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甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究(可编辑)

2017-11-13 44页 doc 73KB 17阅读

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甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究(可编辑)甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究(可编辑) 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质 的研究 石河子大学 硕士学位论文 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究 姓名:杨良 申请学位级别:硕士 专业:农产品加工及贮藏工程 指导教师:娄恺 20090601摘要 甜瓜细菌性斑点病的病原菌包括细菌性果腐病菌 .和细菌性角 斑病菌 .,该病已成为近年来影响新疆甜瓜生产的重要因 素。因此,探索防治甜瓜细菌性斑点病的有效方法已成为重要课题。本实验 室已从新疆甜瓜根际 ...
甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究(可编辑)
甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究(可编辑) 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质 的研究 石河子大学 硕士学位论文 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌P-13菌株鉴定及其抑菌物质的研究 姓名:杨良 申请学位级别:硕士 专业:农产品加工及贮藏工程 指导教师:娄恺 20090601摘要 甜瓜细菌性斑点病的病原菌包括细菌性果腐病菌 .和细菌性角 斑病菌 .,该病已成为近年来影响新疆甜瓜生产的重要因 素。因此,探索防治甜瓜细菌性斑点病的有效方法已成为重要课题。本实验 室已从新疆甜瓜根际 土壤中分离到一株甜瓜细菌性斑点病拮抗菌.,琼脂扩散法生物活性研究 明,其发酵液对细 菌性果腐病菌、细菌性角斑病菌的抑菌圈直径分别为和 以上。本文对其分 类地 位、摇瓶发酵条件和发酵液中抑菌物质的性质及其初步分离纯化进行研究。 结果如下: 序列 .明确了甜瓜细菌性斑点病拮抗菌.的属。根据形态特征、生理特性测定和 。 的系统发育分析,初步鉴定菌株.为娄彻氏链霉菌 .明确了菌株.发酵液中抑菌物质的性质。甜瓜细菌性斑点病拮抗菌一发酵液中抑菌 物质主要为胞外代谢产物,不溶于石油醚、乙醚和乙酸乙酯等有机溶剂。进而对该物质稳定性进 行研究,在处理 处理 或紫外线照射 ,该物质抑菌活性不变。纸层析结 、 果表明,该物质主要为碱性水溶性物质。 .探索了菌株.产生抑菌物质的培养基组成、培养基初始、摇瓶装液量、接种量、发 酵温度和发酵时间等摇瓶发酵条件。采用.设计、最陡爬坡试验设计、旋转中心组 合设计和响应面分析法优化培养基组成,最优培养基组成为葡萄糖‖、可溶性淀粉 /、蛋 . . 白胨 、 /、。. /、 /、 /、’ . . . /、. 和 。单因素试验确定最佳摇瓶发酵条件为 .、摇瓶装液量 / 、接种量%/、发酵温度?和发酵时间. 培养基初始 ,发酵液抑菌圈直径为。 ;比初始值. 提高了.%。通过试验设计对发酵培 养基和摇瓶发酵条件的优化,抑菌活性显著提高。 .离子交换法研究表明,采用弱酸性阳离子树脂,使抑菌物质得到了富集和浓缩。离 子交换法操作条件如下:发酵液经过预处理后,以 /流速上装好的型树脂离子 / 交换柱,上柱时发酵液与树脂的体积比为:;用蒸馏水以倍树脂体积的蒸馏水流速为 /盐酸以流速为 /洗脱。 洗涤树脂柱;然后用倍树脂体积的. 通过对发酵液中抑菌物质的性质及其初步分离纯化方法的研究,为抑菌物质的精制和结构鉴 定提供依据,也为菌株一进一步的开发利用提供理论基础。 关键词: 甜瓜;细菌性斑点病;拮抗菌;抑菌物质 . ., . ., , , . . . ,. 一 一 , , ?一 : . ., .. ., , ,., ,. , , . 一 ., ? . ,: /, /, . . . . . ‖, /, /,‘ /,‘ /, /, . . / ‘ /. ,,,, , ..,,/,% ,. , .. . 蚴., % . . ? . . . 一 :, ., 。/ .., / /. .。/. . . . 一 . , :, ,缩略词 三羟甲基氨基甲烷.