水牛健康与闭锁优势卵泡中颗粒细胞凋亡的生物学特征

水牛健康与闭锁优势卵泡中颗粒细胞凋亡的生物学特征 水牛健康与闭锁优势卵泡中颗粒细胞凋亡 的生物学特征 950中国兽医2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vo1.27No.6 水牛健康与闭锁优势卵泡中颗粒细胞凋亡的生物学特征 何宝祥,杜玉兰,郑喜邦,余四九 2.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 (1.广西大学动物科技学院,广西南宁530005; 730070) 摘要:采用组织学苏木精伊红(HE)染色与光镜检查,荧光显微镜检查和DNA电泳技术,检查了水牛健康优势卵泡 (HDF)和闭锁优势卵泡(ADF)中颗粒细胞(GCs)凋亡的生物学特征.此外还应用孕酮处理早期的ADF,应用流式 细胞术(FCM)方法检查该激素诱发Gcs凋亡的情况HE染色和荧光显微镜检查结果显示,HDF和ADF都舍有 凋亡的Gcs,只是ADF中凋亡的Gcs较多.凋亡Gcs的HE染色现细胞体积缩小,染色浓黑,荧光原位检测发现 核浓缩.DNA电泳分析表明,在HDF中未发现Gcs的DNA降解,而在ADF中因闭锁程度不同而表现不同程度的 DNA降解,出现典型的"拖尾"带,但均未出现具有细胞凋亡特征的DNA"Ladder".FCM检查结果见到早期的 ADF存在着DNA的降解,孕酮处理使DNA降解碎片显着增加.上述结果提示,在水牛的HDF中,Gcs的凋亡很 少,在ADF中Gcs的凋亡较多.水牛ADF中Gcs的死亡,少量是以凋亡方式发生的,而坏死是主要方式. 关键词:水牛;卵泡颗粒细胞;优势卵泡;细胞凋亡 中图分类号:$814;$823.83文献标识码:A文章编号:1005—4545(2007)06—0950—05 Biologicalcharacteristicsofgranulosacellapoptosisinhealthyandatrestic dominantfolliclesofbuffaloovary HEBao—xiang,DUYu—lan,ZHENGXi—bang,YUSi— jiu.(1.CollegeofAnimalScientific andTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China;2.AnimalMedicineCollege, GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China) Abstract:Biologicalcharacteristicsofgranulosacells(GCs)apoptosisinhealthydominantfollicle(HDF)and atresticdominantfollicle(ADF)inbuffalosovarywerestudiedhistologically:hematoxylinandeoMn(HE)stain— ing,lightmicroscope,fluorescencemicroscopeandDNAe1ectrophoresis.Furthermore,theearlyADFwaswith orwithouttreatedbyprogesteroneandGCsapoptosiswasexaminedbyflowcytometry(FCM).Theresultsof lightmicroscopeandfluorescenceexaminationshowedthatbothHDFandADFhadtheapoptoticGCs,ADFhad moreapoptoticGCsthanHDF.ApoptoticGCsappearedsmaller,nuclearcondensatedanddyeing—darkunderlight microscopebyHEstaining.Thenuclearcondensationwasconfirmedbyfluorescencedetection.TheGCsDNA fragmentsinHDFhadnotbeenseenbye1ectrophoresis,whilesomeDNAfragmentswithvariousdegree