胆汁淤积基因在妊娠期肝内胆汁淤积症发病机制与在异常胎盘胆汁酸排泌机制中作用的研究（可编辑）

胆汁淤积基因在妊娠期肝内胆汁淤积症发病机制与在异常胎盘胆汁酸排泌机制中作用的研究（可编辑） 胆汁淤积基因在妊娠期肝内胆汁淤积症发病机制与在 异常胎盘胆汁酸排泌机制中作用的研究 华中科技大学 博士学位论文 胆汁淤积基因在妊娠期肝内胆汁淤积症发病机制和在异常胎盘 胆汁酸排泌机制中作用的研究 姓名:刘玉凌 申请学位级别:博士 专业:妇产科学 指导教师:乔福元 20060401中科技人学济医学院 胆汁淤积基因在妊娠期肝内胆汁淤积症 发病机制和在异常胎盘胆汁酸排泌机制中 作用的研究 摘要 第一部分 应用?技术检测妊娠期肝内胆汁淤积症 基因突变, 研究背景妊娠期肝内胆汁淤积症 是一种妊娠期特发性疾病。对患者本人的影响仅限于妊娠期,妊 娠结 束后患者临床症状自然消失、血清生化迅速恢复正常,预后良好;但胎儿早 产、心率异常、羊水粪染及围产儿死亡率明显增加。该病病因尚未明了,研究结 果提示遗传因素在该病发病机制中起相当关键作用。基因也称为 基因蛋白产物是肝脏毛细胆管膜磷脂输出泵,维持着胆汁磷脂的含量, 基因突变可引起遗传性肝内胆汁淤积症的发生。目前,法国、芬兰等欧洲学者已 在这些国家患者中发现与疾病有关的基因突变;而我国学者尚未开展 基因突变在本国人群中的分椰情况的调查工作。 目的检测我国患者基因外显子突变的分布情况,探讨该基因在 发病机制中的作用。 方法收集例孕妇,检测其肝功能、血清营酸、谷胺酰转 肽酶?水平,同时采用聚合酶链反应一单链构象多态性?技术 分析患者基因个外显予突变情况。随机抽取例同期常晚期妊娠华中科技大学同济医学院 博士毕世论文 妇女作为对照组。 结果例患者均出现肝功能异常、血清升高等生化改变,与对照组 相比均有显著性差异.。例孕妇血清.升高,而对照组无~例 异常。所有患者及例正常妊娠妇女均扩增出基因个外显子目 的片段, 但分析没有发现异常迁移条带。 结论在欧洲患者基因突变频率较高的个外显子中,本地区孕妇未 发现已知突变及新的未知突变。基因突变可能不是本地区患者发病的 主要原因。 关键词胆汁淤积;妊娠;基因基因:谷胺酰转肽酶;聚合酶 链反应;单链构象多态性 第二部分 、和基因 在绒毛和正常妊娠胎盘组织表达的研究 研究背景胎盘作为妊娠期的特殊器官,承担了未成熟胎儿几乎所有器官的功 能,在胎儿物质转运过程中起重要作用,包括胆汁酸的排泌。胎儿物质经过胎盘 组织屏障与母体相互交换。胎儿胆汁酸依赖人类滋养细胞基底膜胎儿面和游 离缘母体面质膜上存在的胆汁酸转运载体以易化扩散或主动运输的方式通过 胎盘。其中部分载体蛋白具有单向转运特点,在整个转运过程中起垂直转运的作 用。然而,关于胎盘屏障胆汁酸转运系统的特征尚需进一步研 究。、 和等三种基因参与肝脏胆汁分泌过程,突变可分别 引起多种遗传性肝内胆汁淤积症。关于这三种基因在人类胎盘上的表达情况,人 们知之甚少。 目的了解三种胆汁淤积相关基因、和 在正常绒毛和胎盘组织在转录水平和蛋白水平有无表达和表达情况,了解这三种博.。毕业论义 华中科技人学司济医学院 基因和人类胎盘胆汁酸排泌功能的关系。 方法选择正常妊娠一周的孕妇早孕组例和妊娠?周的孕妇晚 ?检 孕组例,采用实时定量逆转录一聚合酶链反应技术 测绒毛和胎盘组织中三种基因的。采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶法分别检测、在上述例胎盘组织中的表达,并通 过免疫印迹技术分析两组胎盘组织中蛋白和蛋白的含量。 结果在所有绒毛和胎盘组织中均检测到三种基因的。与早孕组相比,晚 孕组胎盘组织中基因的表达水平增加,有显著性意义.;基 因表达水平则明显下降.,差别有极显著意义;而基因的表达无改 变.。 蛋白、蛋白在正常绒毛和胎盘组织中均有表达,且、蛋 白在正常早孕绒毛及晚期妊娠胎盘分布范围基本一致,主要分布在绒毛合体滋养 细胞母体面游离缘。与早孕组相比,正常组胎盘的表达显著升高., 而的表达无显著性差异.。 结论三种与胆汁淤积相关的基因、和在正常绒毛和胎盘组织中 均有表达。根据胎儿生长的需要胎盘,妊娠期间基因、基因和 基因和蛋白表达发生变化,可能参与了胎盘胎儿胆汁酸的排泌。 关键词;;:胎盘;胆汁酸;实时定 量逆转录一聚合酶链反应;免疫组织化学;免疫印迹 第三部分 、 和基因在 妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘胆汁酸排泌机制中 作用的研究’静中科技人学『司济医学院 研究背景 胎儿预后不良发生率较高,但其机制尚不清楚。有研究显示胎儿 胆汁酸升高与羊水粪染、胎儿窘迫、死胎的发生有关。生理妊娠情况下,胎 盘维持着母胎胆汁酸动态平衡。时,胎盘从胎儿至母体方向排泌胆汁酸的效 率下降,导致胎儿血清胆汁酸明显升高。因此,胎盘胆汁酸排泌功 能受 损可能是造成胎儿预后不良的环节之一。、及等三种基因与 遗传性肝内胆汁淤积有密切关系, 我们前面的研究已经发现这 三种基因在足月 妊娠胎盘中均有表达。、及等三种基因在胎盘的表达情况以 及与受损的胆汁酸排泌功能的关系值得研究。 