盐酸 砀.和乙二胺四乙酸缓冲液 十二烷基硫酸钠 多聚酶链式反应 小时 分钟 天 对照 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果. 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确的说明并表示谢意. 研究生签名: 物莨. 啪、呵“ 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留学位论文并向 国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少 量复制并允许论文进入学校图馆被查阅.有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版.保密的学位论文在解密后适用本规定. 研究生签名: 黾 时间:哆年 时 年 导师签名: 么月旷日甜瓜细菌性斑点病拮抗菌菌株鉴定及其抑菌物质的研究 引言 甜瓜在植物分类上属葫芦科“甜柏口口哈密瓜属,是驰名中外的新疆特产 之一。但近十余年来,甜瓜细菌性斑点病病害一直是制约新疆甜瓜生产发展的主要障 碍之一。甜瓜细菌性斑点病的病原菌主要包括细菌性角斑病菌 .和细菌性果腐病菌 .等七。甜瓜细 菌性斑点病作为甜瓜的主要细菌性病害,使其产量和品质都受到极大影响,严重威胁 新疆甜瓜的生产,该病害一般发病率在?%,严重者达%,甚至造成全田绝收, 其病原菌不仅侵染叶片,造成叶部大面积枯焦、抑制植株的正常生长发育,同时还可 以侵染茎蔓和果实,使果面产生大小不等的斑点,导致果实内部腐烂,极大地影响了 甜瓜的产量、外销和贮藏,常造成严重的减产,特别在、份多雨年份,常可造成 毁灭性损失【。为防治该病,目前许多瓜农盲目大量用药,不仅增加了防治成本,而 且对农业生态系统和环境以及人类的健康造成的破坏性逐年加重,导致了恶性循环, 但仍见效甚微。故甜瓜细菌性斑点病已成为近年来影响新疆甜瓜生产的最大因素,也 是目前新疆甜瓜基地建设中的最大威胁。探索防治甜瓜细菌性斑点病的有效方法已成 为重要课题。 人类防治植物病害可以追溯到几千年前,过去使用的多为植物性或无机化学农 药。上个世纪年代初期,有机合成农药大量产生,有效地控制了病害,但是引发出 抗药性、环境污染和人类健康受到威胁问题【’’。为此,世界各国提出开发和使用绿 色农药,生物防治不断得到各国政府的重视。开展生物防治农作物病虫害,具有选择 性强、效果好、成本低、使用安全、不污染环境等特点。无论是从生态角度还是经济 角度,生物防治都有其自身的优点。 本实验室在前期探索甜瓜细菌性斑点病的生物防治过程中,已从甜瓜根际土壤中 分离到一株菌株.,该菌株对甜瓜细菌性斑点病具有较强的拮抗作用。本论文通过 对其鉴定及其发酵液中抑菌物质的性质研究,进而对其摇瓶发酵条件及其发酵液中抑 菌物质的初步分离纯化进行研究,为抑菌物质的进一步精制和结构鉴定提供依据,对 于甜瓜细菌性斑点病的生物防治具有重要的现实意义。第一章文献综述 弟一早义献琢尬 生物防治是指用生物或生物代谢产物来控制病虫害的技术,它是植物保护不可缺 少的组成部分。现代科技的发展使生物防治技术更加丰富,近年来有学者把转抗虫、 抗病基因植物也列入生物防治范畴【引。以生物防治手段控制农作物病害始于世纪 年代,年.报道可以用十几种常见土壤腐生真菌和细菌防治树苗的腐 霉根腐病。年报道土壤中某些拮抗性微生物对于土传病原菌具有抑制性。 世纪.年代,众多的科研工作者开发利用拮抗性放线菌及其所产生的抗生素: 年代开始,人们逐渐转向寻找其它拮抗性微生物和生防技术的研究,由拮抗放线菌 发展为利用一些快速生长繁殖的真菌、细菌以及病毒等,从利用腐生的土壤微生物发 展到利用植物体微生态系中的微生物,防治的病害种类也从种传和土传病害扩大到地 上部分的气传和虫传病害;年代以来,病害生物防治的研究和实践更为活跃, 而且 发展迅速引。 .生防放线菌的研究进展 放线菌是原核生物中一个类群。现在人们普遍认为,放线菌在微 生物中属原核生物界,厚壁菌门,放线菌纲,放线菌目。放线菌种 类繁多,代谢功能各异,是一类经济价值较大的微生物资源。从发现放线 菌至今,己经报道了多个属个种【】。放线菌中的许多属如链霉菌 ,?】。用在植物病害 都是植物根圈促生菌 . 生物防治中主要是链霉菌属,印所甜及其相关类群【。土壤中拮抗放线菌广泛存 在,而且培养方便,利用放线菌产生的生物活性物质制备新农药或制剂已成为无公害 农药的一个发展方向。 ..生防放线菌拮抗作用 拮抗作用是指一种微生物的活动抑制或杀死另一种微生物的现象,对 另一种微生物具有拮抗作用的微生物叫拮抗体。根据拮抗体对病原菌的作用机制的不 同,拮抗作用又分为抗生、竞争和重寄生作用种不同的类型。 抗生作用 生活在一起的两种微生物,如果其中一种微生物所产生的物质对另一种微生物具 有毒害作用,称为抗生。