f"smear"pattern)hadbeenseeninADF.but"ladder"patternhadnotbeenseeninADF.DNAdegradationwas alsodetectedbyFCMandprogesteronetreatmentofearlyADFincreasedDNAfragments.Itwassuggestedthat therearefewapoptosticGCsinHDFandtherearemuchmoreapoptosticGCsinADF.Therearetwokindsof deathmanner(apoptosisandnecrosis)inADFinbuffalo,onlyafewGCsdiedofapoptosis,andmostGCsdiedof necrosis. Keywords:buffalo;folliculargranulosacell;dominantfollicle;apoptosis *Correspondingauthor 随着动物生殖技术研究的不断深入,动物卵巢 收稿日期:2005—11-13 基金项目;广西壮族自治区科学基金资助项目(桂基科 0144009);广西壮族自治区教育厅资助项目(桂教科研 (20023316);广西大学科研基金(2003). 作者简介:何宝祥(1958一),男,教授,博士. *通讯作者,E—mail:sjyu@163.COrn 卵泡闭锁机理的深入研究显得更加需要.我们在水 牛卵泡细胞凋亡的研究中,已经对胎儿,初情期前和 成年水牛的卵巢卵泡组织应用HE染色的显微结构 检查,DNA原位末端标记(TUNEL),透射电镜的 超微结构观察等手段,研究了卵母细胞,卵泡颗粒细 胞凋亡的生物学特征.本试验试图检查采集自屠宰 场水牛卵巢健康优势卵泡(HDF)和闭锁优势卵泡 中国兽医2007年11月第27卷第6期Chinc,VetSciNov.2007Vo1.27No.6951 (ADF)中颗粒细胞(GCs)凋亡的生物学特征,为进 一 步揭示水牛卵泡闭锁机理积累科学资料. 1材料与方法 HDF与ADF的确定:优势卵泡(dominantfol— licle,DF)是被检卵巢上同波卵泡中5mm以上的 最大卵泡,但水牛健康优势卵泡(HDF)的外观有光 泽,卵泡颜色粉红色,肉眼可见卵泡壁有毛细血管分 布,血管内含有新鲜血液;卵泡液清亮,无絮状物.而 闭锁优势卵泡(ADF)也是被检卵巢上5mm以上的 最大的卵泡,但外观无光泽,卵泡呈乳白,黄色至深 黄色,卵泡液浑浊,内含多量絮状物;卵泡壁没有肉 眼可见的,含鲜血的毛细血管. 1.1GCs的HE染色 1.1.1试剂多聚甲醛,配置D—Hanks液的各种 化学试剂均购于美国Sigma公司. 1.1.2卵巢选择南宁地区某屠宰场水牛卵巢,待 水牛屠宰后,及时摘取卵巢并立即放入盛有冷PBS 液的送样瓶内,2h内送达实验室.选取有DF的卵 巢用于本试验. 1.1,3卵泡GCs的收集在超净工作台下,用无 Ca/Mg的D—Hanks液(含双抗)冲洗整个卵巢3 , 5次;用一次性5mL注射器和16号针头吸取DF 的卵泡液,用DMEM—F12培养液冲洗吹打GCs层, 收集GCs悬液;1500r/rain离心2min,弃去上清; 用D—Hanks液继续洗涤1,2次,最后用DHanks 液悬垂GCs即获得GCs悬液.此过程在最短的时间 内完成.为检查GCs细胞存活状况,应用台盼蓝染 色法检查l1]. 1.1.4GCs固定,涂片,HE染色检查取上述 GCs悬液,在离心浓缩后用4多聚甲醛4C固定过 夜;离心,弃去上清,用PBS液洗涤1次,离心后,弃 去大部分上清,仅留1O0L左右PBS液并将细胞 重新悬垂,用微量移液器吸取少量悬液,制作GCs 涂片,室温风干,按照HE常规方法染色,脱水,封 片.在光镜下用不同放大倍数观察GCs凋亡情况并 拍照. 1.2GCs的荧光原位检查 1.2.1试剂与器材细胞凋亡一Hoechst荧光染 色试剂盒购于国内碧云天公司.荧光显微镜由广西 大学动物繁殖所提供. 1.2.2GCs收集卵泡的鉴定及GCs的收集与 HE染色标本的相同,获得的GCs悬液收集于1.5 mL离心管内. 1.2.3固定,涂片按照试剂盒说明进行.在收集 的GCs中加入0.5mL固定液,缓缓悬起细胞,固定 10min(或更长时间).离心除去固定液,用PBS洗 涤2遍,每次3min,并在洗涤期间用手晃动几次. 