传感器的选择性、重复性及其稳定 性……………………………………………23 3(5(3同收率…………………………………………………………………………………一23 3(6结论……………………………………………………………………………………………………………………………23 第4章基于nano(Pt修饰功能化的CNT为标记的双抗体夹心免疫传感器的研制…………。25 4(1引言……………………………………………………………………………………………………………………………25 4(2实验部 分………………………………………………………………………………………( (25 4(2(1仪器与试剂………………………………………………………………………………25 4(2(2Pt(CNT标记二抗的制备………………………………………………………………(26 4(2(2免疫传感器的制 备……………………………………………………………………一26 4(2(3免疫传感器双抗体夹心法的测试过程…………………………………………………27 4(3结果与讨 论………………………………………………………………………………………27 4(3(1电极在自组装过程中的循环伏安表征…………………………………………………27 4(4实验条件的优 化………(((………………………………………………………………………28 4(4(1孵育时间的优 化………………………………………………………………………((28 4(4(2底液酸度的优 化…………………………………………………………………………28 4(4(3测试底液中H202的优化………………………………………………………………29 4(5传感器的性 能…………………………………………………………………………………(29 4(5(1线性范围和检测 限………………………………………………………………………29 4(5(2免疫传感器的选择性和稳定 性………………………………………………………。30 4(5(3免疫传感器的回收 率……………………………………………………………………30 l 4(6结论……………………………………………………………………………………………………………………………3 参考文 献………………………………………………………………………………………………32 作者部分相关论文题 录……………………………………………………………………………38 致 谢…………………………………………………………………………………………………………………………………(39 两南大学硕卜学位论丈 摘耍 基于纳米材料构建甲胎蛋白、癌胚抗原及人 绒毛膜促性腺激素电化学免疫传感器的研究 冉小琪 分析化学专业硕士研究生 指导教师 袁若教授 摘 要 现代医学认为恶性肿瘤这种全身性的疾病直接威胁着人类的健康，而大多的肿瘤在早期 都可以治愈，因而肿瘤标志物的的微量检测对于诊断肿瘤疾病己突显十分重要的地位。Aizawa 等人于1979年首次制作了电流型免疫传感器来检测血清中的人绒毛膜促性腺激素，据此也开 辟了人们对其他多种肿瘤标志物的检测研究，如弘甲胎蛋白 AFP ，癌胚抗原 cEA ，糖类 早最多、种类最多、最为成熟的一个类别，常与各种电分析技术，如溶出伏安法、脉冲伏安 法、脉冲差分法等结合，有着灵敏度高、选择性好、制备简单、响应速度快和造价低廉等优 点。 本文引进多种纳米材料，运用吸附、共价健合、电化学聚合等多种生物功能物质的固定 方法，构建了一系列检测AFP、CEA、HCG的电化学免疫传感器。主要研究工作如下: 1(基于碳纳米管,DN刖硫堇，纳米金修饰玻碳电极所制备的高灵敏的AFP免疫传感器 用碳纳米管,DNA,硫堇，纳米金这种多层膜结构设计了一种检测AFP的新型高灵敏的免疫 传感器。将分散于二甲基二丙烯氯化铵 PDDA 的多壁碳纳米管 MWCNT 滴附于已经沉 积了纳米金的玻碳电极表面，然后利用PDDA的正电荷吸附一层带负电荷的DNA膜，再通过 静电吸附将正电荷的硫堇固定在传感器的表面，最后将纳米金固定在电极表面用以吸附AFP 气 ，佛 的抗体 anti(AFP 。电极的制备过程用循环伏安和扫描电镜进行了表征，也对可能影响传感 j 器性能的因素做了优化。在最佳的实验条件下，传感器在AFP浓度为0(01到10(0 ng??mLu和 10(0到200(0 ng??mLq两段中表现出了良好的线性，在S,N 3时，检测下限为0(04 ng??mL,。 此外，传感器的选择性，重复性和稳定性也表现良好。 2(基于铁氰化镍(半胱氨酸(金的纳米复合物修饰金电极所制备的CEA电化学免疫传感器 用新合成的铁氰化镍(半胱氨酸(金的纳米复合物修饰金电极，从而制备了一种用以检测 CEA的高灵敏电流型免疫传感器。传感器的每一步修饰过程均用循环伏安法和交流阻抗法进 行了表征。在最佳的实验条件下，目标免疫传感器在CEA浓度 为0(05到160(0 ng-mL"1的范 围内表现出了良好的线性，在S,N 3的条件下，传感器的检测限为0(02 ng??mL,。此生物传感 两南大学硕士学t_::j:论文 摘要 器的制备简便，且选择性、稳定性和重现性均表现优异。 3(基于nano-Pt修饰功能化的CNT为标记的双抗体夹心免疫传感器的研制 用DNA和硫堇层层修饰碳纳米管，从而得到了表面巯基化的碳纳米管。再将这种功能化 的碳纳米管置于氯铂酸中，利用原位还原使其表面标记上一层纳米铂颗粒， 从而制备了纳米 铂修饰的碳纳米管 Pt(cNT 。用同时标记人绒毛膜促性腺激素抗体和辣根过氧酶的Pt(CNT 作为二抗，制备了双抗体夹心法的免疫传感器，其检测范围为0(01,80(0mIU??mL一，检测下限 为0(005mlU??mL,。此传感器选择性好，稳定性佳。 