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局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋白异常高度磷酸化

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局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋白异常高度磷酸化局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋白异常高度磷酸化 局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋 白异常高度磷酸化 第38卷第6期第739页 2009年12月 华中科技大学(医学版) ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Vo1.38NO.6P.739 Dec.2009 局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质 蛋白异常高度磷酸化* 王海均赵洪洋?熊南翔黄俊红姚东晓赵心同 华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科,武汉430022 tau 摘要目的探讨局灶性脑缺血再灌注后大鼠顶叶皮质神经...
局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋白异常高度磷酸化
局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋白异常高度磷酸化 局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋 白异常高度磷酸化 第38卷第6期第739页 2009年12月 华中科技大学(医学版) ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Vo1.38NO.6P.739 Dec.2009 局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质 蛋白异常高度磷酸化* 王海均赵洪洋?熊南翔黄俊红姚东晓赵心同 华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科,武汉430022 tau 摘要目的探讨局灶性脑缺血再灌注后大鼠顶叶皮质神经元tau蛋白磷酸化的变化,及其与神经细胞凋亡的关 系,以阐明脑梗死和阿尔茨海默病间的关系.方法制作局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫印迹法检测局灶性脑缺血 再灌注后大鼠顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202,Ser396,Ser404和Tyr231位点磷酸化和不溶性磷酸化tau蛋白的变化; TUNEL法和免疫荧光双标法检测脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和磷酸化tau蛋白的关系.结果缺血再灌注6h后 顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202,Ser396,Ser404和Tyr231位点发生异常高度磷酸化,不溶性磷酸化tau蛋白显着增加. 脑缺血再灌注后3d神经细胞的凋亡和tau蛋白高度磷酸化呈显着正相关关系.结论脑缺血再灌注后发生阿尔茨海 默病样病理变化,脑梗死可能促进了阿尔茨海默病的发生,发展. 关键词脑缺血;阿尔茨海默病;tau蛋白;磷酸化;细胞凋亡 中图法分类号R364.12DOI:10.3870/j.issn.1672—0741.2009.06.005 TauProteinPhOsphOrylatiOnInducedbyFocalCerebralIsehemia'reperfusion inRatParietalCortexNeurons WangHaijun,ZhaoHongyang?,XiongNanxiangetal DepartmentofNeurosurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,Huazhong UniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022 