最后1次离心后,除去大部分液体,只保留少量液 体,再缓缓悬起细胞,滴加至载波片上涂片,尽量使 细胞分布均匀. 1.2.4染色与观察涂片稍晾干,使细胞贴在载波 片上不易随液体流动.在暗室条件下,均匀滴上0.5 mLHoest33258荧光染色液,染色5min.用吸水 纸从边缘吸取液体,微晾干.在载玻片上滴1滴抗荧 光淬灭封片液,盖上干净盖玻片,尽量避免气泡. 在暗室用荧光显微镜观察卵泡GCs凋亡的荧 光原位形态特征,,拍照. 1.3GCs的DNA电泳分析 1.3.1仪器台式高速低温离心机,恒温水浴箱, 全套琼脂糖凝胶电泳装置由广西大学动科院动物繁 殖所提供;凝胶电泳照相系统由广西大学动物科技 学院预防兽医学教研室提供. l,3.2试剂DNA抽提试剂盒(GEN0MICDNA ISOLATIONKIT,PUREGENE)购于美国Gen— tra公司,1O0bpDNALadder分子量标准品,蔗糖, 无DNA酶活性的RNA酶均购于Promega公司. Tris,EDTA,溴酚蓝,溴化乙啶购自中建公司. 1.3,3卵巢卵泡样品的收集卵巢收集,HDF与 ADF的确定及GCs的收集同1.1.2和1,1.3.本试 验共选7头水牛的卵巢,1号样来自间情期水牛健 康DF;2号样来自间情期水牛早期的ADF;3号样 来自发情后期排卵后所剩的第一大卯泡;4,5,6,7 号样来自成年间情期水牛中,后期ADF. 1.3.4GCs的收集经培养液或PBS液洗涤,离 心获得的健康或闭锁DF的颗粒细胞悬液,尽快分 别收集于1,5mL小型离心管内,并立即进行DNA 抽提. 1.3.5DNA的提取在确保足够的细胞数量(1× 10.,2×10.个细胞)后,按照DNA抽提试剂盒说 明书进行,简单过程有:(1)细胞裂解,(2)RNA酶处 理,(3)沉淀蛋白,(4)沉淀DNA,(5)DNA水合,进 行电泳. 1.3.6DNA电泳制备好电泳用1.8凝胶,鼍1 ×TAE电泳缓冲液中;将5,7L抽提的DNA与 1,2L上样缓冲液混匀后,立即加入已制备好的 凝胶样品孔中;以1O0bpDNALadder作对照.室 温,恒流120mA,电泳45,60min,溴化乙啶溶液 染色5,10min,蒸馏水脱色2次,每次5min;在全 952中国兽医2007年11月第27卷第6期Chin,VetScNov.2007Vo1.27N0.6 套凝胶电泳照相系统下观察拍照,描述和分析2种 卵泡的电泳结果. 1.4ADF中GCs的DNA流式细胞术(FCM)分析 1.4.1主要仪器与试剂流式细胞仪(Becton Dickinson,SanJose,CA,USA),由广西大学动物 繁殖所提供.碘化丙啶(PI)购于Roche公司. 1.4.2卵巢的收集与GCs样品制备从南宁地区 某屠宰场获得有5,8mmDF的成年水牛卵巢2 枚,收集的2枚卵巢上的DF都处在闭锁早期,对其 中1枚卵泡腔内注射孕酮1,2fig(PBS稀释后的 总量)处理5rain.另1枚不做任何处理.收集卵泡 GCs(方法同1.1.3).离心收集的GCs用约300ffI 培养液重悬,然后缓慢加入预冷的75乙醇1.5 mL,边加边摇匀,4C固定,次日测定. 1.4.3样品测定样品测定前,用0.01mol/L的 PBS(pH7.2)洗涤,离心(1500r/rain,2rain),然后 重悬于1.5mLPBS中,在暗室中加入PI(1g/L)5 L,混匀,立即用FCM检测. 对水牛的ADF和孕酮处理的ADF在FCM上 分析GCs凋亡和DNA含量,对结果进行综合分析. 2结果 2.1颗粒细胞HE染色的特征 2.1.1HDF中颗粒细胞HE染色的特征经过涂 片,HE染色以及光镜检查,发现HDF中都有存活 的GCs和凋亡的GCs.这些GCs在分布形式上,有 些散在,少数聚集成团;在活细胞比例方面,经多张 颗粒细胞涂片的观察,配合台盼蓝染色法计数证实, 绝大部分健康卵泡中的活细胞数在8O%以上.存活 GCs在HE染色中颜色较淡,多分散存在.凋亡的 GCs染色深,呈蓝紫色,细胞体积缩小,有的凋亡细 胞单个分布,许多凋亡的GCs聚集成团存在(图1). 2.1.2ADF中颗粒细胞HE染色的特征存活的 和凋亡的GCs都存在于ADF中.在细胞涂片上,与 HDF的相比,颗粒细胞散在的较少,聚集成团的细 胞较多.在活细胞比例上,台盼蓝染色法计数发现 ADF中活GCs比例大多不到60,凋亡的GCs比 例较高,凋亡小体及可见细胞碎片很多.