关键词:甲胎蛋白癌胚抗原人绒毛膜促性腺激素免疫传感器纳米材料 n 两南夫学硕卜学位论文 ABSTRACT StudiesonElectrochemical Basedon Nanomaterials J叫 ? ? ? LarClnoem and DrV0nlC Human Antigen Chorionic Gonadotrophin master Ran AnalyticalChemistry Postgraduate:Xiaoqi RuoYuan Supervisor:Professor AB STRACT tumorisattributedtobeoneof diseaseseinModem Medicine Malignant systemic and the ofhuman(Mostkindsoftumorscanbeencureat the directlythreatinghealthy thedetectionof tumormarkerbecome prophase，thereforetiny very andhis assistantsmadea虹ndof immunosensorforHCGinhuman blood amperometric seurm at 1979(Afterthis todetectotherstumor marker firstly work，investigatorsbegan as alpha-Fetoprotein AFP ，Carcinoembryonic antigen SO research on(The of 19??9 CAl9―9 ，carboh，rdrateantigen125 CAl25 and electrochemical immnosensorismost andfull―blowninallkindsof early，multifarious variouskindsof immunosenor,usuallycooperate谢m electroanalytical technique，such as and finitedifferencemethod( stripping voltammetry,impulsevoltammetryimpulse ? ‘ Electrochemical immnosensor and performancehighlysensibility 仉 and andother time，lower pretreatmentprocedure，fastanalytical price portability ^ advantages( Inthis haveconstructedseveralimmunosensorsofdetectionof thesis，we AFP, CEAand onusevarious HCG,based nanomateralsandimmobilizationmethodsof as electrostatic biorecognitionmolecule，suchadsorption,covalence interaction, covalent andelectrochemical conjunction polymerization( 1(Asensitive immunosensorfor basedoncarbon amperometric alpha―Fetoprotein nanotube,DNA,Thi,nano-Aumodified carbonelectrode( glassy Anovel immunosensorforthedeterminationof amperometric Ill was heldonthe diallydimethlammonium electrodeviatheelectrostaticforcebetween thionineandthe positive DNA(Finally,the nano―Auwasretainedonthethioninefilmfor immobilizationofAFP antibody modifiedWascharacterized anti―AFP (Theprocess bycyclic electron factors influencedthe scanning microscope SEM (T11e possibly performance 一 ofthe immunosensorswerestudiedindetail(Under proposed conditions，the optimal immunosensorexhibiteda electrochemicaltoAFPin behavior atwo proposed good concentrationofO(01to10(0 from10(0 to200(0 a rang ng??mL―and ng??mL。1、析th low’detectionlimitofO(04 3timesthe noise( ng’mL―at relatively background and of Moreover,the the immunosensorwere selectivity,repeatabilitystability proposed acceptable( 2(Nickel ModifiedGoldelectrode Hexacyanoferrate-Cysteine―AuNanoeomposite forElectrochemicalof SensingCarcinoembryonicantigen( Anew sensitive immunosensorforthe of determination highly amperometric nickel carcinoembryonicantigen CEA is synthesized preparedbyimmobilizingnewly ona electrode(The modified hexacyanoferrate―Cysteine-A(u nanocompositesgold ischaracterized electrochemical process bycyclic voltammetry cv andimpedance immunosensora exhibits spectroscopy EIS (Underoptimalconditions，the proposed widelinear fromO(05to160(0 CEA、析 thadetection limitof range