AbstractObjectiveToexplorethechangesoftauproteinph0sphorylationinratparietalcortexneuronsafterfocalcere— bralischemia-reperfusion(I/R)andtoclarifytherelationshipbetweencerebralinfarctionandAlzimer'Sdisease.Methods Theratfoca1cerebra1I/Rmode1wasinducedbyocclusionoftherightmiddlecerebraIarteryusingtheintraluminalsuture method.Theleve1oftauhyperphosphorylationatSerl99/202,Ser396,Ser404andTyr231sitesandtotaltauinratparietalcor— texduringfoca1cerebralI/RwasdetectedbyimmunofluorescenceandWesternblot.Therelationshipbetweenneuronalapopto— sisandtauproteinphosphorylationwasanalyzedbyTUNELmethodandimmunofluorescence.ResultsThe1evelsoftauhyper— phosphorylationatSerl99/202,Ser396,Ser404andTyr231sitesweresignificantlyhigherinI/Rgroupthanthoseinthesham group,butthetotaltauwasnotincreased.NeuronalapoptosisandthetauproteinhyperphosphorylationwereCO—local— ized.ConclusionThecerebralinfarctionmaycontributetoAlzheimer'Sdiseaseoccurrenceanddevelopment. Keywordscerebralischemia;Alzheimer'Sdisease;tauprotein;phosphorylation;apoptosis 流行病学调查发现脑卒中明显增加了痴呆的发 病率口],这些痴呆患者的病情多呈进行性发展,而 且一半以上患者发生的继发性痴呆不是脑卒中脑损 害直接导致的_3].阿尔茨海默病(Alzheimer'Sdis— ease,AD)是引起老年痴呆的最常见病因,有报道称 脑卒中的血管危险因素可使AD的患病风险增 高].但目前脑卒中和阿尔茨海默病之间的关系还 不清楚. tau蛋白是一种在神经系统广泛表达的微管相 关蛋白,具有稳定微管,促进微管装配,维持神经元 "科技支撑课题资助项目(No.2006BA101A13) 国家"十一五 王海均,男,1981年生,博士研究生 ?通讯作者,Corresp0ndingauthor,E—mail:hyzhao750@sina.COII1 的形态和促进轴突运输的重要作用.tau蛋白功能 异常改变可能是神经元功能障碍和死亡的必要环 节.tau蛋白的磷酸化和去磷酸化间平衡是维持微 管稳定性的关键调控因素,tau蛋白的过度异常磷 酸化导致tau蛋白自身聚集成双螺旋纤维细丝 (pairedhelicalfilament,PHF),进而产生阿尔茨海 默病特征性的病理改变——神经纤维缠结(neu— rofilamenttangle,NFT)E53. 本研究利用大鼠大脑中动脉栓塞模型研究脑缺 血后在AD患者脑中特征性的tau蛋白异常过度磷 酸化位点韵磷酸化变化,磷酸化tau蛋白的溶解性 以及磷酸化tau蛋白和脑缺血后神经细胞凋亡的关 系,以进一步阐明脑卒中和阿尔茨海默病的关系. ? 740?华中科技大学(医学版)2009年l2月第38卷第6期 1材料与方法 1.1主要试剂和仪器 tau—pSer404,tau—pSerl99/202,tau—pTyr231, tau5抗体购自Biosource公司,tau—pSer396,兔抗 大鼠GAPDH单克隆抗体购自CellSignal公司;罗 丹明(Rhodamine)标记的羊抗兔IgG和羊抗小鼠荧 光二抗,二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒,West— ernblot化学发光试剂盒购自Pierce公司.原位末 端标记(TUNEL)凋亡检测试剂盒购自碧云天公 司.化学试剂购自Sigma公司.OLYMPUS荧光 显微镜,电泳仪和转膜仪购自BIOMETRO公司,冰 冻切片机购自Thermo公司. 1.2实验动物分组 , 清洁级雄性Sprague—Dawley(SD)大鼠57只由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,质 量200,250g,饲养温度2O,25.C,湿度6O, 7O,自由摄食与饮水,昼夜节律12h:12h,大鼠 术前12h禁食不禁水.