目的检测正常妊娠和胎盘组织中三种胆汁淤积相关基因、 及的表达,探讨这三种胆汁淤积相关基因与胎 盘胆汁酸排泌功能下降的关系。 方法选择正常妊娠?周的孕妇『常组例和例患者组, 采用实时定量技术检测两组胎盘组织中三种基因的表达:免疫组 化 染色法检测蛋白和蛋白在胎盘组织中的表达部位:并通过免疫印 迹技术检测两组胎盘组织中蛋白和蛋白的表达。 结果在组胎盘组织中检测到、及三种基因和 蛋白、蛋白的表达。与正常组相比,组胎盘组织中基因的和 蛋白水平均下降,有极显著性意义.;而 和蛋白表达水平基 因在组胎盘组织和正常组胎盘组织中的表达无差异.。组 基因呈弱表达,明显低于正常组,差别有显著意义.。 结论基因、基因和基因在胎盘组织中均有表达。胎盘 中基因的表达可能与胎盘胆汁酸排泌功能无关:而胎盘基因和 基因表达水平明显下降,这可能与胎盘胆汁酸排泌功能受损、的 不良妊 娠结局有关。 鬻妊缈汁琴川隙秽印孵阿.,冀盘 华扣科技人学【亓济医学院 博毕业论文 ,. , . , . ., .. ?.?华中科投人学问济医学院 , ,,, . ?.,.. . ,, ,, ,? , ,,, . . . ?, , 华中科技大学州济蕞学院 博。毕业论文 , . .、 . ,, . 、 . , , ,. ’’ .,. . ., ... .... . 华中科技人学川济医学院 . . ,. .. . . ,,,,, , ? . ‘, , .. . , ,, . . 博,‘毕业论义 华中科技大学同济医学院, , , .’ . , .. ,... , .. ; 伊.. , .. .. . ,, ,, 中科技人学『州济医学院 博:毕业论文 月 舌妊娠期肝内胆汁淤积症 , 是一种妊娠中、晚期出现的以皮肤瘙痒、胆汁淤积和黄疸为特征的并发症,持续 至分娩后症状很快消失,生化指标恢复正常,再次妊娠时可复发。患者预后 良好,但该病可引起胎儿窘迫、早产、死产,增加围产儿发病率和死亡率?。 对胎儿的严重危害促使许多研究者致力于该病病因及胎儿不良妊娠结局发生机 制的研究。尽管对的研究日益增多,发病原因及引起胎儿不良妊娠结局 机制仍未阐明,治疗也无突破性进展。研究病因及其胎儿不良妊娠结局发生 机制已成为产科新的研究重点,阐明其发生机制并寻求理想的防治方法是产科研 究的重要课题。 近年来,由于其它胆汁淤积疾病发病机制研究深入,促进人们从遗传学方面 以分子生物学水平对患者病因的探索。基因也称为基因蛋 白产物是肝脏毛细胆管膜磷脂输出泵,维持着胆汁磷脂的含量。家族性进行性肝 ,是幼 内胆汁淤积症儿期发病的进行性胆汁淤积,该病患者学龄期或青春期即可伴发肝硬化,预后不 良。根据临床表现、疾病转归和患者预后,可分为 型、型和型。? 型是由基因突变导致肝脏毛细胆管膜蛋白减少或消失引起胆汁 磷脂分泌缺乏、血清一谷胺酰转肽酶升高的疾病”’。通过对型 的研究,人们将与联系起来。 年 等首次报道与突变所致的型同时存在于 一个家系中,最先表明基因是发病原因。基因在患者中的多 态性和突变检测的研究成为新的研究热点。越来越多证据表明突变与 有关。国外研究显示”‘”:与有关的突变中,存在着十余种突变情 况。然而,关于基因突变在我国患者中的分布情况国内尚未见报道。 胎盘作为妊娠期的特殊器官,承担了未成熟胎儿几乎所有器官的 功能,在胎 儿物质转运过程中起重要作用,包括胆汁酸的排泌。月与母体的物质交换必须华中科技人学吲济医学院 尊:毕业论文 经过胎盘组织屏障。胎儿胆汁酸依赖胎盘组织屏障人类滋养细胞基底膜胎儿面 “’川和游离缘母体面质膜“。“上存在的胆汁酸转运载体以易化扩散““”或主 动运输“”的方式通过胎盘,维持母胎胆汁酸动态平衡。胎儿不良预后机制至 今尚存争议。时,胎盘从胎儿至母体方向排泌胆汁酸的效率下降?,导致 胎儿血清胆汁酸明显升高,而胆汁酸升高与羊水粪染、胎儿窘迫、死胎的发 生有关“’?。因此,胎盘胆汁酸排泌功能受损可能是造成胎儿预后不良的 重要环节之一。和分别是肝脏毛细胆管上氨基磷脂的内向转移酶和胆汁 酸输出泵,基因和基因突变异常表达可分别引起 型芹 型““ “。目前,涉及胎盘胆汁酸转运的多项分子机制及相关载体蛋白的生物学特征已 为人所知,但也称为基因、也称为基因和 等胆汁淤积基因在胎盘上如何表达、是否参与胎盘胆汁酸转运及 其 机制、与胎盘胆汁酸排泌功能受损的关系如何等人们知之甚少。国外仅 ?“?、“”和””等报道单个或上述三种基因在正常晚期妊娠胎 盘上的表达,至于这三个基因在胎盘上转录水平和蛋白水平表达的研究及对 胎盘胆汁酸转运功能的生物学影响,国内外尚未见相关报道。 基于以上问题,我们通过检测患者基因外显子突变的分布情况, 探讨了该基因在发病机制中的作用;检测三种胆汁淤积相关基因 、和在正常绒毛、正常胎盘组织和 胎盘组织中转录水平和蛋白水平的表达情况,初步探讨三种胆汁淤积相关基因与 『酸排泌的关系,为的防治提供新的思路。 参考文献: 戴钟英.妊娠期肝内胆汁淤积症.见:曹泽毅主编.中华妇产科学.第二版 北京:人民卫生出版社,年.. .:..,:? . , , , . .,: ? , , , . .., 中科挫大学同济医学院 博.