ng??mL_towards O(02 of the biosensoris it ng’mL“ S,N 3 (Thepreparationproposed convenient，and exhibits and highselectivity， long-timestabilitygoodrepeatability( ， 3(Nano-Pt functionalizedcarbon label nanotubefor conjunctive amplified immunoanalysis At carbonnanotubeWasobtainedcarbon nanotube first,sulfhydrylation by modifiedwithDNAandthionine functionalizedCNTWas in gradually(The dispersed acidandreducedin thesurfaceofitwillbemarked situ，thus hydrochloroplatinic by nano―Pt unctivefunctionalized platinumnanoparticles(Then，theconj CNT pt―CNT IV Chorionic Keywords:n-l-fetoprotein;Carcinoembryonic antigen;Human materials Gonadotrophin;Immunosensor;nano ? ， 静 V 并将特异性免疫反应与高灵敏的传感技术结合起来，用以检测抗体和抗原反应的 生物传感器。目前在临床诊断，环境分析，药物分析和食品安全等多方面被广泛 研究【l引。相对于其他分析仪器，免疫传感器具有分析速度快、灵敏度高、选择性 高、操作简便与成本低廉等优点，并且适用于在线活体检测，具有广阔的发展前 景，但免疫传感器依然未在临床检验领域进行广泛的商品化应用方便仍有待改进 【4，5】。免疫传感器的反应，如图1(1所示在传感器的表面进行。 铸号殷大 分拆物 生物识别层 转换晕 图1(1免疫传感过程 免疫传感器根据产生信号的不同，可以分为四种类型:质量检测免疫传感器、 热量检测免疫传感器、光学免疫传感器和电化学免疫传感器。质量检测免疫传感 器是通过测量免疫反应前后质量变化来对样品进行检测【6】。压电免疫传感 器 压电 晶体微天平 是常用的一种质量检测免疫传感器，其基本原理是将抗体或者抗原 固定在晶体表面，当样品中存在相应的抗原或抗体时，便会因发生抗体(抗原特异 制作了一种新型的压电石英微阵列免疫传感器用于检测人体血清中的HCG[10】，这 种微阵列传感器是由各个独立的单元所构成，具有选择性好，检测速度快等优点， 对HCG的检测下限达到了1(0m???mL,。热量检测传感器的基本原理是在热敏电 阻上包被一层抗体或抗原，当其与检测样品中的相应抗原或抗体发生特异性结合 时，从而发生下一步的酶结合反应并放出热量。光学免疫传感器中较多研究的是 也是免疫传感器中研究得最多、最早并且最成熟的一个种类。根据测量信号的类 型，电化学免疫传感器可以分为电流型、电位型，电容型、电导型和阻抗型【15】。 电流型免疫传感器是其中发展最为完善的一种，原理是保持电压不变，通过测定 传感器在免疫反应前后的电流变化来检测待测物质的量【16,171。根据检测信号的产 生来源是否自来标记物，电化学免疫传感器又可以分成非标记型 直接 和标记 型 间接 [181。 1(2(1非标记电化学免疫传感器 幽一些 图1(2纳米金,聚甲苯胺蓝,DNA-PDDA修饰的癌胚抗原免疫传感器的制备过程图 非标记型免疫传感器是通过直接测定抗原抗体复合物形成时的物理、化学变 化对待测物质进行定量检Ntl8J。常见的非标记型电流免疫传感器主要是通过将电 子媒介体 普鲁士蓝，硫堇，二茂铁等 固定到传感器上或溶解于测试底液中， 再将抗体或者抗原固定在传感器表面，进而封闭其活性位点。当待测物中存在相 应的抗原或者抗体时，便会发生特异性结合生成生物大分子，进而阻碍电子传输， 使得电流信号在反应前后产生变化。 Na Li等【l 9】报道了以纳米金，聚甲苯胺蓝以及DNA(PDDA聚离子复合膜修饰 玻碳电极，以用于癌胚抗原的测定 图1(2 。甲苯胺蓝是一种性质与亚甲基蓝相 似，在电极上可表现出可逆的氧化还原反应的染料，可以有效的被固定在 2 饰到印刷电极上，通过生物素(亲核素的作用将生物素标记的髓膦脂碱基蛋白抗体 固定到传感器的表面，然后将传感器放入待测溶液中进行交流阻抗测定，交流阻 抗信号将随着行测溶液中髓膦脂碱基蛋白的增加而增大，从而实现了对待测物的 定量检测，图1(3是传感器制备过程示意图。 for Antibody《specific MBPor controlI lgG Biotin Avidin tetramertcprotein Biotinylatedpolymer 韵隐nsducer 图1(3聚苯胺固定生物素制备的无标型免疫传感器 1(2(2标记型电化学免疫传感器 标记型的免疫传感器是在检测前将分析物进行标记，最终通过检测标记物的 量变所产生的信号监控免疫分析反应，这是由抗体和抗原生物分子本身不具备电 活性决定的【18,21】。在免疫分析中用于标记的酶必须满足以下条件: 1 酶和其底物 在行测溶液中要具有良好的稳定性; 2 酶的活性高，能够在较短时间内与将大量 底物反应，且生成的产物有电化学活性; 3 酶反应的副产物较少; 4 易于标记， 且不影响抗体和抗原的活性: 5 测定时体系中的底物非活性。常用的酶标记物有 碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶和青霉 素酰化酶等。电活性物质作标记物时必须满足以下条件: 1 在行测溶液中 性质稳 定; 2 在测定的电热范围内具有电化学活性; 3 使用时不会引入干扰物且不发 生副反应; 4 具有能够修饰的基团【22】。目前为止常用的电活性标记物有二茂铁、 亚甲基蓝、普鲁士蓝、金属离子等。 IgG抗体所构成的夹心结构，并于测试溶液中加入APP，由于ALP可以将APP催 化成AP，便与电极上所固载的二茂铁发生氧化还原反应并转换成QI，肼又将QI 图1(4 ALP标IgG抗体的夹心法免疫传感器制作过程 1(3纳米材料在免疫传感器方面的应用 纳米材料通常是指颗粒尺寸在1,100nlil之间的微粒，其尺寸介于原子簇和微 分之间【24洲。