鞘内注射盐酸奈福泮和可乐定对福尔马林致痛大鼠的镇痛作用研究

鞘内注射盐酸奈福泮和可乐定对福尔马林致痛大鼠的镇痛作用研究 鞘内注射盐酸奈福泮和可乐定对福尔马林 致痛大鼠的镇痛作用研究 山虿职Z廛学院雩报2009年5月第19卷第2期 JournalofShanxiMedicalCollegeforContinuingEducationVo1.19No.2May2009 鞘内注射盐酸奈福泮和可乐定 对福尔马林致痛大鼠的镇痛作用研究 王海斌,程桥 (1.山西医科大学,山西太原030001;2.山西医科大学第一医院,山西太原030001) [摘要]目的:观察鞘内注射奈福泮及可乐定对福尔马林致痛大鼠的镇痛效应及对脊髓背角c—fos达的影 响.方法:选择鞘内成功置管的雄性SD大鼠32只,随机分为4组(n=8):对照组(S)鞘内注射生理盐水20L, 奈福泮(Nfp)组鞘内注射2Og奈福泮,可乐定(c)组鞘内注射2Og可乐定,奈福泮和可乐定联合用药(Nfp+C) 组鞘内注射奈福泮10lxg和可乐定10g.在大鼠足底部注射5%福尔马林后立即记录1h内每5rain的缩腿,舔爪时 间.足底注射福尔马林后2h将所有动物处死取脊髓膨大处,采用免疫组织化学方法观察脊髓背角c-fos的表达. 结果:各组大鼠第二相缩腿,舔爪累计时间进行比较,联合注射组的缩腿,舔爪累计时间显着短于其他组(P< O.01);联合注射组大鼠的脊髓背角FLI—N(C—fos免疫阳性反应神经元)数目明显低于单独用药组(P<0.01).结 论:奈福泮与可乐定鞘内联合应用可能具有协同镇痛作用. [关键词]奈福泮;可乐定;鞘内注射;镇痛;c—fos [中图分类号]R96[文献标识码]A[文章编号]1671-0126(2009)02-0015-04 StudyonAnalgesicEffectofIntrathecalNefopamHydr0chl0rideandClonidineon theRatsInducedPainbyFormalin WANGHaibin,CHENGQiao (1.ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,Shanxi,China;2.TheFirstHospitalofShanxiMedicalUniversity, Taiyuan030001,Shanxi,China) [ABSTRACT]Objective:ToobservetheanalgesiceffectofintrathecalNefopamHydrochlorideandClonidineonthe ratsinducedpainbyFormalinandthec-fosexpressionindorsalhornofspinalcord.Methods:Thirty-twomaleSDrats wererandomlydividedinto4groups(n=8each).Theywereacontrolgroup,whichwasinjectednormalsaline20Lin- trathecally,aNefopamHydrochloride(Nfp)group,whichwasinjectedNefopamHydrochloride20Ixgintrathecally,a Clonidinegroup(C),whichwasinjectedClonidine20ixgintrathecallyandaNefopamHydrochloridecombinedwith Clonidinegroup(Nfp+C),whichwasinjectedNefopamHydrochloride10txgandClonidine10txgintrathecally.The timeofdrawinglegsandlickingclawswasimmediatelyrecordedevery5minuteswithinanhourafter5%formalinwas injectedintoplanta.Alltheanimalswerekilledtotakesometissueintheenlargedlumbarspinalcordafter2hoursof