毕业论义 :。.,, . ., :一, , ,. : . .,:.. , , , . : .,:? , , , .. ., :?. , , , .,: . . . , ,..,:?. , , , , . , .,:? ’ ? , ., ..,: ?,? ’ ..“.,: ... , , , ? 一 ,, ..,: .., , ,..,博.:毕业论义 ‘印扣科技人学问济医学院 :一. . , , ,. , .,:?., , .. .,: .. , , , . ? ..,?:? , , , . . ., :一 . , ,. .,:., . .,:?. . , ? . .,:? , , : ... ,:.., , , . .,:. .: , ..,:? ? ’ , .. .,:?. ., , . ..,: ’ . , ,,,,,,,?..,: 悱:毕业论文 华中科技人学『卅济医学院 第一部分 应用?技术检测妊娠期肝内胆汁淤积症 基因突变 妊娠期肝内淤积症 是妊娠期 特发性疾病,尽管患者预后良好,但胎儿早产、胎心率异常、羊水 粪染及围 产儿死亡率增加?。到目前为止,的发病原因尚未彻底明了。近六 年来研究 证实基因也称为基因与该病有关。迄今为止该基因已有 多个突变位点的报道’“。本研究采用聚合酶链反应.单链构象多 态性分析 . ,?技术检测在 患者中基因突变情况。 资料与方法 一、研究对象 收集年月~年月问同济医院及武汉市普爱医院产科收治的 例患者组。另随机抽取例同期正常晚期妊娠妇女作为对照组, 均为单胎,无高血压、糖尿病、心脏病和肝肾疾病史,无其他妊娠 合并症及并发 症。其中患者年龄..岁,平均孕周..,对照组例,年龄 .,岁,平均孕周..周。两组孕妇年龄和孕龄之间比较,差异 均无统计意义.。 的诊断标准:参考年及曹泽毅主编的《中华妇产科学》第 版?。孕期出现以皮肤瘙痒为主的主要症状,可伴有黄疸:患者一般情况良好, 无明显呕吐、食欲不佳、虚弱及其他疾病症状;肝功能异常,主要是血清转氨酶 的轻度升高:胆酸水平升高;一旦分娩,瘙痒迅速消退,肝功能拥迅速恢复『常: 既往无肝胆疾病史。 二、实验材料 一主要仪器华中科技人学可济医学院 阱,:毕业论文 扩增仪 珠海市公司产品 稳压稳流电泳仪 上海公司产品 标准电源 德国公司 .型单垂直电泳槽 北京市六一仪器厂 水平式凝胶电泳槽 北京市六一仪器厂 二主要试剂 基因组提取试剂盒购自上海赛百盛公司:为公司产品: 琼脂糖粉为美国公司产品;酶及缓冲液购自华美生物工程 公司和日本公司;为大连宝生物工程有限公司产品。 丙烯酰胺、,’一亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷碱、乙 二 胺四乙酸二钠、甲酰胺、溴酚兰、二甲苯青购自美国公司; 过硫酸铵购自美国公司;%甲醛、硫代硫酸钠、硼酸、氢氧化钠、% 乙酸、硝酸银和无水碳酸钠等,以上国产化学试剂均为分析纯级。 三主要试剂的配制 . 红细胞裂解液: / 溶液.,碳酸氢 氯化铵.,. 钠.,加至。 . 白细胞裂解液:一四,. ,蛋白酶, . /溶液,溶于 ,用氢氧化钠调节值 为.左右,加定容至。 . /。氯化钠溶液:.氯化钠溶于 ,高压灭菌后室温储 存。 . 缓冲液:/. ,./. ,,用氨氧 化钠调:符值为.,加一,至。 . %丙烯酰胺溶液%/ :丙烯酰胺.克,,’一亚甲基双丙 烯酰胺.克,电泳缓冲液溶解,加电泳缓冲液并定 容于。 . %过硫酸铵:过硫酰铵克,加水至,保存一周,.。保存一 个月。 . 载样缓冲液:甲酰胺,氢氧化钠.,澳酚兰.,二甲博毕业论义 中科技大学例济医学院 苯青.,,加:至。 , %溴酚兰 . 载样缓冲液:甲酰胺,/ ,%二甲苯青,加至。 , . 银染显色液: 碳酸钠,./的硫代硫酸钠,%的甲醛. 加至。 / 一, . 电泳缓冲液:碱,硼酸.,. .,加至,保存。 三、方法 一标本采集: 分别抽取孕妇及正常妊娠妇女外周静脉血,:抗凝。另抽取 孕妇外周静脉血,肝素抗凝备用。 二肝功能、血清总胆汁酸及一谷胺酰转肽酶?水平测定: 全自动生化分析仪检测肝功 取外周肝素抗凝血,采用日本 能、及.水平。肝功能包括丙氨酸转氨酶、总胆红素等生 化指标。 三外周血基因组提取: 取抗凝血,采用饱和盐析法以及基因组提取试剂盒上海赛百 盛公司提取。 饱和盐析法提取外周血基因组步骤: . 抗凝血摇匀后,加入红细胞裂解液,颠倒混匀,以 将 转/分的速度离心,重复?次。 . 取沉淀初体积的/一/,加入白细胞裂解液,。过夜。 。 . ,以转/分的速度离心 加入/氯化钠,冰浴 . 取上清液移入另一管,加入双倍体积无水乙醇一。过夜。转/分 的速度离心,倾去液体。 . .双倍体积%乙醇漂洗沉淀,转/分离心。 . 弃去上清,室温风干。 . 加入 溶液或无菌?溶解沉淀,一。保存。蹲毕业论文 华中科技人学州济医学院 基因组提取试剂盒提取外周血基因组步骤见试剂盒晓明书。: . 在.离心管中将.全血与纯化树脂使用前摇匀混和。 . 室温下放置,离心 ,收集沉淀。 . 用结合液悬浮,摇匀,转/分离心 ,收集沉淀。 . 用.漂沈液洗两次,摇匀,转/分离心 ,收集沉淀。 . 用.