拮抗微生物在代谢活动中通过分泌抗菌物质直接 对病原物产生抑制是自然界普遍存在的现象。拮抗放线菌能够定殖在皮层组织并能产 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌?菌株鉴定及其抑菌物质的研究 生抑制病原茵的代谢物。拮抗放线菌的抗生作用主要依赖于产生抗生素,一般单株生 防放线菌可以合成多种抗生素。抗生素的作用机理主要是:?抑制微生物细胞代谢的 某些环节或代谢中的某些酶系统。微生物重要代谢环节被抑制,生长发育出现障碍, 甚至死亡。?广谱抗生素的抗菌机制:某些抗生素能抑制微生物共同的代谢途径,如 蛋白质和核酸的合成,则可抑制许多不同种类微生物的生长。?除了干扰代谢作用外, 有时也可影响病原菌的形态结构引。 竞争作用 竞争是指存在于同一微小生物环境中的两个或两个以上微生物之间 争夺这一生物环境内的空间、营养、氧气等的现象。竞争作用可分为:?空间竞争: 由于能够产生抗生素,放线菌能够抑制许多植物病原菌,但它们的应用价值还在于它 们在植物根围的定殖能力以及是否对有益菌有抑制作用等。?营养竞争:铁 离子” 利用度是土壤环境对微生物生长的一个限制因子,链霉菌能够分泌嗜铁素 ,鳌合铁离子,从而更多地利用铁离子,限制了病原微生物对铁离子的 需求,从而达到抑制病原菌的目的。 重寄生作用 植物病原菌被其它生物寄生的现象叫重寄生作用。由于放线菌具 有消化低等外膜的能力,结果这些菌在真菌菌丝体上发育,并且在菌丝体上以寄生菌 的形式有限度的生长着【】。常以吸附生长、缠绕、侵入、消解等多种形式抑制病原菌: 促进植物生长 】于 有的植物根际微生物能够促进植物生长 ?。【 年报道植物根际的链霉菌具有固氮作用,可与植物形成共生关系,促进植物的生 长。近年来,我国也开展了弗兰克氏菌共生固氮放线菌的研究,该菌能够诱导大范围 的放线菌根瘤植物产生根瘤,并促进植物对等元素的吸收。 植物根际放线菌主要可通过分泌产生抗真菌和细菌物质、竞争作用、重寄生和促 进植物生长等机制防治植物病害,可能以一种机制为主,同时也依赖于其它几种【引。 ..生防放线菌生物活性物质的研究现状 自从年发现青霉素,年发现链霉素,相继获得诺贝 尔奖,推动了抗生素研究在全世界的兴起【】。到年各国从微生物中发现的生 物活性物质约种,其中抗生素约种,非抗生素活性物质约种。放 线菌产生的抗生素种,占%,其中链霉菌属就产生种,占全部抗生素的 %;非抗生素活性物质种,占%】。 抗生素类 抗生素在农业上的应用最早可追朔到上个世纪年代,美国科学家利用链霉素、 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌一菌株鉴定及其抑菌物质的研究 土霉素及二者的混合物“农霉素”防治果树和蔬菜病虫害。其中“农霉素”对苹果、 梨、胡桃、柑橘、烟草、蔬菜及豆类等植物的细菌性病害防治有特效【引,且对少数真 菌性病害如霜霉和疫霉病也有防治作用】。到世纪年代后期,日本因汞制剂 停止生产使用而开始加强农用抗生素的研究。年日本筛选出灭瘟素 ,用于防治稻瘟病,收到显著效果,随后相继筛选出春日霉素、多氧 霉素,、有效霉素,尤其近几年来,日本还筛选出杀虫素和除 草素。现在俄罗斯、美国、日本、匈牙利、意大利、印度和丹麦等国,都已把农用抗 。 生素的研究列入国家重点规戈 年上海农药研究所筛选出井冈霉素产生菌【,该菌所产生的井冈霉素的大 规模生产和应用为我国农用抗生素的发展积累了丰富的经验。近年来又筛选出了不少 有前途的抗生素,如多效霉素【、宁南霉素【们、中生菌素【、多环酮类生素【等。 目前,我国研究和应用较多的杀虫素包括阿维菌素、浏阳霉素、杀蚜素等【?。现在根 据习惯的分类方法,将这些抗生素分为下列五类’】:内酰胺类抗生素、氨基糖苷 类抗生素、大环内酯类抗生素、四环类抗生素、多肽类抗生素。 水解酶类 放线菌可以分泌多种胞外水解酶,主要包括:几丁质酶、.,一葡聚糖酶、淀 粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、脂肪酶和核酸酶等。 植物病原真菌的细胞壁是以几丁质为骨架,以.,.葡聚糖等为主要填充物所 组成的。处于生长过程中的菌丝尖端几丁质多呈裸露状态,易被水解酶所攻击而导致 细胞破裂,生长受阻或者细胞死亡,达到拮抗防病的目的。年,研究发 现可以分解几丁质的细菌和放线菌菌株在几丁质平板上形成水解圈,从而证明了这些 微生物细胞内含有水溶性几丁质酶的存在。此后,人们又相继从多种微生物包括细菌、 放线菌、真菌,多种植物及动物中分离到几丁质酶,并对几丁质酶的理化特性 及生物 学活性进行了大量的研究。据报道,%的放线菌都可以产生几丁质酶,., 葡聚糖酶等溶菌酶【】,因此对它的研究已经引起各国植病生防工作者的高度重视。 