injecting5%formalinintoplantatoobservetheexpressionofc— f0sindorsalhornofspinalcordbyimmunohistochemis— try.Results:Comparedtheaccumulativetimeofdrawinglegsandlickingclawsofphase11inratsofeachgrouprespec- tively,theaccumulativetimeofdrawinglegsandlickingclawsofcombinedgroupwasobviouslyshorterthanthatofother groups(P<0.01).NumbersofFLI—N(C— Foslikeimmunoreactiveneurons)ofthespinalcordinthecombinedgroup weresignificantlylowerthanthoseofsingle— druggroup(P<0.O1).Conclusion:ThecombinationofNefopamHydro— chloridewithClonidinemayhaveobvioussynergisticanalgesiceffect. [KEYWORDS]NefopamHydrochloride;Clonidine;intrathecalinjection;analgesia;c— f0s 近几年实验和临床研究均发现鞘内注射可乐定具 有明显的抗损害作用和镇痛作用,其在脊髓水平与阿 片类药,局麻药均有协同作用.盐酸奈福泮是一种新 型非麻醉镇痛药,与可乐定在脊髓水平上是否有协同 作用尚不清楚.另外,研究表明c—f0s原癌基因是即刻 早期基因家族的一员,伤害性刺激可在中枢神经系统 内诱导c—f0s表达,且疼痛的程度与c.f0s基因表达呈 正相关….在疼痛研究中许多学者将c.f0s表达作为 ? 15? 山豇口Z压学院学掘2009年5月第l9卷第2期 研究伤害性信息传导通路的标识物].本研究在福 尔马林致痛模型大鼠鞘内注射可乐定和奈福泮,观察 鞘内注射可乐定和奈福泮对大鼠脊髓后角c-f0s基因 表达的影响. 1材料与方法 1.1药品与试剂 可乐定(上海史瑞克公司);奈福泮(湖北同济奔达 鄂北制药有限公司);c.f0s一抗血清(北京中杉金桥生 物技术有限公司);PV-6002和DAB试剂盒(北京中杉 金桥生物技术有限公司);4%多聚甲醛粉剂(天津傲然 细化工研究所,20051128);5%水合氯醛注射液. 1.2动物与分组 健康成年sD大鼠,体重250g,300g,由山西医 科大学实验动物中心提供.32只纯种雄性SD大鼠随 机分4组,每组8只.对照组(S):鞘内注射0.9%氯 化钠20L可乐定;奈福泮(Nfp)组鞘内注射20g的 奈福泮;可乐定(C)组鞘内注射2OIxg;奈福泮和可乐 定联合用药(Nfp+c)组鞘内注射奈福泮10g和可乐 定10g. 1.3蛛网膜下腔置管 SD雄性大鼠于实验前放在安静,温暖和避强光的 饲养环境内24h.腹腔注射5%水合氯醛6mL?kg一, 按杨建平等采用的方法进行鞘内置管j.取无运动 障碍的动物于置管3d后IT2%利多卡因20L,如注 药后30s未出现双下肢麻痹,则舍去不用.动物均分 笼单独饲养5d,即可用于实验. 1.4福尔马林致痛模型 根据Dubuisson等采用的方法将大鼠置于观察 ,台下斜放一镜子(与平台成 台上的2000mL烧杯中 30角)以便观察大鼠行为变化,待大鼠适应环境 30min后,经导管给予实验药物或生理盐水20, 10min后,用100txL微量进样器在大鼠足底部注射5% 福尔马林100IxL. 1.5行为学反应观察 在大鼠足底部注射5%福尔马林后立即记录1h内 每5min的缩腿,舔爪时间. 1.6los蛋白表达 大鼠足底注射福尔马林后2h腹腔注射5%水合氯 醛6mL?kg麻醉,开胸显露心脏,经升主动脉插管, 以200mL生理盐水冲净血液,随即灌注含4%多聚甲 醛的0.1mol/L磷酸缓冲液500mL(PB液pH值为 7.4).取脊髓腰膨大处,置于上述固定液中后固定约 3h(4~C),再浸于20%的蔗糖(4~C)中过夜至沉底. 冠状冰冻连续切片,片厚8Ixm,用二步法进行免疫组 . 】6? 织化学反应. 1.7图像 每只大鼠于L4节段取2张切片,每张切片含4个 标本,用BX一51型Olympus显微镜及BIS-2000数码显微 图像分析系统进行图像分析,Fos样免疫反应(FLI)阳 性神经元呈圆形或者卵圆形,细胞核呈棕黄色,胞浆和 核仁均不染色,易与周围背景区别.无论染色深浅,只 要在低倍和高倍镜下与背景区分明确,即行计数.收集 下列数据:依Relex分层将脊髓灰质分10层,并进一步 分为4个区:浅层(I,?层),固有核(?,?层),颈部(V, ?层),腹侧灰质(?