在GCs形 态方面,健康的GCs与凋亡的GCs易于分辨,健康 GCs的形态特征与HDF的相同.而凋亡的GCs表 现细胞体积呈不同程度的缩小,或出现凋亡小体,它 们的染色呈不同程度加深(图2).在油镜下观察颗 粒细胞涂片(图3)可清楚地看到健康GCs体积大, 染色淡蓝,细胞质和细胞核结构清晰;凋亡GCs随 凋亡程度加深而体积逐渐缩小,细胞质减少,细胞核 浓缩,染色深.图中见单个GC体积缩小,细胞核黑 染浓缩,部分细胞膜紧裹其上,部分细胞质仍与外界 有联系. 图1水牛HDFGCs涂片HE染色特征(100×)健康 GCs(细箭头示)大,染色淡;凋亡的GCs(粗箭头 示)染色深,体积缩小,许多凋亡GCs聚集成团 |黪 图2水牛ADFGCs的HE染色特征(400×)健康 GCs:(细箭头),凋亡的GCs:(空心箭头)多成簇存 在,也出现凋亡小体(粗箭头) 图3水牛AIJF的Gcs心L的tiE染色特征(1000×) 健康GC(细箭头示),凋亡小体(粗箭头示),凋亡 的GCs(空心箭头示)体积缩小 2.2HDF与ADF中GCs荧光显微镜检测凋亡的 特征水牛HDF与ADF中的GCs凋亡的荧光显 中国兽医2007年11月第27卷第6期Chin,VetSciNov.2007Vo1.27No.6953 微镜检查表明,ADF中凋亡的GCs比率较HDF的 高.凋亡GCs核体积缩小,荧光很强,因此显得格外 明亮,而健康GCs的核体积大,发光弱,因此显得暗 淡(图4).在ADF中常见到发光较强的凋亡细胞或 发光极强的凋亡小体成簇存在,而HDF中凋亡的 GCs较少. 图4水牛卵巢ADF中GCs凋亡的荧光检测特征 (Hoechst染色,400×)核染成明亮的细胞为凋 亡细胞(粗箭头),暗淡的体积较大的为健康细胞 (细箭头) 2,3HDF与ADF中颗粒细胞DNA电泳的特征 水牛HDF和ADF颗粒细胞的DNA电泳结果如图 5所示,在被检的7头水牛中,1号HDF样品的电泳 图谱,只是在离点样孔附近出现1条DNA的条带, 未发现DNA降解成小分子的"拖尾"带特征.2号样 和3号样显示DNA虽有降解,但降解量很少.在4 , 7号ADF样品的DNA电泳中,均出现程度不同 的"拖尾"带特征,而未见典型的DNA梯状条带,即 DNA"Ladder" 质性好,侧向散射光(sidescatter,SSC)大的细胞有 个别分布.在直方图中,X轴的起始部位出现1个 DNA峰,称亚二倍体峰(即亚G./G峰),其高度约 占G./G峰高的40,这类DNA碎片的分子量基 本相同而且很小,是否属于凋亡的产物,有待继续研 究. 用孕酮处理早期ADF中GCs的FCM检测结 果见图7.孕酮处理后,GCs在点状图中较分散,反 映细胞大小不一,均质性差.此外,孕酮处理的一个 显着特征是:在直方图X轴的起始部,DNA峰明显 增高,其高度约占G./G期峰的125,而G./G期 峰,G/M期的峰明显比孕酮未处理的低. 图6早期ADF的GCs的FCM检测特征上半部为点 状图,下半部为直方图.粗箭头示亚二倍体峰,空心 箭头示G/(;峰,细箭头示G/M峰.下同 图5水牛HDF和ADF的DNA电泳特征M.100bp 的Marker;1.健康优势卵泡;2,7.闭锁优势卯泡图7用PI处理早期AI)F的GCs的 FCM检测特征 2.4ADF与孕酮处理ADF中GCs的FCM检测 特征早期ADF中GCs的FCM检测结果见图6, 在点状图中,GCs分布较紧凑.细胞大小较一致,均 3讨论 31HDF和ADF的GCs凋亡的形态学检测本 试验发现,在HDF和ADF的GCs涂片中,都含有 954中国兽医2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vo1.27No.6 健康的GCs和凋亡的GCs,不同之处是HDF所含 的凋亡细胞比例较低,ADF中所含的凋亡细胞比例 较高.HDF中存活的GCs的HE染色特征在普通光 学显微镜下体积正常,可粗略地看到细胞质染成粉 红色,细胞核染为淡蓝紫色.而凋亡GCs的体积缩 小,细胞质减少或消失,整个细胞染色呈较深的紫黑 色,几乎不见细胞质,细胞固缩以及形成凋亡小体的 图象与健康GCs形成明显对比(图2),在聚集成团 的GCs中凋亡细胞较多,这可能与GCs的簇集素表 达有关,簇集素的消耗引起了GCs的凋亡[2.在 l000x光镜下(图3),对凋亡小体的形态,浓缩核 外围结构以及它与细胞浆的联系均可辨认.这种水 牛卵泡GCs凋亡的形态学变化,未见他人报道. 