嗜铁素 在低铁环境下,细菌能够产生多种对铁离子有高度亲和力的铁鳌合剂或含铁细 胞,络合根际铁离子,使病菌得不到足够的铁素营养,生长发育受到抑制。链霉菌能 够产生嗜铁素【,至今己经发现了链霉菌分泌的至少种嗜铁素。 其他抗菌物质 放线菌的代谢产物除了以上提及以外,还有有机酸、氨基酸、维生素、核苷酸、 酶和酶的抑制剂及其它免疫抑制剂等。在防治病害、促进作物的生长、提高作物产量 等方面也起着重要的作用,正越来越多地被人们开发和应用。 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌 .放线菌分类的研究进展 对放线菌的认识是年哈尔兹从牛的颈肿病中发现放线菌以后开始的【,最 初的命名来源于其具有良好的菌丝体,其菌丝呈放射状。世纪年代以前,报道 了含义不是很’明确的对人和动物有致病性的放线菌属;、诺卡氏菌属 和被认为是细菌的分枝杆菌。那时,大部分科学工作者都认 为放线菌是介于“细菌和真菌之间的微生物’’。年,提出原核生物界和 真核生物界之后,放线菌被归入原核生物界。年出版的《伯杰氏系统细菌学》 中,放线菌被划分在原核生物界,厚壁菌门,放线菌纲,放线菌引,目前包括 个亚目,个科,多个属【川。 ..放线菌的经典分类九 早期的放线菌分类是以形态学和培养特征为主,以生理生化为辅。分类依据主要 有: 形态特征:主要包括基内菌丝体的发育程度,是否断裂,有无气生菌丝和 孢子、孢囊、菌核以及其它结构,此外还要说明孢子链、孢子、孢囊、孢囊孢子的形 状、大小、数目等。培养特征:中科院微生物所年代初编著的《链霉菌鉴定 手册》根据基丝和生孢子气丝的颜色对链霉菌进行分群的;国际链霉菌计划的试: 生 验结果也是以生孢子气丝颜色为主,基丝和可溶色素的颜色为辅来鉴别的。 化特征:主要集中在几个酶的活性上,如明胶液化、淀粉水解、纤维素分解或在其生 长、牛奶凝固和胨化、硝酸盐还原等;在链霉菌属各个种的鉴定中,对于其是否能够 在有机培养基内产生黑色素越来越受重视;此外,对碳源的利用也成为必不 可少的内 容。 ..放线菌的现代分类 近年来,由于微生物生理及生物化学的迅速发展,特别是分子生物学的渗透,微 生物分类学出现由描述科学向实验科学转化的强烈趋势,而现代技术在放线菌分类上 的应用,.加速了这一趋势并逐渐打破了原来经典的描述分类,建立了如化学分类 ,分子分类 ,数值分类 甚至多相分类 等新的,有力推进了分类学的发展【。 化学分类 主要是对细胞组分的化学成分进行分析,包括细胞壁化学成分、枝菌酸、脂肪酸、 磷酸类脂、甲基萘醌、全细胞蛋白及核糖体蛋白电泳分析等【。 分子分类或遗传分类 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌一 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 由于核酸是贮存、传递遗传信息的物质基础,分析核酸的序列和结构的变化可直 接揭示有机体之间的亲缘关系,建立以系统发育关系为基础的分类系统。应用于分类 的分子主要为和。和在分类中扮演不同的角色。后来,经过研究 人们发现是最合适的分子选择,它具有保守性,在细胞中普遍存在,并且由高 度的保守区和可变区组成。因此,这些方法已成为现代细菌分类的主导方法,常用 于放线菌基因型分析的方法有以下几种:内含量摩尔百分比 %的 寡核苷酸编目分析等?。 测定、分子杂交、 数值分类 又称统计分类,是一种依据数值分析的原理借助计算机技术对拟分类的微生物对 象按大量表型性状的相似程度进行统计、归类的方法引。 尽管上述方法都各有所长,但生物的多样性表现在它能产生大量的不同的分子, 这就注定单相分类系统不能成功。虽然,以测序为基础的系统进化树是研究进 化的一大进步,但是主要分支单位之间的模式仍未确定。进化树稳定性有望利 用序列的积累来提高,而一个新的放线菌的描述需要综合它的表型特征和基因特征, 即多相分类 。一些新的放线菌谱系被发现,填补了进化树中 空白,同时也稳定了已存在的类群之间的关系。然而,亲缘关系较近的谱系分支位置 仍然不确定。测序的分辨率不足以分开这些类群。寻找一种不同的分子来确 定 这些关系是分子分类学家当前面临的任务。放线菌分类己不能仅仅从某一个侧面进行 研究,而生物多样性也表现在它能产生大量不同的分子,因此,多相分类表现出日益 重要的作用。多相分类综合了表型、基因型及系统发育的特征,使分类方法更趋于客 观合理,更能反映生物间系统进化关系,是研究各级分类单位最有效的手段。 .微生物产品的分离纯化 混合物的分离纯化步骤很多,处理时间长,收率低且重复性差【。按照生产过程 的顺序,微生物产品的分离纯化大体分为发酵液预处理和固液分离、初步纯化、精制 和成品加工四个过程。 ..发酵液预处理和固液分离 发酵液预处理目的是改变发酵液的物理性质和除去部分杂质。