无水乙醇悬浮,装入离心纯化柱空柱子,转/分离心分 钟,倒掉物收集管里的乙醇,再离心分钟,尽量除尽乙醇。 . 将纯化柱入套一个干净的.离心管中,加入缓冲液于纯化树脂 上不 能粘在管壁上,室温下放置,转/分离心。 . 离心管中收集的液体即是沈脱下来的基因组,取弘电泳.%琼脂 糖,,检测。 四扩增目的片段:对基因个外显子进行聚合酶链式反应扩增。 . 待扩增外显子编号、引物序列“、目的片段长度见表。 表 基因分析的引物 . 反应体系,含各样本基因组~,上下游引物各./ 上海赛百盛公司合成,./,酶。 . 循环条件:。预变性,然后循环次包括?变性、退火、 。延伸,最后。延伸。除外显子退火温度是?外,其余各片 段退火温度均为?。 五琼脂糖凝胶电泳鉴定产物:‘挣中科技人学『州济医学院 博。 毕业论义 取 分子量标准及扩增产物用.%琼脂糖凝胶含.‖的 溴化乙锭电泳后,于紫外灯下观察结果。若于相应大小处出现桔 黄 色亮带即可判断扩增成功。 六技术检测基因突变 . 聚丙烯酰胺凝胶带备: . 取两块干净玻板,按仪器说明书制作胶室。 . 配制%琼脂糖溶液,待溶液冷却至。,从玻板夹心的外部利用虹吸 作 用将胶溶液加到玻板夹心的底部,高约.,置室温冷却.。 . 在锥形瓶内配制凝胶混合液: % 凝胶终浓度%丙烯酰胺溶液.电泳缓冲液 %过硫酸铵 总体积 . 将凝胶混合液灌入玻板夹心,在胶凝固之前,将梳子插入胶顶部。 . 将胶模倾斜,玻板平面与水平面呈。夹角,避免胶溶液从玻板夹心 底部漏 出。 .置室温,待凝胶凝固。 . 上样 . 变性:取扩增产物跏与等体积载样缓冲液混合,在 ?加热,然后迅速置冰水浴至加样。 . 小心从玻板之间拔出梳子,用.电泳缓冲液漂洗凝胶顶部,除去未 凝固的丙烯酰胺。 . 在电泳槽中加入.电泳缓冲液,安置胶模。 .采用微量加样器,每孑上样。 . 电泳 将电泳槽置入冰箱,在恒压下,根据片段长度电泳~不等。华中科 拙人学司济医学院 博:毕业论文 . 凝胶染色:银染法 . 电泳结束后,将凝胶置入%乙酸溶液固定。 . 弃去固定液,用漂沈凝胶次,每次。 . 将凝胶至于.%硝酸银溶液中,染色。 .弃去染色液,快速漂沈凝胶次。 . 将凝胶置于?预冷的银染显色液中,直至条带显示出最佳颜 色。 . 立即倒掉显色液,加入%乙酸溶液终止反应。 . 漂洗凝胶。 . 采用扫描仪记录显色结果 四、统计学方法采用统计学软件进行检验。 结果 一、研究对象的生化特点 患者血清../,与对照组.?./相比有显 著性差异.。同时病例组血清.../,较之对照组.?. /也有不同程度的升高.。本研究中患者血清和水平符 合特异性的生化改变。在例患者中,.升高者有例,正常者 例,还有例未进行检测。 / 、 静 ? 口组 尊 》 ?对照组 ;? ? ? “ 册 ? ?图 患者和正常晚期妊娠患者血清生化结果华中科技大学同济 医学院 博士毕业论文 图 位患者血清升高情况 二、扩增结果 经.%琼脂糖电泳鉴定,证实所有样本皆扩增出目的片段即基因的 外显子、外显子、外显子、外显子和外显子,均为单一区带、大 小 与预期长度一致图。 分别为基因外显子、、、和的产物 图 基因外显子产物琼腊糖电泳图 三、分析结果 例患者基因个外显子扩增产物经变性、电泳和银染后 显示条变性单链带。图显示组基因外显子、外显子、外显子 、外显子和外显子两条位移一致的单链条带,和对照组条带相比, 无条 带的增加、减少或位置移位等异常条带。图和图分别为患者基 因外显子和外显子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图,无条带的增 加、减少或位 置移位等异常条带。 博士毕业论文 华中科技大学同济医学院 泳道.近加样孔方向分别为基因外显子、、、和变性之两条单链 泳道和远加样孔方向为残留于凝胶内的复性双链 图 患者基因外显子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 泳道为患者标本 泳道:为正常对照标本 图 患者基因外显子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 博士毕业论文 华中科技大学同济医学院 泳道.为患者标本 泳道:为正常对照标本 图 患者基因外显子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 讨论 一、.分析法的原理及其优缺点 日本学者【】创建的.分析方法其原理是产物变性后可产生两条 互补的单链,各单链根据自己的一级结构形成不同的构象,长度 相同、但碱基序 列不同甚至单个核苷酸发生突变,其单链的空间构象也随之变化,并导致电泳迁 移率的差异,在电泳凝胶上显现出不同的带型。利用这种方法可以高通量筛选 多态性和基因突变。 毫无疑问,作为检测序列变异的一种手段,.法与其它传统 的检测基因突变的方法相比确有独到之处。作为一种可以检测任何可能突变的技 术,.技术不失其省时、简便、灵敏及经济的优越性。第一,它可以检 测任何包括已知的和未知的位点上的多态性和突变,且检测敏感性高。据 粗略估计,%上单碱基变异可以通过这种方法检测出来。