由于其体积小而比表面积大，纳米材料与宏观材料相对表现出独特 的电子、光学、异象催化和力学特性[26-291。其被研究得最广泛的特性有: 1 体积 效应:当纳米材料的尺寸与传导电子的德布罗意波长相近或更小时，其周期性的 边界条件会被损坏，并使其磁性、光吸收、热阻、内压、熔点、化学活性及催化 特性等与宏观材料相比发生巨大改变。 2 表面效应:纳米材料的表面原子数占原 子总数之比随着纳米粒径减小而急剧增大所引起的纳米材料在性质上的改变。 3 量子尺寸效应:指当微粒的尺寸减小到一定程度时，费米附近的电子能级由 准连 续能级转变为分立能级，吸收光谱也由连续光谱向短波方向移动为分辨结构的线 状光谱。 4 宏观量子隧道效应:隧道效应是指粒子具有穿越比总能量高的势垒的 能力。纳米粒子由于这些独特的性质，而逐步被应用于生物工程科学，仅在生物 学的应用从1991到2007年就有了巨大的进展。下面介绍几种常见的纳米材料在 生物传感器构建中的应用。 1(3(1碳纳米管在生物传感器方面的应用 1991年，S(Iijima在用高分辨的透射电镜研究石墨棒在放电的条件下所形成 的阴极沉积物时，发现了这一种长度为几十微米左右，直径为几十纳米的多 壁碳 米管是由石墨演化而来的具有螺旋状结构的材料，因而存在大量未成对的电子沿 4 图1(5SWNT标记肿瘤制备检测前列腺特异性抗原 PSA 的传感器过程 Xin Yu等Ho]将SWNT羟基化且截短后直立的固定于电极表面，并将PSA的一 抗固定在传感器表面。羟基化的短SWNT还与PSA的二抗和HRP 辣根过氧化物 酶 形成纳米复合物，与PSA和PSA的一抗形成夹心结构，从而制得了高灵敏度 的传感器。实验结果表明，碳纳米管被直立于电极表面时有着优异的导电性 和大 的比表面积，能够固定大量的抗体，同时短的碳纳米管也能交联大量的二抗和 HRP，从而放大响应信号，提高传感器的灵敏度。 1(3(2纳米壳核材料在生物生物传感器方面的应用 纳米粒子由于其表面的二维和三维有序结构，容易被修饰构建成为表现出荧 光、磁性等特殊性质的壳核结构。常见的纳米材料用作核心的有Au、Ag、Pt、CdSe、 Zhuo等【42】以Fe304的纳米颗粒做为核心，在其 Fe203、Fe304和Si02等[4q。Ying 表面包裹上一层普鲁士蓝后吸附一层牛血清白蛋白使得纳米颗粒表面覆盖一层丰 富的小m2，接下来利用-NH2与纳米金之间的吸附作用固定大量的小直径纳米金， 再电沉积氯金酸，便制得了Au(PB-Fe304纳米壳核材料。据实验结果证明这种三 层的壳核型材料具有优良的电化学氧化还原特性和酶催化活性，能够被较好的应 用于免疫测定研究中。图1(6为Au-PB_Fe304三层壳核纳米材制作过程示意图。 两南大学硕十学位论文 第1章 阿? a b $d二 d C 图1(6Au-P&-Fe304纳米壳核材制作过程示意图 ’ 1(4本论文的研究思路 在多层膜结构的修饰，多功能复合纳米材料以及能放大信号的二抗标记等方 面做如下研究: l、首先将纳米金沉积于玻碳电极表面，以增强电极导电性并增大对PDDA分 的吸附作用，从而将传统的直接通过共价以及非共价健作用将MWCNT和DNA 进行联接的基础上进行改进。此外，通过硫堇与DNA的静电吸附修饰于电极表面， 接着用硫堇中的-NH2与纳米金的71:(7c共轭效应固定纳米金。 2、铁氰化镍是一种非常好的电活性物质，但由于其易溶于水，在应用方面受 到了限制。希望通过引入了半胱氨酸，根据其与铁氰化镍吸附作用以提高其稳定 性，同时半胱氨酸与铁氰化镍共同作用加强对纳米金的固定。基于这些原理，设 计了铁氰化镍一半胱氨酸(金的纳米复合物，这种纳米复合物在导电性，生物亲和性 以及稳定性等方面都有优异的表现，且制备简便，使得传感器的制作过程被简化， 灵敏度被提高，选择性和稳定性均得到改善。 3、制各一种铂纳米颗粒修饰的功能化的碳纳米管，并用其标记二抗制备双抗 体夹心免疫传感器。采用硫堇修饰CNT作为二抗标记物，硫堇在作为电子媒介体 的同时充当原位还原纳米铂时的模板，进一步用纳米铂修饰功能化的CNT。这种 二抗标记物具有许多优点，硫堇为HCG的检测提供直接电化学信号，纳米铂催化 测试底液中的过氧化氢，从而进一步提高传感器的灵敏度。 6 ? 两南大学硕七学位论文 第2章 第2章基于碳纳米管,DNA,硫堇,纳米金修饰玻碳电极所制 备的高灵敏的甲胎蛋白免疫传感器 2(1引言 现在，电化学免疫传感器由于在环境分析‘431，食品工业[44,451以及临床化学【46'47】 ’ 等方面的广泛应用吸引了众多学者的兴趣。这类传感器灵敏、方便、选择性好且 价格低廉。多种纳米结构的材料，比如纳米金【48】，纳米银【491和纳米铂【501，由于具 有大的比表面积、强的吸附能力、良好的电化学性能和生物相容性而备受研究们 的青睐【511。 碳纳米管 CNTs 由于导电性好，化学性质稳定并且具有非常高的机械强度 而被广泛应用于电极的修饰过程【521。单壁碳纳米管 SWCNTs 和多壁碳纳米管 固定提供更多的结合位点【531。DNA是一种天然的生物聚合物，由于含有磷酸基而 成为带负电荷的高电解质。因而可以通过共价以及非共价键合作用固定在CNTs 上垆4J。尽管如此，这种方法的固定效果并不理想，因为CNTs的负电荷将与来自， DNA的负电荷相互排斥【55】。在本文的研究中，采用了二甲基二丙烯氯化铵 PDDA 来分散MWCNTs。PDDA是一种易溶于水的季铵，是带有正电荷的高电解质，在 水溶液中表现为带正电荷的胶体【19,561，用于溶解PDDA的水溶液通常呈弱酸性。 由于静电吸附作用，正电荷的PDDA可以被包裹于显负电的MWCNTs表面。且 PDDA分子是一种很长的阳离子高电解质，因而可以吸附很多的DNA而形成一层 导电性，除此以外，它还可以电极表面PDDA的总量。 在电化学免疫传感器的构建中，有机染料 例如:普鲁士蓝【571、亚甲基蓝【58】、 中性红以及硫堇【591等 常用于电子传输的媒介体。在本实验中采用硫堇 Thi 作 为电子媒介体，它是一种分子中带有两个-NH2的正电荷氧化还原染料，可以通过 Thi可以连接负电荷的纳米金。