常用的预处理方法 是絮凝和凝聚等技术来加速固、液两相分离,或采用稀释、加热等方法降低发酵液黏 度,提高过滤速度。但是不同菌种和不同培养条件的发酵液其流变特性不同,主要影 响因素是细胞或菌体的大小和介质的黏度。如细菌及某些放线菌,菌体细小, 所以它 们的发酵液黏度大,不能直接过滤;此外,由于菌体自溶,核酸、蛋白质及其他有机 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 物质的存在,也会影响固液分离。对于胞内产物,则应首先收集细胞或菌体,经细胞 破碎使生化物质释放到液相中,再将细胞碎片分离除去。固液分离则常采用自然沉降、 离心分离和过滤等方法。 ..初步纯化 初步纯化的目的是除去与目标产物性质有很大差异的杂质,使产物浓缩,并起到 纯化的作用。常用的初步纯化方法有溶剂萃取法、吸附法、离子交换法和沉淀法等。 溶剂萃取法 溶剂萃取法是利用各种物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度的原理,来达到将 不同物质分离纯化的目的。溶剂萃取法在抗生素生产中广泛使用,如青霉素、红霉素、 麦迪霉素、螺旋霉素、吉他霉素等都是采用这种方法提取的【。溶剂萃取法不仅可以 采用有机溶剂萃取法进行分离,也在不断的发展中产生了新的萃取技术,如 液膜萃取、 反胶团萃取等萃取法、双水相萃取技术和超临界萃取等方法,适用于各种生物活 性物质的分离纯化。溶剂萃取法的优点是操作连续化,能耗低,生产周期短,分散效 率高,产品质量好。缺点是溶剂耗量大,对设备和安全要求高,需要各项防火防爆等 。 一一 吸附法 吸附法是利用适当的吸附剂如活性炭、酸性白土等,在一定的条件下,吸附生物 活性物质,然后再以适当的洗脱剂将吸附的物质从吸附剂上解析下来,达到浓缩提纯 的目的。另一方面,也可以利用吸附剂先吸附发酵液中的杂质或色素物质,而生物活 性物质有效成分仍留在发酵滤液中,然后改变发酵液的值,再把抗生素转到新的吸 附剂上达到浓缩的目的。吸附法在很多抗生素的分离纯化和精制中都得到应用,如早 期的青霉素提取、链霉菌的精制等。吸附法有着操作简便、安全、设备简单,可用或 少用有机溶剂,生产过程中值变化小,适用于稳定性差的生物产物等优点。其缺点 是选择性差,得率不太高,无机吸附剂性能不稳定,不能连续操作等。但随着凝胶类 吸附剂、大网格聚合物吸附剂的发展应用,克服了以往吸附法的这些缺点,所以重新 受到重视川。 离子交换法 离子交换法是利用合成的离子交换树脂作为吸着剂,依靠库仑力将发酵液中的活 性物质吸附在树脂上,而后用酸、碱水溶液或于其中加入少量有机溶剂洗脱活性物质, 这种方法利用离子交换树脂对于所交换离子的选择性,可以将抗生素和其他杂质分离 开来又因为所用的洗脱液离子浓度较高,用量可以较少,从而使洗脱溶液的体积可缩 小到几十分之一,所以又可以达到浓缩的目的【。选用离子交换树脂时注意的原则是: 带正电荷的碱性抗生素用阳离子树脂,带负电荷的酸性抗生素用阴离子树脂,强酸性 甜瓜细菡性斑点病拮抗菌一 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 或强碱性的抗生素宜选用弱碱性或弱酸性树脂,弱碱性或弱酸性的抗生素宜 选用强酸 性或强碱性树脂;弱酸性和弱碱性树脂宜选用盐型树脂,而强酸性和强碱性的则没有 限制【舢。离子交换法优点是收率高、质量好、成本低、设备简单、适宜工业化】,例 如链霉素、卡那霉索、庆大霉素、新霉素等均在生产使用。离子交换法也有生产周期 长、一次性投资大、产品质量有时稍差、以及不适合于稳定性差的生物活性物质等缺 点【】。 沉淀法 沉淀法是通过改变条件或加入某种沉淀剂,使所提取的物质或杂质在溶液中的溶 解度降低而形成无定行的固体沉淀的过程。由于其浓缩的作用大于纯化的作用,所以 常被用作初步分离的一种手段【孔。沉淀分离法具有设备简单、经济、收率高、操作简 单和浓缩倍数高等优点,其缺点是过滤困难、质量低,且需要活性物质在水溶液中有 足够的浓度,故此法在研究阶段应用较少而多用工业生产】。 ..精制 精制过程主要借助色谱技术。色谱技术是利用混合物中各组分理化性质分子 形状 和大小、带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性以及分子的亲和力的差 别,使各组分不同程度的分布在两相中,其中一相为固定的称为固体相,另一个相 则流过此固定相称为流动相,造成流动相对固定相作单向相对运动,流动相推动样 品中各组分经固定相向前迁移,使各组分迁移速度不同,而对物质进行分离的方法。 色谱技术有多种分类方法,同一色谱类型可以有不同的名称。按照固定相的附着 方式,可分为柱色谱和平板色谱。按照色谱分离原理,色谱技术可以分为吸附色谱、 分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱。按照流动相的物理状态,可以分为 液相色谱和气相色谱。 ..成品加工 为了最终获得质量合格的产品,常需要对纯化后的产品进行浓缩、结晶和干燥。 结晶的方法有多种,如浓缩结晶、冷却结晶、化学反应结晶和盐析结晶等。 .生物防治的发展趋势 放线菌作为一种具有丰富资源的微生物类群,在生物防治中很有开发应用前 景。 但是,目前人们只分离到大约%一%的土壤放线菌。因此分离未知放线菌,特别是 稀有放线菌是微生物资源开发的必要前提和关键之一。 目前国内外已筛选出多种抗病虫害有益微生物,但用于生物防治大多为直接使用 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌一 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 菌株或菌剂来防治病害。它们的货架期销售保质期及效果稳定性就难以保证。此外, 国内外开始研究拮抗微生物的遗传背景,克隆和分离了一些产生抗菌物质的基因。今 后的工作主要在以下几个方面进行: 详细了解生防微生物在植物根际和叶际与病原物及其它生物、植物及其分泌物、 土壤以及各种环境因子之间的相互作用及其变化规律,有效地调控无机与有机环境,. 。。 更好地发挥生防微生物的防病功能【 通过分离提取和纯化其抗菌物质包括抗生素与抗菌蛋白等,将微生物发酵品变 。 成真正的、标准的生物农药,从而更好地用于农业生产【 对已有的菌株通过菌株改良和发酵条件的优化,提高其效价。从而降低生产成 本,提高经济效益。 通过基因工程手段改变其代谢途径,开发新型的抗菌物质。为食品防腐、医药 卫生、生物防治等提供新制剂。 通过遗传工程技术,构建高效、多抗转基因工程菌或将微生物的抗菌基因转入 植物以培育转基因抗病品种,将是植物病虫害生物防治研究的一个研究趋势?。 随着人们对生物农药的越发重视,现代生物技术的出现,尤其是基因工程技术的 高度发展,为彻底改造野生型放线菌提供了有利的工具,生物农药将成为未来农药的 发展方向。放线菌将成为一类有着广泛实际用途的微生物资源,在植物病、虫、草害 的生物防治中发挥重要作用具有广阔的应用前景。 .本论文的研究内容 本实验室已从新疆昌吉地区采集的甜瓜根际土壤中分离到一株甜瓜细菌性斑点 病拮抗菌一,本文对菌株.及其发酵条件和发酵液中抑菌物质进行研究。主要包 括以下几个方面: 拈抗放线菌的鉴定,包括拮抗放线菌的菌体形态特征、生理特性、分子生物学 序列分析方法鉴定。 拮抗放线菌抑菌物质的性质初步研究,包括酸碱稳定性、热稳定性、紫外照射 稳定性、溶解性及其种类。 拮抗放线菌产生抑菌物质的摇瓶发酵条件研究,包括培养基组成、发酵时间、 发酵温度、初始值、接种量和装液量。 抑菌物质的初步分离纯化,包括离子交换层析法分离纯化。 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌一 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 .研究目的和意义 到目前为止,对植物细菌性病害生物防治研究较少,而且国内外对甜瓜细菌性斑 点病的生物防治的研究则更少。本试验的目的是通过对温室盆栽防病试验筛选出对甜 瓜细菌性斑点病有显著抑制作用的拮抗放线菌进行鉴定,并对所产生抑菌物质及其发 酵条件、分离纯化进行初步研究,确定抑菌物质的种类、性质和产生条件,从而为进 一步开展甜瓜细菌性斑点病生防机制的分子生物学和遗传改良研究,获得新的抗病基 因资源和开发生防菌剂等,提供理论基础和技术支持。在无公害农副产品的生产中, 放线菌产生的生物农药具有很好的应用前景。本课题旨在探索甜瓜细菌性斑点病新 的、更有效、更可靠的生物防治途径,对于提高甜瓜质量与产量,确保甜瓜品质和稳 产具有十分重要的现实意义。 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌一 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 第二章甜瓜细菌性斑点病拮抗茵一的鉴定 .前言 甜瓜是新疆的名、优特产之一,在国内外享有盛誉。年代后期,新疆甜瓜开始 销往我国香港地区,之后商品瓜生产逐步得到发展,种植面积不断扩大,形成了几个 出口瓜生产地。随着甜瓜大面积集中种植,病害的发生和危害逐日严重,特别是细菌 性斑点病发生尤为严重,发病后,不仅在叶部产生大量斑点,造成叶片焦枯、茎蔓枯 死,同时严重危害哈密瓜的果实,在瓜上开始产生针尖大小的水渍状小点,潮湿情况 下不断向果肉深层扩展,最后造成整个果肉腐烂,严重影响哈密瓜的品质、外销和贮 藏,导致瓜农的经济效益受损。甜瓜病害一直是制约甜瓜产业发展的核心问 题,使甜 瓜生产受到严重威胁,目前该病不断蔓延、为害日益加重,发生区域逐年扩大, 已成 为新疆哈密瓜生产中亟待解决的问题【引。