随机分为6组:对照组(即 Sham组),缺血再灌注模型(I/R)依据脑缺血损伤 后l,6,12,24h及3d不同处死时点分为IR1h, IR6h,IR12h,IR24h,IR3d组.对照组12只,IR3d 组21只,其余每组6只. 1.3动物模型制备 参考Longa等介绍的MCAO线栓法.10 水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后,3-0尼龙线 栓塞右侧大脑中动脉,栓线深度(20?3)mm,60 rain后再灌注.大鼠苏醒后进行神经功能缺失评 分:0分,无明显神经损伤症状;1分,不能完全伸展 对侧前爪;2分,行走时向对侧旋转;3分,行走时向 对侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失.1,3分 者为有效模型.观察期内未人选及死亡大鼠予以剔 除并随机补充.对照组颈内动脉不插尼龙线,其余 操作同模型组. 1.4TUNEL法检测细胞凋亡和免疫荧光检测tau蛋白磷 酸化的表达 上述动物IR3d组15只和对照组6只分别用 1O%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,经左心 室用4多聚甲醛灌注固定,断头取脑后固定6h, 浸入30蔗糖溶液4?过夜沉底后,作连续脑冠状 冰冻切片,片厚10m.取顶部皮质最大冠状面切 片,0.1TritonX一100作用15min,用PBS洗涤2 次,在样品上分别加入tau-pTyr231和tau—pSer396 一 抗(1:100稀释)4?过夜,PBS洗涤后,加入荧光 二抗37?避光孵育6Omin,PBS洗涤后,加5O1 TUNEL检测液37?避光孵育6Omin,PBS洗涤3 次,封片,应用免疫荧光显微镜照相.阳性细胞计数 采用每只大鼠取3张切片,同一倍数下每张切片计 数5个视野的阳性细胞,总和除以5作为该切片的 阳性细胞计数,取平均值. 1.5蛋白印迹技术检测tau蛋白的磷酸化水平 腹腔注射麻醉后立即冰上断头取右侧顶叶皮质 放于一7O?冰箱内备用.取出标本加入细胞裂解 液,冰上裂解,匀浆,15000g离心15min,取上清, BCA法测蛋白浓度.10聚丙酰胺凝胶电泳后将 蛋白转移至硝酸纤维膜上.以1O牛血清白蛋白 (BsA)封闭后加入一抗孵育过夜,常温下辣根过氧 化物酶标记的IgG二抗孵育2h,ECL显色,扫描后 用ImageJ软件分析系统定量,计算灰度值,实验重 复3次. 1.6不溶性磷酸化tau蛋白的检测 将大鼠右侧额顶部皮质2Omg加入100lRI— PA缓冲液(50mmol/LTris—HC1,pH8.0,150 mmol/LNaC1,20mmol/LEDTA,1Nonidet P40,50mmol/LNaF,0.250oNaDeoxycholate.1 mmol/LPMSF)进行冰上匀浆,匀浆后在4.C条件 下振摇1h,l1300g离心20min;将沉淀用RIPA 缓冲液洗涤1次后加入50/A(或RIPA缓冲液体积 的1/2)70的甲酸(FA),再于4?下11300g,离心 2Orain,收集上清并将其利用真空泵抽干后,再加入 50"1SDS—PAGE缓冲液(240mmol/LTris—HC1, PH6.8,6SDS,30glycerol,0.06bromophe— nolblue)悬浮,溶解,记为FA部分,FA部分代表相 对不溶性的tau.于1O%的SDS-PAGE胶等体积 上样电泳后进行免疫印迹分析,实验重复3次. 1.7统计学方法 计量资料用?s表示,组间差异显着性检验采 用单因素方差分析,两组资料的相关性采用直线相 关回归分析.数据采用SPSS12.0软件包统计分 析,以P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1免疫印迹结果 采用蛋白免疫印迹检测顶叶皮质在缺血再灌注 的不同时间点tau—pSer404,tau—pSerl99/202,tau— pTyr231和tau—pSer396的表达,结果显示,缺血再 灌注后6h各种tau蛋白磷酸化开始增强,与再灌 注前相比差异具有显着性意义,24h后达到高峰,3 d时未有明显下降.反映总tau蛋白的tau5在各 时间点间差异无显着性意义.结果见图1. 王海均等.局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋白异常高度磷酸化?741? GAPDH ! Shamlh6hl2h24h3d l2 10 鼙一pSer396pSer404pTyr231pSer199/202tau5 与Sham组比较Pd0.05 图1脑缺血再灌注前后不同时间点tau蛋白的磷酸化情况和总tau蛋白的表达 2.2不溶性磷酸化tau蛋白的检测结果 以tau—pTyr231和tau—pSer404抗体检测缺血 再灌注后3d和对照组中不溶性磷酸化tau蛋白, 免疫印迹结果显示在IR3d组代表不溶性磷酸化 tau蛋白含量的印迹灰度值明显高于对照组(P< 0.05),IR3d/对照组比值:pTyr23l为(16.61? 