细胞凋亡的荧光检查法的原理是利用荧光染料 Hoechst33258对凋亡细胞核的特殊亲和性(细胞膜 通透性增大)和它对正常细胞核着染性差的特点,该 染料对涂片细胞染色,能与细胞DNA结合,在紫外 光下(400~500nm)呈现出蓝色荧光. 本试验中荧光法检查的结果基本与光镜检查结 果相吻合,即HDF和ADF中都含有正常的和凋亡 的GCs,凋亡的GCs在ADF中较多;正常GCs的 核体积大,发光较暗.而凋亡GCs的核发生固缩,体 积小,发光明亮.在ADF涂片中常可见成簇存在的 发光极强的凋亡小体.Shenker等l_3曾采用荧光显 微镜检查凋亡细胞的变化,凋亡细胞核体积明显缩 小,与本试验结果相似. 卵泡GCs涂片的HE染色和荧光染色检查法 在检查凋亡细胞方面有一定的协同印证作用,如健 康细胞核,凋亡细胞核,凋亡小体的形态辨认,凋亡 细胞或凋亡小体在涂片上分布的特征等.就单个检 查方法而言,各有优缺点.HE染色的涂片细胞结构 清晰,细胞膜,细胞质和细胞核均可看到,凋亡细胞 及凋亡小体也可清楚辨认,但染色,脱水等过程较为 复杂.荧光法对细胞涂片染色容易,对凋亡细胞核及 凋亡小体易于检查,但不能观察除核以外的其他成 分,而且需要荧光显微镜,染色及其检查都需要在暗 室里进行. 3.2HDF和ADF中GCs凋亡的DNA降解分析 在细胞凋亡的检测方法中,目前认为最特异,最经 典的检测方法是DNA电泳.这是由于在细胞凋亡 过程中,最重要,最具特征性的改变是Ca/Mg 依赖性的核酸内切酶的激活导致染色质DNA在核 小体连接部位断裂,形成以18O,200bp为最小单 位的单核小体或寡核小体片段,其电泳图谱呈现典 型的"梯状带"(DNA"Ladder").健康活细胞的 DNA是完整的,分子量大,细胞浆中不存在低分子 量DNA,因此电泳时迁移距离短,所以停留在加样 孔附近,只出现1条带,不出现DNA降解的"梯状 带"或"拖尾带"(即"摸片状"带,Smearpattern).本 次试验中HDF的DNA电泳只出现1条完整的无 拖尾带,说明用此方法未发现GCs的DNA降解; ADF的电泳结果也显示了健康存活GCs的电泳特 征,在相应位置也存在有1条完整的带,此外还呈现 有不同程度的"拖尾"带,说明被检的DNA发生了 随机降解,这是细胞坏死或凋亡后期的继发性坏死 的特征,与资料记载一致[4].Yang等[5在奶牛的相 关研究中,对照牛卵泡GCs的DNA电泳出现少量 "拖尾"带,与本试验相似.+ 结合HDF和ADF的GCs涂片检查以及FCM 检测,可初步认为ADF电泳出现的"拖尾"带可能 是GCs先凋亡之后又发生继发坏死的表现,也可能 是原发性坏死的特征.可以肯定的是,在正常水牛卵 巢的闭锁卵泡中,颗粒细胞DNA的随机降解即 GCs坏死至少也是颗粒细胞死亡过程中的方式之 一 O 在FCM分析中,前向散射光(FSC)反映被检细 胞的体积大小,侧向散射光(SSC)反映被检细胞表 面形态,胞内颗粒大小,多少和分布情况;在点状图 (或称二维点图)中,每一个点代表1个细胞,细胞群 体的分布紧凑表示被检细胞均质性好,如果细胞分 布分散表示被检细胞均质性差,体积大小以及细胞 内结构差别较大.在直方图中,凋亡细胞的DNA由 于细胞膜通透性升高,在洗涤,固定等过程中部分已 被降解的小分子DNA片段会从细胞中丢失,因而 凋亡细胞内的DNA含量减少,DNA直方图上显示 在G./G峰前出现DNA含量减少的亚二倍体峰或 称亚G./G.峰,又称细胞凋亡峰.在直方图中,每一 个峰代表性质相同的一群细胞【6]. 本试验发现早期ADF的GCs在点状图中出现 了SSC大,FSC小的少数图点,说明被检ADF中存 在颗粒细胞凋亡,但这类凋亡细胞的数量很少.这也 说明DNA电泳时没有出现DNA"梯状带"的原因. 此外,在直方图的G./a峰远前方,X轴的起始部 位出现的DNA峰是否属于细胞凋亡峰,暂且不知. 