对拮抗菌一进行鉴定,为甜瓜细 菌性斑点 病的生物防治及该菌株所产抑菌物质的进一步研究提供理论依据。 .材料与方法 ..主要仪器 压力蒸汽消毒器:上海博讯实业有限公司医疗设备厂 .一 ..超净工作台:苏州净化设备有限公司 一电子天平: 日本 .酸度计: 上海雷磁仪器厂 .生化培养箱: 广东省医疗器械厂 显微镜:曰本 全温恒温培养摇床:上海智城分析仪器公司 离心机:德国 .电热恒温水槽:上海精宏实验设备有限公司 .电泳凝胶成像仪:美国 . 仪:美国 ..菌株与培养基 拮抗菌.由本实验室分离保存。 . . 高氏合成一号培养基:可溶性淀粉 , , ,?甜瓜细菌性斑点病拓抗豳一西株鉴定及其抑西物质的研冤 . . . .?.。 ,? ,? ,琼脂 ,蒸馏水, 用于培养拮抗放线菌。 . . . 查氏培养基:蔗糖 , , ,? ,. . .?.。 ,蒸馏水, ,‘ . 系列培养基【孓】: ,蒸馏 麦芽膏一酵母膏培养基:酵母膏. ,葡萄糖. ,麦芽膏. ...。 水 ,琼脂 , 无机盐淀粉培养基: . . . 可溶性淀粉 ,。 ,‘ , , . . ,蒸馏水 .微量盐溶液:? ,微量盐溶液. , , . 。 .,? ,蒸馏水 甘油一天门冬酰胺培养基: . ,琼脂 .天门冬酰胺. ,甘油. ,? ,微量盐. , . . . ...微量盐溶液:? ,? ,? , 蒸馏水 。 . 拮抗菌?发酵培养基:葡萄糖 , ,。 , . . . .。, ,? ,蒸馏水 , 抑菌活性测定培养基:可溶性淀粉 , ,胰蛋白胨 ,甘油 , . . . . ,? , ,? ,琼脂 , 蒸馏水 .。 , ..拮抗菌形态观察 采用扦片法【,删观察菌株.在高氏合成一号培养基上的形态特征。将扦片平 板 于培养,分别于. 用镊子小心拔出盖玻片,擦去背面的培养物,置载玻片上 在光学显微镜下观察气生菌丝、基内菌丝和袍子丝的形态及是否有横隔、断 裂、膨大 等特征。 ..培养特征观察 将拮抗菌.分别接种于高氏合成一号、查氏、麦芽膏一酵母膏培养基、 无机盐淀粉琼晤、甘油天门冬酰胺琼旨培养基上,。培养?,观察记 录生长情况,以及基内菌丝、气生菌丝和可溶性色素的颜色。参照《链霉菌 鉴定手册》 【“进行颜色的记录。 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌菌株鉴定及其抑菌物质的研究 .。生理特征测定 ...拮抗菌最适生长温度 菌株以一环接入高氏合成一号液体培养基,分别在、、、、,每 观察一次。采用高氏合成一号液体培养基未接种的对照管对比,目测生长情 况【。 ...拮抗菌最适生长的值 / / 培养基为高氏合成一号液体培养基,采用试管培养,用 和 将其值分别调至,,,,,,,,测定最适生长的值,培养温度为 ?,每隔 观察记录次。采用高氏合成一号液体培养基未接种的对照管对比, 目测生 长情况。 ...拮抗菌耐盐性试验 菌株采用高氏合成一号液体培养基,分别加入%、%、%、%、%、%、 %/的后,在。培养,每 观察一次。采用高氏合成一号液体培养基 未接种的对照管对比,目测生长情况。 .. 序列测定 ...拮抗菌?基因组总提取 采用酶法提取拮抗菌.基因组总: 菌体加入 /的溶菌酶用缓冲液稀释 ,放入摇 。 床.加入% 和蛋白酶 此震荡混匀 ,放入?烘箱. 蛋白酶浓度为 ./。 加入 /离心 , 苯酚:氯仿:异戊醇::,震荡混匀后 吸取上清液不要吸到中间渣滓,重复抽提次。 上清液加入 ...混匀后,加入 /乙酸钠 异丙醇,放入 .?冰箱. 或过夜;或者加入 无水乙醇,再加入此 /乙酸钠 ...室温放置 以上。 /离心 后,去除上清液,加入肛%乙醇,轻摇洗沉淀 .次, /低温离心 ,弃乙醇。 .干燥后,加入缓冲液肛溶解视量而定,.? 查甚??鐾茎 保存各用。 .反应四 通用引物 以提取总为模板进行扩增。 扩增用引物为 :.和:’ 为:预混液 ,引物为和各.“, 进行扩增。反应体系 , ;?变性 止,模板.汕。扩增条件为?预变性 退火 。?延伸,共个循环;继续延伸。 ...序列测定及系统发育树分析 扩增产物经纯化后,送上海基康生物技术有限公司进行产物的直接测序。将 测得的基因序列利用软件与中核酸数据库进行相似性比较分析.用 软件包川中的邻按 对相似的序列进行多重序列比对分析,用 法 ?构建系统发育树。 .结果与分析 . 拮抗菌 的形态特征 能否产生菌丝体及由苗丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的 重要 依据。为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征,采用扦片法进行 形态特征 观察。 在高氏合成一号培养基上?插片培养 ,取插片分别在光学显微镜下观察 圈。