第二,无需 事先知道待检测片段的序列,只要能够根据已有的资料设计引物即可 进行分析。第三,它省去了酶切消化以及核酸杂交等复杂的实验步骤, 操作简便,整个过程可在一至两天内完成,适合于同时对大量样品进行筛选。 然而,.法亦有其自身的缺陷。首先,它不能对序列变异进牛中科技人学同济医学院 行精确的定位,而只能对其进行初筛,需要结合序列分析刊‘能确定变异的位置及 内容;其次,虽然从理论上讲.法可以检测任何位点上的碱基变异,但 在实际应用中可能会遇到相当比例的假阴性结果。影响.方法检出突变 的因素较多,一般可将这些因素分为两大类:?突变对分子空间构象的影响,主 要取决于扩增片段的长度和突变性质。随着扩增片段长度的增加,?的 突变检出率降低。一般认为,当片段在以下时,检出率可达 %】;当片段为.时,则其检出率约为%;当片 段为一时,则其检出率约为%’。本文的扩增片段长度介于~ 之问,应有较高的检出率;?电泳的分辨率。影响电泳分辨率的因素较多, 包括电泳支持介质及工作条件如电泳温度、凝胶厚度、凝胶的交联度等等。温度 可直接影响分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影响分型结 果。因此,本研究将凝胶浓度和厚度分别控制在%和 并采用。恒温电泳, 使本实验具有较好的重复性,并避免了盲目测序造成的资金浪 费。 二、基因生物学特征及其与疾病的关系 跨越, 包含个外显子平均 基因定位于染色体., ,范围. ,其中个包含编码序列,编码产物即蛋白【。 蛋白属于型糖蛋白?超基因家族,位于细胞膜表面,属膜嵌合蛋白, 分子量为,为一糖蛋白,其中蛋白质部分为。蛋白有四个 结构域:两个结合、水解的同源核苷酸结合域,为物质逆浓度梯度转运提 供能量,其序列高度保守:分别:三个外显予外显子、、和外显子、 、编码;两个疏水的跨膜域,往返跨膜次,是决定转运底物特 异性的功能区。个跨膜结构域由个被分离的外显子所编码。跨膜结构域 和的.末端及其同源对应物跨膜结构域和的.术端共享一个外显子。外 显子编码.术端的个氨基酸。蛋白主要分枷在肝脏毛细胆管膜上, 水平偏低、没有发 在人类其它组织中肌肉,心脏,脾脏,肾一象 现 的表达’。 研究表明,基因编码蛋白即卵磷脂的跨膜转运蛋白】,并与 多重耐药有关【”。 等【发现等位基因缺失的小鼠/.或 裸鼠完全不能分泌卵磷脂进人胆汁,推测毛细胆管膜上蛋白参与卵磷脂母中科技人学同济医学院 博.:毕业论义 的跨膜转运。卵磷脂不溶于水,在胆汁中与胆汁酸和胆固醇分子构成微胶粒,增 加胆固醇在胆汁中的溶解度,以防胆固醇结晶的析出而形成结石。另一方面,它 与胆汁酸形成微胶粒而减少疏水性胆汁酸对毛细胆管的损害。因此, 基 因突变导致 的合成异常可导致严重的肝脏疾病。 , 家族性进行性肝内胆汁淤积症是幼儿期发病的进行性胆汁淤积。学龄期或青春期即可伴发肝硬化。预后 不良。根据临床表现、疾病转归和患者预后,可分为 型、型和型。 研究表明,基因突变与.谷胺酰转肽酶水平升高的患者 有关?。在这类患者中肝脏中的水平通常是低下或缺如。 】等 发现,型患者基因外显子纯合无义突变导致终止密 】发 码子提前出现,其肝脏组织蛋白免疫染色出现缺失。等【 现,在一个法国家系中,所有患者均为基因缺失突变纯合子 。由于该缺失突变使阅读框发生移位,在其下游个密码子后便出 现终止子,产生长度缩短、功能失活的蛋白。等研究【】证实 至少有/的 型患者有缺损,同时提出不同类型的突变 可以导致表型相同的的 型患者对相同药物治疗的疗效不一。无义突变导 致蛋白表达完全缺失,可以引起严重的先天性胆汁淤积、且熊脱氧胆酸治疗无效, 如患者为纯合子情况则更为明显;而携带错义突变的患者残存少量蛋白、 行使有限的磷脂转运功能,并且熊脱氧胆酸治疗有效。最近,还有少量文章报道 与胆结石的发生有关。 三、与 是一种表现比较特殊的疾病,近年来很多学者致力二的发病机 制研究,到目前为止,的发病原因尚未彻底明了。多年来流行病学资料、临 床观察及实验室研究提示,除了与雌激素升高“‘、微量元素硒的缺乏、 母体免疫失调’以外,本病的发病原因与遗传因素有密切关系:?不同国家、 不同民族的发病率有明显的不同【;?部分有家族聚集倾向?】; ?它有复发危险,家族性患者再现风险增加四。这些均提示遗传因素在该 病发病机制中起相当关键作用。近年来,通过对 的病因研究人们逐渐将 基因与联系起来,并从分子水平研究该基因在发病机制中的作牛中科技人学同济医学院 用。 越来越多证据表明基因与有密切关系,多为杂合突变。部分引 起型患者的突变与有关【’ 。除此之外,患者中还 存在特异性的突变情况。等【在血清水平增高的患 者中发现基因外显子密码子位胸腺嘧啶替代了胞嘧啶,导致野生 型天冬氨酸替代丙氨酸的错意替换,引起的不稳定或降解导致 表达的减少。等发现一位患者是基因外显予无义突变杂 合子,该突变部位位于蛋白跨膜区的中部。】 通过对例患者编码外显子测序,发现一个英国患者外显子杂合错 义突变。应用限制性片段长度多态性方法在其他位患者 中发现一例此类突变,该患者有家族史。