Thi中的(NH2与纳米金是通过兀(兀共轭效应而相互 吸引的【62,63】。 0【(甲胎蛋白 AFP 是癌胚胎的一种，也是一种非常重要的肿瘤标记物， 其单 kDa 链a(球蛋白中包含590个氨基酸和3(4,的碳水化合物畔1，分子质量大约为70 【651。AFP常见于胎儿肝脏中，其浓义勇随着胎儿成长为成人而逐渐下降。在健康 成年人的血液中，AFP的含量非常少，其浓度低于20ng??mL,166]。随着肝癌、畸 力【731。同时，纳米金能够提供稳定的传感表面及增大电极的表面积，使得更多的 膜被吸附于正电荷的PDDA膜上。再将正电荷的Thi包覆于DNA膜上以用作电子 媒介体并连接纳米金。最后，AFP抗体 anti―AFP 被修饰到电极表面，并用牛血 清白蛋白 BSA 封闭纳米金的非特异性吸附位点。本实验所构建的目标免疫传 感器在检测标准血清样品时表现出了高灵敏度和非常好的选择性以及稳定性。 2(2实验部分 2(2(1试剂与材料 MWCNTs 四川化学试剂公司 。MWCNTs使用前，将其置于2(6mol??mLd的硝 ( 酸中回流约36d'时进行纯化【74】。接下来，进行过渡并用去离子水洗至中性，再在 氮气中进行干燥。DNA溶液 1 mol??mL,Tris(HCl和 ng??mL。1 用含有0(01 PBS 用0(1 mol??mL―Na2HP04和0(1mol??mL―NaH2P04原液配置，支持电解质 mol??mL,KCl。16 是0(1 nlll的纳米金参照文献方法制备【751。AFP在使用前置于冷 冻状态，且所有的标准溶液均在使用前用去离子水现配。 2(2(2仪器 CHl660B电化学工作站 上海CHI公司 ，MP 公司 ，Bm蝌SONIC200超生清洗仪 德国BRANSONULTRASCHALL公司 ， 技公司 。 2(2(3免疫传感器的构建 1(0 mol??mL,NaCl。将1(0 mg??mL。1的PDDA水溶液在配置时要加入O(5 mg的 MWCNTs置于PDDA水溶液中，将混合物在超声仪中超声3h直至得到均 相的黑 色悬浮液。在制备PDDA(MWCNTs膜之前，就将悬浮液再次感超声15min。 8 两南大学硕十学位论文 第2章 至光滑的镜面，每一步打磨前后都用去离子水清洗干净。进行修饰前，磨干 净的 GCE依次用体积比为1:1的硝酸与去离子水，乙醇，去离子水进行超声， 最后于 空气中晾干。 …… ， ? 一?豳豳謦缀翰翻豳豳癌嘲 ?[】丽蕊菩誓[】氙蕊鬲蒜誓[】 HAllCh 捌滋裂 簿纛邈 o 1蕊，鬣[二蛋?矿鬣[二蛋百i 蝴》嬲钫 滋篇烈 Y熬豢麒 纛毯磁越 鬣匹二瀚一面蒸?鬣[二翻一弋溺r鬣?二溺一 图2(1免疫传感器的制备过程示意图 V 首先，将干净的GCE插入浓度为2 ng??mL。1的氯金酸溶液中，在电压为(O(2 的条件下进行电沉积，以GCE表面得到。一层纳米金膜【761。接着将15止的 PDDA(MWCNTs溶液滴涂于电极表面，在空气中晾干后便形成了电极的第二层膜。 然后把10此的DNA溶液也滴在电极表面，并把电极放在4?的冰箱中4h以 形 成稳定的DNA膜，这是电极的第三层膜。接下来，将电极放入3mmol??mL。1的Thi 中2 h以吸附上第四层膜，即Thi膜。第五层膜是将制备好的纳米金胶滴于传感器 的表面并晾干。然后在温度为4?的冰箱中，将电极插入anti(AFP溶液中持续12h 来为电极构造抗体膜。最后，把电极置于BSA中40min以封闭纳米金的非特异性 吸附位点。电极在不使用时放于4?的冰箱中保存。图2(1是免疫传感器制备过 程的示意图。 2(2(3测定方法 循环伏安是测定修饰电极性质的一种常用的有效方法，实验测量以免疫电极 为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极。电化学实验在室 扫速为50mV-S(1条件下进行CV测试。 这种测定方法是根据抗原(抗体发生特异性结合前后的电流变化值来对抗原进 行定量分析的，因为抗原(抗体反应所生成的免疫复合物将阻碍电子的传输，使电 流降低。当传感器在抗原中孵育过后，其峰电流值将减小，且减小会值随着抗原 浓度的增加而增大。 9 、 图2(2电极制备过程的SEM表征图 本实验中每一步修饰电极的表面形态均采用SEM进行表征 图2(2 。其中a 可明显看出表面形态发生了变化且MWCNTs的管径增大。由c图可知，当Thi被 成功固定于DNA膜上之后，碳纳米管变得模糊。图d可以证明纳米金被成功吸附 在了呦NA,MWCNTs(PDDA膜上。 2(3(2修饰电极的循环伏安表征 (0(6q (2 mV??S‘1的CV测试图。裸 V 对饱和甘汞电极 电位区间下进行扫速为50 的玻碳电极没有明显的氧化还原峰 图2(3a ，沉积了纳米金之后，背景电流稍微 增加 图2(3 提高了电极的导电性。曲线d较曲线c，背景电流稍微下降，这是由于DNA阻碍 e ， 了电子的传输。在修饰上了啦后，图中出现了一对明显的氧化还原峰 图2(3 吸附了纳米金后，峰电流再次增高 图2(3 f 。而曲线g的峰电流明显下降了，这 是因为anti(AFP被固定在了纳米金上，这种生物分子严重阻碍了电子的传输。用 h 。 BSA封闭纳米金的非特异性位点使得电流值再次下降 图2(3 10 ?2 o(0 9(2 E|’ 图2(3电极修饰过程的循环伏安表征 图2(4免疫传感器于不同扫描速度下的循环伏安图 7(0的PBS中的循环伏安图。结 图2(4是免疫传感器在不同扫描速度下于pH 果表明，随着扫描速度从50,500mV??s。1变化，氧化峰电流和还原峰电流不断的增 大 图2(4插图 ，且峰电流与扫速的平方根成线性关系，说明免疫电极上 的氧化还 原反应受扩散控制。 2(4实验条件的优化 本文研究了pH对免疫传感器性能的影响，因为强酸和强碱的环境都会破坏蛋 白质的纳米结构以及降低蛋白质的活性。除此以外，Thi的氧化还原反应中需要一 4 5 6 pH 图2(5底液酸度对免疫传感器的影响 孵育温度对抗原和抗体的特异性结合反应有着较大的影响，图2(6展示了免疫 传感器在温度于20?到45?之间的性能变化。当温度为35?时，??传感器 的电流 值最大，性能最好。但是由于考虑到实验操作的简便性，本实验的孵育均在室温 下 25? 进行。