一X层).计数每个标本脊髓背角浅 层(I,?层)的FLI阳性细胞数目. 1.8统计学分析 数据采用均数?标准差表示,采用SPSS13.0统计 软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,P< 0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1各组行为学比较 实验发现各组在左后爪底皮下注射5%福尔马林 后,立即出现缩腿,舔爪反应,其注射爪缩腿,舔爪反应 明显表现为两相反应,第一相为注射福尔马林后立即 开始,持续约5min,经过约10min的相对无反应的间 歇期,开始第二相反应,此阶段持续约45min.各组大 鼠的非注射爪活动自如,无缩腿,舔爪反应.将各组大 鼠第二相缩腿,舔爪累计时间分别进行比较,见表1, Nfp组与c组Nfp+C组的缩腿,舔爪累计时间短于S 组(P<0.01).Nfp+C组的缩腿,舔爪累计时间明显 短于其他组(P<0.01). 表1各组大鼠第二相缩腿,舔爪累计时间的比较 Table1ComparisonoftheAccumulativeTimeofDrawingLegs andLickingClawsofPhase?inRatsofEachGroups 组别第二相 S组 C组 Nfp组 Nfp+C组 1412.13?203.54 793.89?185.62 986.76?194.37 516.43?115.23' 注:与S组比较,P<0.01;与C组比较,#P<0.01; 与Nfp组比较,?P<0.01 2.2各组脊髓背角f0s蛋白表达 对照组见大量FLIN,主要分布在I,?层,与各组 比较,对照组脊髓背角c—f0s表达增加(P<0.01); Nfp+C组脊髓背角c—f0s表达明显低于其他组(P< 0.01).见表2. 王海斌等:鞘内注射盐酸奈福泮和可乐定对福尔马林致痛大鼠的镇痛作用研究2009年5月第l9卷第2期 表2脊髓背角浅层FLI阳性细胞数目的比较 Table2ComparisonofNumbersofFLI?N-PositiveCells intheSuperficialLaminaeofSpinalDorsalHorn个 组别FLI阳性细胞数目 S组 C组 Nfp组 Nfp+C组 注:与S组比较,$P<0.01;与C组比较,<0.Ol; 与Nfp组比较,AP<0.O1 3讨论 福尔马林致痛模型能模拟临床慢性炎性疼痛,对 福尔马林引起组织损伤所产生的缓慢而持续性的伤害 性刺激机体可作出相应反应,是目前国内外已公认的, 较短期机械或热刺激更为可靠的动物疼痛模型,已普 遍应用于疼痛机制研究及镇痛药物.本实验采用 5%福尔马林行大鼠后爪底皮下注射复制福尔马林致 痛大鼠模型,并采用Abbott等推荐的以大鼠缩腿, 舔爪时间之和作为行为学观察指标,因此观察指标较 单一行为学指标如缩腿或舔爪时间能更好的反映疼痛 学评分. los是原癌基因c—los的表达产物,是一种核内磷 酸蛋白,f0s与其他核内DNA结合蛋白组成调节转录 的AP.1复合物,从而干扰其他基因的转录速率.正常 情况下细胞内c.f0s很少表达,外周伤害性刺激等因素 可激活脊髓内c-fos基因并表达los.一定程度上los 免疫反应阳性神经元的数量与所受刺激的强度成正 比,fos表达是评价药物镇痛效能的有效方法J.有研 究表明J,福尔马林致痛后2h,脊髓背角f0s表达达到 高峰.故本实验选择注射福尔马林后2h这一时间点 对f0s表达进行检测.本实验发现:福尔马林痛刺激 诱发的FLI阳性神经元主要分布于脊髓背角各层,但 主要集中在大鼠致痛侧背角的I,?V,?层,这与 Buritova等报道的一致,说明这些神经元参与了机械 伤害信息的传导和调控.这一部位与传递外周伤害性 信息的初级传人c纤维的终止区及背角痛敏神经元 的分布区一致,也与电生理记录的对伤害性刺激反应 的背角神经元的分布部位相重叠.表明背角FLI阳性 神经元大都是感觉通路上的二级神经元或中间神经 元.鉴于福尔马林痛刺激所诱发的FLI阳性神经元主 要集中分布在与致痛侧同侧的脊髓背角I,?层,故本 文只统计脊髓背角浅层(I,?层)的阳性细胞数目. 奈福泮是中枢镇痛药,但具体的作用机制还不清 楚.Verleve等研究发现奈福泮可以阻塞电压敏感 钠通道,结果导致在突触前膜谷氨酸释放减少,降低了 在突触后膜由于谷氨酸受体NMDA激活引起的神经 兴奋性,而产生中枢镇痛作用.本研究观察到大鼠鞘 内注射奈福泮可使大鼠缩腿,舔爪时间之和明显降低; 同时抑制脊髓背角I,?