一般说来,如果序列高度保守的 结合域出现了突变,则不能顺利地与蛋白结合,可以影响膜转 运蛋白磷脂载体的能量供给:跨膜域的突变则直接影响蛋白的底 物特异性,产生功能不全的转运体。不仅如此,基因无义突变或错义突变 还可导致蛋白表达完全消失或表达减少。 与 患者均为突变纯合子相比,患者多为突变杂 合子。这种基因突变杂合状态可能代表了一些妇女遗传易感性,非 孕期蛋白功能尚未受到影响。妊娠期间,非遗传因素如雌、孕激素及其 代谢产物等大量增加。研究表明:人类的鼠类同源基因基因启 动予含有一个固醇反应元件,影响转录水平的凋控?。另外,激素也可直 接作用于蛋白,影响其功能。因此,当母体受妊娠产生的大量性激素 和/或环境因素影响时,币常等位基因的表达减少影响蛋白表达的丰度】’ 蛋白功能受损,胆汁中磷脂缺如或含量减少,不能结合具有溶细胞膜作用 的疏水性胆汁酸盐,使肝细胞和毛细胆管上皮持续暴露于有毒的胆汁;同时妊娠 期母体肝脏负担加重,导致轻度肝功能和毛细胆管功能不良,出现胆汁淤积临床 生化改变。 同时,患者多为突变杂合子的情况为熊去氧胆酸治疗提供理 论依据:熊去氧胆酸可上调原代培养的肝细胞蛋白的表达?,增加 患 者正常等位基因蛋白的表达,提高肝细胞膜对磷脂的转运能力,减轻疏‘中科技人学耐济医学院 水性胆汁酸对肝脏的毒性作用。研究表明?,熊去氧胆酸治疗可显著改善 错义突变引起的患者的临床症状、延缓病情进展。国内外已有熊去氧胆 酸治疗的报道【.,不仅改善患者临床、生化指标,而且延长孕周、增 胎体重和减少胎儿窒息的发生。 本研究在突变集中的第、、、及号等个外显子中采用. 方法,扩增出单一、大小与预计长度一致的区带,但未能寻找出新的突变。可能 与以下因素有关: 基因突变频率低且分和弥散,广泛分布于基因的多个外显 子。在已报道的与有关的基因突变中,大多数突变只出现过一次, 仅和曾重复出现【’。。在样本含量达人的研 究中,未能重复阳性家族史的患者曾出现的基因 突变。的研究结果也是如此】。 国外研究显示突变多见于血清水平升高的患者“’。 鉴于与这两个疾病之间的关系,特异性的突变频率可能 依赖于研究人群中?升高者的构成比。升高者的构成比越高,发现 特异性的突变的可能性越大。而血清升高的构成比在不同的人群中 差别很大,为%~% ’】不等。国内有关在中的分布情况尚不多 见,仅江西黄金阳报道在例患者中发现例升高【】。本文通过检 测的例仅发现有例%血清.升高者。 现有监测方法低估了编码区或绞链区的突变。由于点突变引起的空间结 构变化甚微、迁移率相差无几,尤其是点突变发生在扩增段的两端时可以导致假 阴性结果,因此在筛选时仍有可能存在疏漏。 基因产物的功能异常并不限于基因编码区突变所致,其他部位包括拼接 区及启动子的突变/变异也可能影响基因表达。已有研究表明编码区的拼 接同义突变【内含子,】与的发病有关】。 目前国际上尚无统一的诊断标准,纳入标准存在差异【,部分 不能通过表型分析将其与其它疾病区分不来,这也使部分研究结果之间存在 不一致。目前,尚有其他数位研究者在当地人群研究中也未发现与特异性的 “。 突变或变异。芦中科技人学『州济医学院 :毕业论文 尽管本研究未能在本地区患者中未能检测出基因突变,但对 的病因研究和治疗提供了新思路。已有研究表明基因、基因与 有关“。这些基因与肝脏疾病的关系及发病机制尚需今后进一步的研究。这些研 究有助于进一步研究的病因,可为以病因为依据的分型提供充分而明确 的依据。更为重要的,当明确了致病基因,可为早期预测、预防、诊断和治 疗的研究提供可靠的理论基础和相应手段。 参考文献 戴钟英.妊娠期肝内胆汁淤积症.见:曹泽毅主编.中华妇产科学.第二版. 北京:人民卫生出版社,年.. , , ,. .. :?, , , . : . .,: , . , ,. : .,:? . , ,,. .,: 一., , , . . ,:一. , , ..,: 华中科技大学司济医学院 博。毕业论文. , , , . , , .,:? ., ,. .;:?, , . ,: ..,:? . “, ,..,: 赵兴波,储明星,李宁等.绵羊线粒体控制区”端序列.与 序列分析.遗传学报.,:?. ?, . ..:? . , , ,. ., . ., , , . .,:? , , ,. ..,; . , , , , .,?:. /?. . , , , , , . .,:. ’仁中科技大学同济医学院 博:毕业论文, , . . .,: . , , ,,. .,: . .: ..,: 时青云,刘淑芸,熊庆.妊娠肝内胆汁淤积症患者雌孕激素水平及免疫功能 的变化.中华妇产科杂志.,: 徐先明.妊娠肝内淤积症.见:庄依亮主编.现代产科学.第一版.北京 科学出版社,年.? , , , .,. , .,: 王竹晨,刘淑芸,王靖华.妊娠肝内胆汁淤积症患者血硒及胎盘硒水平变化 与胎盘组织学改变的关系.中华妇产科杂志.,:? 王竹晨,刘淑芸.孕妇静脉血及其新生儿脐血硒水平及谷胱甘肽过氧化物酶 活性与妊娠肝内胆汁淤积症的关系.中华妇产科杂志.,: 董曼岳,谢幸,王亚平.妊娠期肝内胆汁淤积症患者母胎混合淋巴细胞培养 的研究.