将免疫电极与20 ng??mLd的AFP进行不同时间的反应并进行循 环伏安测试，研究AFP与anti(AFP结合达到饱和的时间。如图2(7所示，在最初 的15 min min，峰电流随反应时间的增加而急剧减小，免疫反应的程度增强，在15 后，电流值基本保持不变，说明电极上结合的AFP达到饱和，故选择15min为免 疫电极的孵育时间。 图2(6孵育温度对免疫传感器的影响 图2(7孵育时间对免疫传感器的影响 12 浓度表现出两段线性: 1 在0(1到10(0 ng??mL‘1的范围内，峰电流值与抗原浓度线 限为0(04 ng??mL,。 E,V 图2(8免疫传感器对AFP的响应 2(5(2免疫传感器的选择性 选择性是评估免疫传感器性能的一种重要的性质，本文研究了六种干扰物质 对目标电极的影响。将免疫传感器孵育在包含20(0 AFP以及其它干扰物 ng??mL。1 质的标准溶液中，其余六种物质分别是:癌胚抗原 CEA，20ng??mLd ，人绒毛膜 促性腺激素 20 ng??mL。1 ，乙肝表面抗原 HBsAg，20ng??mL。1 ，抗坏血酸 20 ng??mL’1 ，BSA 10ng??mE"1 ，L(半胱氨酸 50pmol??L-o 。比较有和无干扰物质地 的电流值，发现两次测量误差不超过4(4,。结果表明，这种根据抗原(抗体特异性 吸附所制备的免疫传感器的选择非常好。 2(5(2免疫传感器的重现性和稳定性 当使用目标电极对10 ng??mLd的AFP标准溶液进行五次重复测量时，得到的 两南大学硕十学位论文 第2章 相对标准偏差为3:2,。当五支不同的传感器在同样的条件下孵育在相同浓度的 偏差为4(7,。当传感器在4?下悬置于PBS上方30d后，得到的电流值是原电 流值的79,。当免疫传感器在PBS缓冲液中从(0(6到0(2V，进行扫速为50mV??S。1 的条件下连续扫描100圈后，电流值降低了8(7,。这些结果表明，免疫 传感器的 重现性和稳定性均较好。 2(5(3应用 表2(1免疫传感器的回收率 O(2 0(196 96(3 1(O 1(02 1(02 10(0 9(72 97(2 20(0 19(53 97(7 5 50(0 51(52 103(0 用AFP的标准溶液配制五个不同浓度的AFP溶液，将传感器置于这五种AFP 溶液中孵育15min后于最佳实验条件下进行测定。表2(1是电极的测定结 果，其 回收率范围是96(5―103(0,。实验结果证明，此传感器对AFP的测定结果是可信 的。 为了研究本实验所构建的免疫传感器是否可靠，最后将此免疫传感器用于检 测人体血清中的AFP含量，并与酶联免疫吸附法进行了比较，结果呈现于表2(2。 两种方法的相对偏差介于(5(6,到6(5,。因此，本实验设计的免疫检测方法可以 被应用于人体血清中AFP的临床检验。 2(6结论 14 西南大学硕十学位论文 第2章 了纳米金的玻碳电极表面，从而制备了一种新型的电化学免疫传感器。这种新的 设计有如下优点: 1 玻碳电极上沉积的纳米金可以增加电极表面MWCNTs(PDDA Thi层后，可以通过Thi中的氨基将纳米金修饰于电极表面。本实验的方法具有线 性宽、灵敏度高、制备简易和检测限低等优点，而且同样适用于其他类型的抗原 或者肿瘤标记物的检测。 15 癌胚抗原 CEA 是一种高糖基化的细胞表面糖基蛋白，其分子质量大约为 180 比如超过95,的结肠肿瘤，50,的乳腺肿瘤，还有肺癌，卵巢癌等【79,80]。在目前 的研究中，已经设计了多种检测CEA的方法，如荧光免疫检测法I嚣?，化学发光免 疫分析法【821，酶联免疫吸附法四和电化学免疫分析法【84】。尽管检测方法已经比较 多，但这些方法的操作都比较浪费时间和样本，而且需要高端的仪器，使得成本 昂贵。因为，研究一种灵敏、方便且低廉的方法来检测人体血清中的CEA变得尤 为重要。 现在，纳米颗粒成为研究的重点并被广泛应用于电子学、机械学以及化学等。 在化学方面，研制多功能的纳米复合材料用以修饰电极更是成为了研究的热潮 185-87】。在本文中合成了一种由铁氰化镍、半胱氨酸以及金组成的纳米复合材料。 铁氰化镍是普鲁士蓝类的金属氰化物，能以电荷补尝的形成表现出良好的氧化还 方法简单，通过将镍离子和六氰合铁酸盐在室温下混合即可得到。NiHCFNPs具有 大的比表面积，良好的导电性，且因为分子中含有_NH2、(SH和(CN，能够牢固的 染等原因使得其长效稳定性欠佳19引。 L(半胱氨酸 L(Cys 是存在于天然食物蛋白质 如牛肉、鸭肉和小麦胚 中 的一种非常重要的氨基酸，常用于医药和食品工业中【舛拶71。此外，一对L(Cys,L(Cys 泄漏，并且采用了纳米金与NiHCFNPs和L(Cys一起构建一种新型的纳米复合材 止其泄漏和团聚，从而提高传感器的稳定性; 2 L(Cys可以通过-NH2，(SH与纳米 金之间的强烈吸附作用来固定纳米金; 3 L(Cys可以与纳米金联合提供良好的保 持生物活性的微环境。 构建了一种可以有效检测CEA的电流型免疫传感器。首先，将铁氰化镍(半胱 氨酸(金的纳米复合材料滴涂于干净的金电极表面以得到一层多功能纳米复合膜。 这层复合膜具有良好的稳定性，因为其各个组分都能互相结合。NiHCFNPs在充当 16 两南大学硕十学位论文 第3章 电子媒介体的同时也可以固定纳米金，且其Ni2+也可以与L(Cys中的(NH2相互结 被修饰到纳米复合膜表面，因为纳米金与anti(CEA的-NH2之间存的兀-兀共轭作用。 纳米金具有良好的生物相容性，高的比表面积并且能够为这种纳米复合物提供良 好的电化学活性。这种功能化的纳米复合机材料在用于电化学免疫传感器的时候 展现了良好的电化学特性，生物相容性以及高的灵敏度。本论文对所制备的免疫 传感器的电化学行为以及性能特征做了细致的探究。实验证明这种方法是一种有 效、简便、灵敏并可用于临床医学的有效检测CEA的方法。 3(2实验部分 3(2(1仪器与试剂 ZAHNER Elektrik公司 ，MP B,,NSONIC200超生清洗仪 德国BRANSONULTRASCHALL公司 。 癌胚抗原及抗体 CEA， 钠 美国Sigma公司 、L(半胱氨酸 中国上海康达氨基酸厂 。所有的其他试剂均 通过正规渠道购买并符合分析标准，实验的整个过程用水均为去离子水。16nnl的 纳米金颗粒参照文献制型100】。