在ADF的GCs的DNA电泳中未见这一条带,估计 这类DNA分子量很小,可能在DNA电泳的洗涤等 处理中丢失,详情尚需继续研究.FCM检查与核酸 电泳都检测到了ADF中GCsDNA的降解. (下转958页) 958中国兽医2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vo1.27No.6 E3] [4] [5] [63 [7] [83 embryonicstemcellsfrommurineprimordialgermcellsin culture[J].Cell,1992,70:841—847. TsungHC,DuZW,RuiR,eta1.Thecultureandestablish— mentofembryonicgerm(EG)celllinesfromChinesemini swine[J].CellRes,2003,13(3):195202. ChernyRA,StokesTM,MereiJ,eta1.Strategiesforthe isolationandcharacterizationofbovineembryonicstemcells [J].ReprodFertilDev,1994,6(5):569—575. Kanatsu—ShinoharaM,OgonukiN,InoueK,eta1.Long— termproliferationincultureandgermlinetransmissionof mousemalegermlinestemcells口].BiolReprod,2003,69 (2):612—616. KuhholzerB,BaguisiA,OverstromEW.Iong—termculture andcharacterizationofgoatprimordialgermcells[J].Theri— ogenology,2000,53(5):1071—1079. 韩建永,桑润滋,孙国杰,等.山羊PGC用于分离与克隆类 ES细胞[J].中国兽医,2002,22(4):344—347. MoensA,FlechonB,DegrouardJ,eta1.Ultrastructuraland immunocytochemicalanalysisofdiploidgermcellsisolated fromfetalrabbitgonads[J].Zygote,1997,5(1):47—6o. [9] [1o] [11] ? 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(上接954页) 从孕酮处理早期ADF的效果看,点状图中细 胞的均匀度较差,说明细胞的内部结构发生了较大 变化;直方图显示,在本次试验条件下孕酮可较强地 诱导卵泡G./6期的与G/M期的GCs发生DNA 降解,肯定孕酮处理促进了GCs的死亡,但死亡方 式是凋亡性的还是坏死性的,尚需继续研究.本试验 在体外证明孕酮可使水牛早期ADF中GCs发生死 亡,这与用孕酮可使奶牛活体内卵巢卵泡GCs发生 凋亡性死亡[5以及GCs凋亡时孕酮浓度升高的 结果一致,而与孕酮抑制GCs凋亡l8的结论相反. 笔者在收集早期ADF和孕酮处理前的早期 ADF的颗粒细胞时,曾用台盼蓝染色镜检,发现早 期ADF中GCs形态大多数正常,活细胞在70以 上,而孕酮处理ADF后的颗粒细胞中活细胞比例 也不到50%,细胞降解碎片极多,其中不少是可移 动的核物质.因此笔者曾对此样品进行DNA电泳, 其结果只出现了"拖尾"带(未显示),说明那些DNA 碎片是DNA随机降解的产物,但为何在FCM又有 亚二倍体峰出现,这一情况有待进一步研究证实. (本实验得到广西大学动物繁殖研究所和预防 兽医教师的支持,特此致谢!) 参考文献: [1] [23 [3] [4] [5] [6] [7] [8] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].2版.jE京:中国协 和医科大学出版社,1999:443—444 ZwainI,AmatoP.ClusterinProtectsGranulosaCellsfrom ApoptoticCellDeathduringFollicularAtrema[J].ExpCell Res,2000,257:1O1—11O. ShenkerBJ,DatarS,MansfieldK,eta1.InductionofApop— tosisinHumanT—CellsbyOrganomercuricCompounds:A FlowCytometricAnalysis[J].Toxicolappliedpharmacol, 1997,143:397—406. 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