中华妇产科杂志.,:. , , , .,:? .., , , ..,:? , , , ...;: , , . : , . .,: 毕中科技人学同济医学院 博:毕业论文 , , ? . .,: , , . : ..,:? 徐先明,庄依亮,王德芬等.熊去氧胆酸治疗妊娠期肝内胆汁淤积 症.中华 实用妇科与产科杂志.,: 刘玉凌,乔福元,刘海意等.熊去氧胆酸治疗妊娠肝内胆汁淤积症 例.医 药导报.,:? , , , . : . ,:? 黄金阳,刘淮.一谷氨酰转肽酶在妊娠期肝内胆汁淤积症孕妇产 前检测中的 意义.江西医学院学报.,: , , , . , .., :.,.,:?, , . ..,: ., , , ..,:?博.牛业论文 ‘中科杖人学【一济医学院 第二部分 实验一应用 法进行、 基因在绒毛和正常妊娠 胎盘组织表达的研究 胎盘作为妊娠期的特殊器官,在胎儿物质转运过程中起重要作用, 包括胆汁 酸的排泌。除部分胆汁酸可通过胎儿肾脏排泄至羊水【外,大部 分胎儿胆汁酸通 过胎盘进入母体血液循环,参与母体胆汁酸的排泌。因此,在胎儿胆汁酸的排泌 过程中,胎盘扮演了重要的角色。近‘来,人们对遗传’阽肝~胆汁淤积性疾病的 认识逐渐深入,已确认若干基凼例如、和 突变可造成胆汁淤积阻。为了解这三种胆汁淤积基因与胎盘胆汁 酸排泌功能的关系,本研究采用实时定量逆转录一聚合酶链反应技术:, 技术检测上述三 : 种基因在绒毛和正常妊娠胎盘组纵中的表达情况。 资料与方法 一、研究对象 选择我院年月~年月问因非意愿妊娠行人工流产术的健康 妇女早孕组 例,年龄?岁,术前未使用潲体类激素及抗旱孕药物,终止 妊娠时间介于?周:并选择同期在我院住院分娩的正常晚期妊娠妇女晚孕 组例,年龄.岁,均为单胎,无高血压、糖尿病、心脏病和肝肾疾病史, 无其他妊娠合并症及并发症,未进入产程、因社会因素行剖宫产 术,终妊娠时 间介于周。 一、实验材料 主要仪器 .低温冰箱 公司产品 高速低温离心机 德国公司 扩增仪 珠海公司产品中科技人学叫济医学院 博,毕业论义 水平式凝胶电泳槽 北京市六一仪器厂 上海公司产品 稳压稳流电泳仪 英国公司 凝胶图像成像分析系统 “ 美国公司 二实验试剂和材料: 试剂 上海华舜生物工程有限公司 不合的总快速提取纯化试剂盒上海华舜生物工程有限公司 逆转录酶 美国公司生品美国公司产品美国公司产品 酶抑制剂 华美生物工程公司产品 华美生物工程公司产品 酶及缓冲液 大连宝生物工程有限公司产品 美国公司 .薄壁 联管 英国公司 大量琼脂糖凝胶回收试剂盒 北京天为时代科技有限公司 三主要试剂的配制 . / 电泳缓冲液:碱,硼酸. .,加至,保存。 %,室温静置过夜,高压蒸 无酶水:取 ,用三蒸水稀释至 气灭菌除去残余。 三、方法, 一标本采集: 早孕组于人工流产术时收集新鲜绒毛组织:晚孕组于剖宫产术后 姨取 材。胎盘娩出后,避开蜕膜和胎膜组织,取脐带对侧、母体面胎盘。 生理赫水 漂洗后置.。保存。 二标准曲线制作 .制作标准曲线的样品标准品华中科技人学列济医学院 采用纯化的目的基因产物为标准品 .总提取采用试剂和小量不含的总快速提取纯化试 剂盒。试剂盒的使用按试剂晚明书进行操作。 试剂提取胎盘组织总: 取胎盘组织,采用预冷水漂沈两次后,在匀浆器内用无菌 剪刀将其剪碎。 加入试剂匀浆.,至液体基本澄清,将匀浆液移入. 离心管中,立即用带针头的注射器抽打裂解物.次。 室温放置,加入氯仿,剧烈振荡秒,室温放置。离心, ,。 将上层水相移至一新.管中,加入等体积异丙醇振荡混匀,室温放 置 ,离心,,。 去上清,用%乙醇洗涤沉淀次,每次离心,,。 去上清,让沉淀的在室温自然干燥后,加适量水溶解。 .总测定 .. 完整性检查样品经甲醛变性凝胶电泳后,紫外灯下观察、 及三条带。若::,提示污染少,若出现带明显,提示 降解。 .. 浓度测定分光光度仪测定核酸样品及波长的吸光度, 计算浓度,并将终浓度训至‖恤备用。 .反应 .. 第一链合成反应 选取:约为:及在.~.之问的,按照试剂说 明书进行反应。总 /, 混匀后短暂离心,。孵育 分钟;加入以下成分:红, ,处理水.“, ? , .,总体积。混匀,。温育,再加热至 ?,分钟,以灭活逆转录酶。反应结束后反应物一。保存待用。 .. 反应‘年中科技大学司济医学院 博.。毕业论文 ...引物设计: 、及的序列的 序列号依次为:.、.及。采用引物设 计软件.设计引物,北京奥科生物技术公司合成,以或作 为内参。各目的基因引物序列、碱基位置、扩增片段长度及退火 温度见表。 表 、及基因?引物 ...建立两种反应体系 用于凝胶回收的普通反应体系及热循环参数: 反应体系:无菌水., , /即, /,上游引物似,下游引物似‖, ,酶/./,总体积。热循环参数 扩增仪:?预变性,之后在仪中循环次,反应条件为: ?,退火,?。循环结束后,?充分延伸。 用于融解曲线分析的荧光反应体系及热循环参数:含 荧光染 反应体系:无菌水./, ./ /,参 料、以及酶等,上、下游引物似各.肛, 考染料/.‖,总体积?。热循环参数 . 预变性,之后在仪中循环次,反 : 应条件为:?,退火,延伸。 . 产物鉴定华中科技人学同济医学院 ..琼脂糖凝胶电泳验汪配制.%琼脂糖凝胶含./溴化乙锭,取轨 反应产物.