层的c—f0s免疫阳性反应神经 元的数量,表明NFP可能是通过抑制了与伤害性感受 的传导有关的脊髓背角Fos阳性神经元的活动,阻止 了伤害性感受在脊髓内的进一步传导,从而产生抗伤 害作用.可乐定是仅肾上腺素能激动剂,作用于一级 神经元突触前膜和二级神经元突触后膜的仪:受体,通 过激活细胞内第二信使,开放K通道,使细胞超级 化,抑制细胞内钙离子浓度增加,使一级神经元P物 质释放减少,二级神经元动作电位难以产生,在突触部 位抑制伤害性信息的传递,调节疼痛过程.实验观 察到鞘内注射可乐定可使大鼠缩腿,舔爪时间之和明 显降低,表明可乐定鞘内注射有较好的镇痛效果;同时 脊髓背角I,?层的FLI—N阳性神经元均较对照组 明显减少,提示可乐定在镇痛中对c.f0s蛋白的抑制发 挥镇痛作用. 本研究发现两种药物剂量减半后联合注射所产生 的镇痛效应明显优于单独用药组且奈福泮与可乐定鞘 内联合应用时显示协同镇痛作用.Brerenbaum1989年 提出:当二种或二种以上的药物作用于一个共同通路 上的不同关键作用点时,协同效应即可以产生,如果这 些药物不是作用于一个共同的通路,或是作用于相同 的作用点时,将不会产生协同效应…J.在神经系统内 存在两大类传导通路:感觉(上行)传导通路和运动 (下行)传导通路,考虑本实验中奈福泮和可乐定的协 同效应可能正是作用于一个外周刺激向上传导的共同 通路:外周一脊髓一高级中枢,即外周伤害刺激一脊神 经节外周一伤害性传人神经纤维一脊神经节的中枢 突H脊髓背角对侧脊髓丘脑外侧束一背侧丘脑++经内 囊后肢投射到中央后回中上部和中央旁小叶后部.因 为它们的关键作用点不同:可乐定作用于一级神经元 突触前膜和二级神经元突触后膜的受体,使一级神 经元P物质释放减少,二级神经元动作电位难以产 生,在突触部位抑制伤害性信息的传递.而奈福泮主 要作用于脊神经节的中枢突的突触前膜Na通道,所 以发挥协同效应.由于奈福泮的作用机制尚不清楚, 两者合用的效应机制有待进一步研究. [参考文献] [1]BulittE.Expressionofclfos-likeproteinasamarkerfoneuroalactivity followingnoxiousstimulationintherat[J].CompNeurol,1990, 296:5l7-530. [2]DraguowM,FaullR.Theuseofc—fosasametabolicmarkerinneuro- nalpathwaytracing[J].NeutosciMeth,1989,29:261-285. ? l7? #? I # 73195166 321l +一??+一 3724 601 2986 8342 山职互屋亏院亏搪2009年5月第19卷第2期 杨建平,蒋豪,吴珏.大鼠蛛网膜下腔埋管并长期留置操作的 改进[J].中华麻醉学杂志,1993,13:110一?2. DubuissonD,DennisSG.Thefommlintest:aquantitativestudyofthe analgesicefectsofmorphine,mepefidineandbrainstemstimulationin ratsandcats[J].Pain,1977,4:161—174. AbbottFV,FranklingKB,WestbrookRF.Theformalintestscoring propertieofthefimtandsecondphasesofthepainresponseinrats [J].Pain,1995,60:91.102 MunglaniR,HuntSP.Molecularbiologyofpain[J].BrJAnesthe— sia,1995,75(2):186-192. 林雪梅,王泉云,朱琳,等.福尔马林致痛对大鼠行为学及脊髓 NO,los的影响[J].四川大学,2003,34(3):523-526. BuritovaJ.BessonJM.Effectsofnefopamonthespinalnociceptive processes:ac—Fosproteinstudyintherat[J].EurJPharmacol, 2002,441(2):67-74. [9]VerleyeM,AndreN,Heulardl,GillardinJM.Nefopamblocksvolt— age-sensitivesodiumchannelsandmodulatesglutamatergictransmis— sioninrodents[J].BrainRes,2004,10:249-252. [10]罗炜,石翊飒,刘亚玲.