醋酸缓冲溶液由NaAc和nAc溶液配制，CEA储存 在冷冻状态，其标准溶液在使用前用去离子水配置。 3(2(2 NiHCFNPs的制备 将50mL浓度为O(01tool??mL‘1的NiCl2水溶液在不断搅拌的条件下滴入含有 0(05mol??mLd ml KCl的50 mol??mL‘1 溶液中，滴加完毕之后，持 KaFe CN 6 O(05 续搅拌5min。接下来，将混合液高速离心，并用去离子水洗多次洗涤，得到的黄 色沉淀至于氮气中干燥过夜。 NPs 的制备 3(2(3铁氰化镍(半胱氨酸(金的纳米复合物 NiHCF(Cys(Au mL h。此 把NiHCFNPs溶于10 O(1mg??mL以的L―Cys水溶液中，并持续搅拌 2 NPs置于纳米金胶溶液中缓慢搅拌lh。最后，高速离心并洗涤便得到 NPs[1011。 NiHCF(Cys(Au 3(2(4免疫传感器的制备 首先将金电极 西 4 mm 依次用O(3和0(05岬的三氧化二铝粉末打磨至镜 面，并用去离子水清冲洗。接着，再用去离子水和乙醇超声清洗5min，并于室温 17 两南大学硕七学伊论文 第3章 下晾干。最后将金电极插入0(5 和甘汞电极 电位区间内进行10圈扫速为50mV??S一的循环伏安扫描。然后，在洁 NPs溶液，并将电极置于4? 净的金电极表面滴覆lO此均匀的NiHCF(Cys(Au 的条件下干燥。而后，将电极插入anti(CEA溶液中12h，以吸附足够多的抗体。 最后，在室温下，将传感器放入BSA水溶液 0(25, 中lh以封闭纳米金的非 活性吸附位点。电极每步修饰过程之间都用去离子水冲洗干净并于4?条件下干 燥。将修饰完成的传感器放于4?的冰箱中待用，其修饰过程示意图为图3(1。 秘?NiCI-IFNPs 戮拳nano-Au ? 丫 铲二I，cvs a llanocomposite b anti-CEA c BSA ??甜‰》??轴察谢气 衩。轵蜓杈》八汉泌溆如 搦燃燃鬻,一一一一一二 一酬隧盛 嬲麟引 二二二二 一二二,一雕管 憨怿藩 图3(1传感器的制备过程示意图 3(2(4测定方法 将传感器放在以0(1 mol??mL以pH为5(5的醋酸缓冲溶液为底液的工作池中， 在0(1,-O(8V的电位区间做扫速为50mV??S(1的循环伏安扫描。抗原和抗体发生特异 性结合的之后，通过CV测定的峰电流值将发生变化，这是由于抗原(抗体特异性 结合生成的免疫复合物会阻碍电子传输。在发生免疫结合之前的电流为而，结 合之后的电流记录为，，因而反应前后的电流差即为?，，且?卢而一，。 3(3结果和讨论 3(3(1修饰电极的CV表征 循环伏安和交流阻抗都是有效表征传感器修饰过程电化学性质的手段，图3(2 mol??mL"1 是免疫传感器在O(1 pH为5(5的醋酸缓冲溶液中进行的修饰过程循环伏 NPs 修饰到电极上之后，出现了一对明显的氧化还原峰，这是 NiHCF(Cys 表面后的CV曲线，其峰电流较b曲线有明显增加，这是由于纳米金促进了电子的 传输。当anti―CEA被吸附到纳米复合膜上之后，传感器的峰电流值明显下降，这 是由于抗体是生物分子，严重阻碍了电子传输，也证明抗体被有效的固载到了电 18 第3章 极表面 曲线d 。在BSA封闭了纳米金的特异性吸附位点之后，峰电流值继续 下降，因为BSA也阻碍了电子的传输 曲线e 。 图3(2电极修饰过程的CV图 3(3(2修饰电极的EIS表征 ‰,Q 图3(3电极修饰过程的EIS图 标准的交流阻抗 EIS 曲线由半圆部分和直线部分组成，半圆的直径代表了 电子传输的电阻 k 。图3(3是电极每一步修饰过程在2(0 溶液中的EIS表征图。由于曲线a的半圆直径非常小可知，裸金电极的电阻很小。 19 均会阻碍电子传输。 3(3(3修饰电极的CV扫速与电流的关系 mol??mL。1 图3(4是修饰电极在0(1 pH为5(5的醋酸缓冲溶液中，扫速于30 mV??S_到400mV??s。1之间的循环伏安图。从图中可以看出，随着扫描速度的增加， 峰电流值也随之增加，且峰电流与扫速平方根正比，这表明此免疫传感器在醋酸 缓冲溶液中的电化学过程是受扩散控制的。 E N 图3(4免疫电极在不同扫速下的循环伏安图 3(4实验条件优化 3(4(1测试底液pH的优化 本实验研究了酸酸缓冲溶液在pH为4(0到8(0之间对免疫传感器的影响。如 图3(5所示，当pH 5(0时，CV的峰电流最高。原因可以被归纳为两方面: 1 底 时，L-Cys显负电荷，纳米金可以被牢固的固定在L(Cys上。但是，考虑到底液过 酸会影响免疫传感器的寿命，因而选择pH 5(5的醋酸缓冲做为整个实验过程的测 4 5 6 7 8 pH 图3(5测试底液pH的优化图 3(4(2孵育温度的优化 孵育温度能够影响抗原和抗体的特异异结合的程度，从而影响传感器的 检测。 因而，本实验在相同的条件下将电极置于15?到45?下进行探究。由图3(6可知， 当温度由15?到35?时，电流值明显下降，而从35?度到45?下降缓慢，说 明免疫反应已经达到最大值，因而35?是最佳孵育温度。然而，考虑到电极制备 过程中操作的便捷性，选择室温 25? 为孵育温度。 图3(6孵育温度的优化图 3(4(2孵育时间的优化 孵育时间也是影响传感器的重要因素之一。在25?的条件下，将传感器在10 2l 0 5 lO 15 20 t,min 图3(7孵育时间的优化图 3(5传感器的性能 3(5(1线性范围和检测限 E|,。 图3(8免疫传感器对CEA的响应 图3(8是在室温下，将免疫传感器在200 pL由醋酸缓冲配制的不同浓度CEA 中孵育15min后进行CV测定，所得到的CV图。图3(8中的插图是根据CEA浓 两南人学硕十学位论文 第3章 度与其相应电流值所得到的线性图，由图可知，在CEA浓度为O(05(160(0 ng??mL。1 1 的范围内，电流信号的对数与CEA浓度的对数成正比，其标准回归方程为:log 0tA 一O(3581×log 低检测限是0(02 ng??mL一。 3(5(2免疫传感器的选择性、重复性及其稳定性 为了研究免疫传感器的选择性，本实验在相同浓度的CEA溶液中加入以下不 同的干扰物质，包括:甲胎蛋白 AFP ，抗坏血酸，BSA，乙肝核心相关抗原， 乙肝表面相关抗原，多巴胺，L(赖氨酸。