电泳,同时点样作为长度标志。 紫外灯下观察、 、处特异性条带。采用通过凝胶图像成像分 析系统成像。 ? ..融解曲线分析使用 对产物作融解 曲线分析。将产物于。变性后,骤降至。,再以.。/的速 度从?升至?,在?至?之问连续采集荧光信号。 .琼脂糖凝胶回收目的片段 采用琼脂糖凝胶电泳分离、及 扩增产物后,在紫外灯 下观察目的条带并确定位置,切下含有目的条带的胶块并采用琼脂糖凝胶 回收试剂盒回收目的条带。具体办法参见试剂盒说明书。回收后,将回收产物再 次进行.%琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下观察相应大小位置是否出现橘黄色条 带。如再次出现目的条带,表明回收成功可作为标准品,将这些片断 扩增子保存在.。。 制作标准曲线 . 标准品的梯度稀释采用无菌去离子水将回收后得到的高浓度产物即 标准品原液按倍进行梯度稀释得到系列浓度的标准品,用于制作标准曲线。 . 反应体系及热循环参数用于制作标准曲线的反应体系和热 ? 循环参数 同荧光融解曲线分析用的 反应体系和热循环参数见上。 . 线性范围的确认经扩增可得原始扩增曲线,设置基线和阈值后, 确 定不同浓度标准品的阈值循环数 ,以标准品的对初始浓 度相对值作图拟合南线,可得标准曲线。定量范围为浓度与值呈 线性 关系的范围,实际样品定量的浓度需全部落在这个范围内。 反应 三 反应。 选择?方法进行样本 . 总提取按标准曲线制作部分总提取步骤, 提取各样本胎盘组织 中的总。‘芦中科技人学司济医学院 . 总测定检测各样本的总纯度和浓度,选取:约为:及 /在.~.之间的,并将终浓度调至/备用。 .反应第一链合成的逆转录体系及反应条件同标准 曲线制作??第一链合成反应部分。反应反应体系及热循环参数同 标准曲线制作??用于荧光融解曲线分析的反应体系及热循环参数 。 部分。一系列相对浓度的标准品与待测样品在同一批做 作为内参。 四各基因表达量的相对定量 . 各基因的的初始量原始浓度的确定:以标准品的对初始 浓度相对值作图拟合直线,即得标准曲线。每管样品所得的经标准 曲线方程可知道其所含基因的初始量相对于标准品的浓度。 . 各基因表达量的相对定量:每份中目的基因量除以持家基因量实现 基因表达的归一化。 四、统计学方法 采用软件进行统计分析,结果以;表示,检验进行两样本方差齐性检验 后,两组比较采用检验,.为有显著意义。 结果 一、标准曲线的制作 . 制作柄;准品 . 产物特异性鉴定 ..琼脂糖凝胶电泳验词: 观察产物的电泳图,判断扩增是否正常及扩增子的特异性。图.分别 显示了、年基因 :。增产物琼脂糖凝胶电泳图,均为 单~区带、大小与预计长度一致,表明了特异性地扩增到目的产物。 ..融解曲线分析 观察产物溶解曲线,判断扩增是否正常及扩增子的特异性。图.分别 显示了、平 基因 扩增产物的熔解曲线。随着温度的华中科技大学同济医学院 博士毕业论文 图绒毛及胎盘组织 心 ?扩增图 图 绒毛及胎盘组织 ?片段 :标志物 、:正常绒毛 溶解曲线圈 、:正常胎盘 、胎盘 图绒毛及胎盘组织 盯一扩增图 图 绒毛及胎盘组织盯一片段 :标志物 、:正常绒毛 溶解曲线图 、:正常胎盘 、:胎盘 图绒毛及胎盘组织 扩增图 图 绒毛及胎盘组织 ?片段 :标志物 、;正常绒毛 溶解曲线图 、:正常胎盘 、:胎盘华中科技人学州济医学院 博。:毕业论文 升高,与双链接连结合的 染料释放。在溶解曲线图中,以荧光强度 随温度变化的负一次倒数为纵坐标,荧光强度变化的拐点熔点,处清晰 地看到了一个单一的峰,这个峰对应着扩增产物的熔解温度,表明扩增产物为目 的产物。图中没有出现杂峰,也未出现主峰的异常增宽,表明实验中未出现污染、 引物二聚体和假阳性现象。 .琼脂糖凝胶回收目的片段 通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收各扩增子、将回收产物再次进行.% 琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下观察到相应大小位置出现的橘黄色条带,表明 回收成功并可作为标准品使用。 . 标准曲线 采用系列浓度的标准品经扩增得到原始扩增曲线见图,设置基 线和阈值后,确定不同浓度标准品的,以标准品的对初始浓度相对值 作图得到标准曲线见图。各目的基因标准曲线的回归系数均大于.。 二、、及基因在正常绒毛和晚期妊娠胎盘的表达情况 经 ?扩增后,根据同批次标准曲线求出各样品中目的基因 含量见图、,并通过持家基因对各目的基因进行归一化。我们比较了三 种胆汁淤积基因在正常绒毛和晚期妊娠胎盘中的表达情况。 . 正常绒毛和晚期妊娠胎盘中 的表达 在正常绒毛和晚期妊娠胎盘中均有表达。与早孕组相比, 基因表达水平明显由.?.下降至.?.,差别有极显著意义. 见图。 . 正常绒毛和晚期妊娠胎盘中 的表达 在所有绒毛和胎盘组织中均检测到 。在『常绒毛中的 表达量较低为.:.,正常晚期妊娠胎盘中表达量为.?.,两者比 较有显著差异.。见图。 . 的表达 正常绒毛和晚期妊娠胎盘中 在不同妊娠时期胎盘基因的表达无改变.,见图。