2.37),pSer404为(11.73?O.69).结果如图2所 示. IR3dSham GAP.HGAP.H 图2不溶性磷酸化tau蛋白在脑缺血再灌注前后的变化 2.3TUNEL染色和免疫荧光染色结果 分别应用tau—pTyr231和tau—pSer396抗体和 TUNEL检测缺血再灌注3d后细胞凋亡和tau磷 酸化的空间关系,发现缺血再灌注3d后,tau— pTyr231,tau—pSer396磷酸化和细胞凋亡之间存在 表达的共定位,见图3.tau—pTyr231和tau—pS— er396阳性细胞数与凋亡神经细胞数之间呈正相关 关系,r值分别是0.930,0.977.结果如图4所示. 3讨论 以往认为,AD是一种神经系统变性疾病,与脑 血管疾病没有关系.然而近年流行病学,临床和基 础研究均表明,AD与脑血管病变的关系趋于密切, 脑缺血可以加重AD患者的认知功能障碍,促进 AD的进展],如载脂蛋白E基因,4_s],高胆固醇 血症,动脉粥样硬化"与高血压等均与AD 有关.AD的病理特征是脑神经细胞内异常磷酸化 的tau蛋白聚集形成神经纤维缠结.在AD脑中有 3种tau蛋白:易溶型非异常磷酸化的tau(C-tau), 易溶型异常磷酸化的tau(ADp-tau),不溶性以双螺 旋丝聚集的tau(PHF-tau).C—tau生物学活性类似 于正常tau蛋白;ADP—tau没有生物学活性,但未 聚合成PHF;PHF—tau是从神经元纤维缠结中提取 的异常过磷酸化的tau蛋白[133.本研究发现大鼠 缺血再灌注后,大鼠皮质的tau蛋白发生高度磷酸 化,而且也检测到了不溶性的磷酸化的tau蛋白的 存在,这说明缺血再灌注后诱导了AD样病理变化, 脑缺血可能是诱发AD的病因,这为研究脑卒中在 AD发病机制中的作用提供了实验依据.有研究报 道大鼠缺血后海马区发生tau蛋白PHF一1(ser396/ 404)位点高度磷酸化,并且在脑卒中后梗塞灶的 周围发现了AD特征性的病理变化Alz一50的存 在1],这些均支持我们的结果.我们发现总tau蛋 白的表达在缺血再灌注3d内没有变化,而磷酸化 的tau蛋白于缺血再灌注3d有所降低.其原因可 能是:tau蛋白磷酸化状态取决于其蛋白激酶和蛋 白磷酸酶的相对活性,长时间缺血再灌注后过度的 损伤导致蛋白激酶水解或活性下降甚至失活,其磷 酸化tau蛋白的能力降低.GSK一38是目前发现最 强有力的tau蛋白激酶_1引,机体对缺血/再灌注损 一g皇?H一}g丑暑 64125 盯协 SST9 J,lflr e 1, ? 742?华中科技大学(医学版)2009年12月第38卷第6期 凋1l= 凋亡 导 - , -r 上 . , 士 Merge Merge 图3taupTyr231,taupSer396与细胞凋亡的共定位表达 导 医 = 量 圈4IR3d组中taupTyr231,tau—pSer396阳性细胞数与凋亡神经细胞数的相关性分 析 伤的应激反应可激活磷脂肌醇3激酶蛋白激酶B (PI3K/PKB)等进而导致GSK一3口失活_1.这些推 测还需要进一步的研究证实. 许多研究表明,脑组织缺血,缺氧不仅可导致神 经元坏死,还可引起神经元凋亡,凋亡细胞中不仅有 神经元,还有星形胶质细胞.实验中我们发现缺血 再灌注3d后过度磷酸化tau蛋白与凋亡神经元共 定位,且二者在数量上高度相关.我们目前还不能 肯定这些细胞的凋亡与tau蛋白高度异常磷酸化之 间的因果关系,但高度磷酸化的tau蛋白使微管结 合能力和促微管聚集能力下降,异常的tau蛋白还 妨碍正常的微管相关蛋白与微管结合,从而使微管 解聚,抑制轴浆运输,使神经元细胞骨架稳定性下 降,加速细胞的凋亡过程.而在既往的研究中也发 现AD中异常磷酸化的tau蛋白和NFT与神经元 的凋亡之间是相关联的u],AD中参与凋亡的相 关基因baxl2,P53,bcl一2基因也同样调控脑缺血后 神经细胞的凋亡,而脑缺血后同样发生了tau蛋白 的异常高度磷酸化和神经细胞的凋亡,因此我们推 测脑缺血后神经细胞的凋亡也可能与高度异常磷酸 化的tau蛋白相关,脑缺血后神经细胞的凋亡和AD 中神经元的凋亡可能是通过相同的凋亡相关基因进 行调节. 综上所述,脑缺血可以诱导,促进AD样病理变 王海均等.局灶性脑缺血再灌注致大鼠大脑皮质tau蛋白异常高度磷酸化?743? 化,这既为临床上脑卒中痴呆发病率显着增高提供 了理论依据,也可能为脑缺血后痴呆的治疗开辟了 一 个新的方向,临床上积极防治脑缺血可能会减缓 AD的进展. 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