可乐定与新斯的明在椎管内镇痛的作 用机理[J].中国医学理论与实践,2007,11(17):1109.1111. [11]BerenbaumMC.Whatissynergy?[J].PharmacolRev,1989,41: 93一l4l [作者简介]王海斌(1980一), 科大学硕士研究生在读. D1S1676在山西汉族人群中的遗传多态性 车莎,张更谦,郭大玮,刘艳琼 (山西医科大学,山西太原030001) 男,山西垣曲人,2oo6级山西医 本文编辑:李夏 [摘要]目的:对基因座DIS1676的基因多态性和法医学意义进行研究.方法:山西汉 族人群中随机筛选110 例无关个体,提取静脉血,用GDB中的引物进行PCR扩增,银染显色.对其筛选的等 位基因测序,构建等位基因 分型标准物;按照ISFG原则命名各等位基因.结果:本研究首次选择了常染色体基 因座D1S1676,该基因座为4 核苷酸简单重复STR,重复单位为[GAAG]...在l10例山西汉族无关个体血样中共 检出了6个等位基因.其个 人识别能力(DP)和非父排除率(PE)为0.920和0.630,其基因型分布符合Hardy— Weiberg平衡(P>0.05).结 论:基因座D1SI676具有较高的遗传多态性,在法医学及人类遗传学方面具有较高 应用价值. [关键词]短串联重复序列;聚合酶链反应;D1SI676;遗传多态性 [中图分类号]Q987[文献标识码]A[文章编号]1671-0126(2009)02-0018-03 GeneticPolymorphismofD1S1676inShanxiChineseHanPopulation CHESha,ZHANGGengqian,GUODawei,LIUYanqiong (ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,Shanxi,China) [ABSTRACT]Objective:TostudygeneticpolymorphismofD1S1676locusanditsforensic significanceinShanxiHan p0pulation.Methods:Onehundredandtenunrelatedindividualswererandomlyselectedtoh aveintravenousbloodDNA extractedfromperipheralbloodandthencarriedoutPCRamplificationbyprimerinGDBand visualizedbysilverstai— ning.TheallelesscreenedweresequencedtoestablishstandardallelicladderofD1S1676lOCHSandthentonameeach a11e1esaccordingtotheprincipleofISFG.Results:AnautosomallocusD1S1676hadbeenfirstchoseninthestudy, whichwasasimpletetranucleotideSTRandtherepeatunitwas[GAAG].sixalleleshadbeendetectedfromblood samp1es0f110unrelatedindividuals.Bothofthediscriminationpower(DP)andtheparentageexclusionprobability (PE)were0.920and0.630.ThegenotypedistributionofD1S1676locuswasinaccordancewithHardy—Weinberg equilibreum(P>0.05).Conclusion:ThelocusD1S1676hashighergeneticpolymorphismandapplicationvalueinfo- rensicmedicineandhumangeneticsresearch. 『KEYWORDS]shorttandemrepeat;polymerasechainreaction;D1S1676;geneticpolymorphism 【基金项目】I西省自然科学基金资助项日(20051046) 通讯作者:张更谦,山西医科大学法医物证教研窒,Email:zgengqian@163.com ? l8? :]ji