结果表明，该免疫电极在加入干扰物和 未加入干扰物的电流值相比仅有不超过2(8,的差异，表明该免疫传感器具有良好 的选择性。 当免疫传感器重复五次测定10(O ng??mL‘的CEA标准溶液时，其相对标准偏 差为3(4,。当其在0(1~o(8V的电位区间，以50mV??s‘1的速度连续扫描100圈以 7(0 上方 保 后，峰电流值下降了5(8,。电极不使用时，于4?下悬于PBS pH 存，每隔3,5天测试一次，结果表明在30d内，该免疫传感器电流值基本保持不 变，说明其具有较好的稳定性。由此可见，由NiHCF(Cys(AuNPs复合膜可以为传 感器提供良好的选择性、重复性及稳定性。 3(5(3回收率 表2(1免疫传感器的回收率 l 0(5 0(482 96(4 2 10(0 10(53 105(3 ， 3 20(O 19(68 98(4 4 50(0 48(78 97(6 5 100(0 102(56 102(6 为了研究此免疫传感器测定CEA所得结果的可信性，用实验所得的标准回归 方程检测了事先配制的五种不同浓度的CEA标准溶液，如表3(1所示，其回收率 范围在96(4,105(3,。结果证明，此免疫传感器可以被用于临床医学。 3(6结论 NPs上，构建了一种新型的免 本实验通过将anti(CEA固载在NiHCF(Cys(Au 疫传感器。由NiHCFNPs，L(Cys和纳米金所制备的纳米复合材料具有很多优点， NPs 第3章 西南大学硕十学位论文 可以提供大量的(SH，(CN，-NH2，因而，纳米复合膜能够直接稳定修饰到裸金电极 表面;纳米金由于有着高的比表面积，可以吸附大量的CEA抗体，同时提高此纳 米复合材料的导电性。本实验设计的免疫检测法，制备便捷，成本低廉，有着高 灵敏度，低检测限和优异的选择性、重复性及稳定性。 24 第4章 两南大学硕+学何论文 第4章基于nano(Pt修饰功能化的CNT为标记的双抗体夹心 免疫传感器的研制 4(1引言 近年来，人们对纳米材料给予了极大的关注，这是由于它是介于宏观与微观 两个层次之间的一种特殊物质，具有许多独特的性质[24-26,102】。纳米材料比表面积 大，表面活性位点多，生物亲和性强，且有着优异的光电特性，可以用于加快响 应界面电子传导和增加催化电极表面化学反应等方耐103J。所以，纳米材料常用于 吸附或者支撑免疫分子来改善免疫传感器多方面的性能，如提高灵敏度、缩短响 应时间、扩宽检测范围等。研究者们还按照需要，制备出了具有某些特定结构、 功能、性质的纳米材料，即功能化纳米材料，让纳米材料在各类应用中更加满足 人们的需要。 碳纳米管 CNT 是一种目前常用于修饰电极制备传感器的纳米材料，它能 有效的增加电极的比表面积，从而增加免疫分子等在电极表面的固定，同时CNT 可以促进电子传输，从而放大电化学信号，提高传感器的灵敏度。纯化后的CNT 是一种连续的线团结构，但其不溶性限制了其在化学方面的应用，因而人们开始 广泛研究CNT的功能化。2002年，妇iaIl【38】等在水溶液中将多种金属蛋白和酶 通过物理吸附，固定于单壁碳纳米管表面。在功能化的CNT上，人们又进一步将 在CNT表面修饰了一层巯基，从而进一步标记上了均匀的纳米金颗粒。 本实验首先将DNA交联到CNT表面，使其表面带有负电荷[54】，再通过DNA 溶液中，进行原位还原，制各出表面附着铂纳米颗粒的CNT。用Pt―CNT同时标记 极，以进一步提高电极的灵敏度，制得了高灵敏的夹心法HCG免疫传感器。 4(2实验部分 4(2(1仪器与试剂 CHl660A电化学工作站 上海CHI公司 ，人绒毛膜促性腺激素抗体及抗原 25 西南大学硕十学伊论文 第4章 mg??mL_ pH 8 。其它试剂均为分析纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。 mL 首先制备巯基化的碳纳米管:将事先羧基化的碳纳米管分散于1mL的400 mL EDC和100NHS溶液中，在室温下匀速搅拌3h后离心。所得碳纳米管移入 DNA溶液中搅拌过夜后离心，并再次分散于硫堇中，等充分反应后离心并用去离 mm，然后在剧 将巯基化的碳纳米管分散于H2nCl6-6H20水溶液中并超声30 烈的搅拌下逐滴加入新制的NaBH4溶液 O(5 mg??mL。1 。滴加完成之后，继续搅拌 15 min后高速离心，将得到的黑色沉淀用去离子水反复洗涤以去掉多余的铂纳米 颗粒。最后将黑色沉淀在氮气中干燥过夜即得到Pt(CNT。 mL的0(005 将Pt(CNT分散于2 mg??mLd的anti―HCG Ab2 和1mg??mL。1的 HRP中，搅拌过夜后高速离心，加入BSA溶液搅拌1h，以封闭纳米铂上可能存 7(4的PBS中，制得了CNT(Ab2， 在的非特异性活性位点，再次高速离心，分散于pH 童击蠢寺羹?耄?拇霉 。志?古? 图4(2传感器制备过程示意图 依次用1(O，0(3和0(05 mnl的玻碳电极抛光成镜面， gm的A1203粉末将痧 4 每一步打磨之间都用去离子水清洗干净。进行修饰前，磨干净的GCE依次用体积 两南大学硕十学位论文 第4苹 比为1:1的硝酸，无水乙醇，去离子水进行超声清洗，最后于空气中晾干。将电极 置于HAuCl4溶液中，于(O(2V的电位下沉积60s，得到纳米金修饰的GCE，取出 后用去离子水清洗，然后置于anti(HCG溶液早于4?环境下浸泡过夜，最后在室 h以封闭电极表面可能存在的非 温下将传感器插入BSA溶液 O(25, 中浸泡1 特异性活性位点，即得免疫传感器。置于4?冰箱中保存待用。图4(2是免疫传 感器的制备示意图。 ( 4(2(3免疫传感器双抗体夹心法的测试过程 将制备好的传感器于HCG抗原溶液中进行50min的孵育，并用去离子水清洗， min，接着也用去离子水清洗。在测试底液中加入 再置于CNT(Ab2溶液中孵育50 过氧化氢的条件下，在(0(5~o(0V的电位区间进行差动脉冲伏安法 DPV 测定， 根据不同浓度的HCG抗原对应的DPV电流值绘制标准测试曲线。 4(3结果与讨论 4(3(1电极在自组装过程中的循环伏安表征 图4(3是用2 的电位区间，以50mV??s。1的扫速用循环伏安 CV 表征电极的制备过程。曲线a 是裸的玻碳电极，曲线b是沉积纳米金后的CV曲线，其峰电流值较曲线a增高， 说明纳米金促进了电子的传