基内菌丝多分支、无横隔、无断裂现象:气生菌丝发育照好,呈长短不一 的孢子链,孢子链呈松螺旋型。 图 菌株形态特征×甜瓜细菌性斑点病拮抗菌菌株鉴定及其抑菌物质的研究 一 . ..培养特征 拮抗菌.在高氏合成一号、查氏、无机盐淀粉琼旨、甘油天门冬酰胺琼 脂培养基上生长良好表?,基内菌丝发达、气生菌丝丰富,气生菌丝为白 色或灰色,基内菌丝为灰色或深褐色。在种培养基上均未产生可溶性色素。 表菌株培养特征结果 .. ..生理特性 对拮抗茵.进行了部分生理特征试验。拮抗菌.可在?一。生长,最适 .左右;在含.%的高 生长温度;可在 生长,最适生长 氏一号液体培养基中均有生长现象,但在低于%的高氏一号液体培养基中生 长 良好。 .. 序列分析 在原核生物中, 广泛存在于原核细胞核糖体小亚基上,功能稳定,既有 高度保守的区域又有相对可变的区域,其大小约为 ,所代表的信息量既能反映 生物界的进化关系,又较容易进行操作,可适用于各级分类单元,是原核生物 系统分 类和进化研究的最理想材料】。 产物的测序结果见附录,拮抗菌.的 基因核苷酸序列 .全长 。序列测定结果提交进行序列相似性 搜索,发现该菌株序列与链霉菌属菌株高度相似,说明该菌株属于链 霉菌属。利用 .软件邻接法方法构建系统发育树见图 的 ?,拮抗菌.与链霉菌属典型菌株娄彻氏链霉菌 基因序列相似性为.%以上聚在同一个系统进化分支上,将拮抗菌.鉴定为 。 娄彻氏链霉菌 卜?叫 . 图依据 序列构建的菌株和链霉菌属相关典型菌株的系统发育 树状关系图 . . 注:菌株后面括号内表示序列号;分支上的数值表示通过次取样计算出的值: 标尺单位 为 基冈序列中个核苷酸有个核苷陵置换。 .:.: . .小结 根据菌落、菌体形态特征和生理特性,确定.属于链霉菌属。 结合 序列的系统发育分析,将拮抗菌一鉴定为娄彻氏链霉菌 。 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌菌株鉴定及其抑菌物质的研究 第三章发酵液中抑菌物质的性质初步研究 .前言 本实验室已从新疆昌吉地区采集的甜瓜根际土壤中分离到一株放线菌菌 株., 生物活性测定表明,其对甜瓜细菌性斑点病具有较强的抑菌活性。研究摇瓶 发酵得到 的抑菌物质性质,有助于确定其分离纯化方法,为放线菌菌株一进一步的开 发利用 提供理论基础。 .材料与方法 ..仪器 压力蒸汽消毒器:上海博讯实业有限公司医疗设备厂 ?一 ..超净工作台:苏州净化设备有限公司 一电子天平: 日本 .酸度计: 上海雷磁仪器厂 广东省医疗器械厂 .生化培养箱: 全温恒温培养摇床:上海智城分析仪器公司 .电热恒温水槽:上海精宏实验设备有限公司 游标卡尺:青海量具刃具有限责任公司离心机:德国 ..菌株与培养基 拮抗菌一由本实验室分离保存,细菌性角斑病菌 . 与细菌性果腐病菌 .由石河子大学 农学院李国英教授赠送。 . 培养基:蛋白胨 . ,甘油 ,? ,? , .。 琼脂 ,蒸馏水 , 高氏合成一号培养基:同..。 . 拮抗菌发酵培养基:葡萄糖 , ,? ,? . . . .。 , ,’ ,蒸馏水 , 抑菌活性测定培养基:可溶性淀粉 ,胰蛋白胨 ,甘油 , , . . . . ‘ ,‘ , ,‘ ,琼脂 ,甜瓜细菌性斑点病拮抗菌 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 蒸馏水 .。 , ..拮抗菌 发酵液抑菌活性测定 将拮抗菌.接种于高氏合成一号培养基斜面上,在?培养 后,用 无菌水洗下,转入另一个装有玻璃珠的无菌管中振荡使成为孢子悬浮液。将 孢子悬浮 三角瓶中,然后于 液按照.%接种量接入装有 的液体发酵培养基的 ?、转速为 /的摇床上培养. 。发酵液于 /离心 ,收集上 清液即胞外代谢物;沉淀用生理盐水清洗遍,离心并收集沉淀,用超声波破 壁, 再离心收集上清液即胞内代谢物。用培养基培养指示菌和,胞外代 谢物和胞内代谢物分别用直径为. .的无菌过滤器过滤除菌后,采用管碟法【’】 检测抑菌活性。 ..抑菌物质稳定性测定 ...热稳定性测定 取 拮抗菌?发酵上清液于玻璃试管中,分别在、和水浴 、 、 、 中加热 力,用直径为. .的无菌过滤器过滤除 菌,采用管碟法检测抑菌活性。以发酵上清液作为对照来测定抑菌活性。每 个处 理均设个重复,利用 .软件,选择法对试验结果进行方差分析。 ...酸碱稳定性测定 / / 取 拮抗菌.发酵上清液于 三角瓶中,用 和 ,放置 后再 、 、 分别处理至 、 、 、 、 / / 用 和 调整为中性【;用直径为. .的无菌过滤器过 滤除菌,采用管碟法【检测抑菌活性。以发酵上清液作为对照来测定抑菌活 性。每 个处理均设个重复,利用 .软件,选择法对试验结果进行方差分析。 ...紫外线稳定性测定 取 拮抗菌.发酵上清液加入到无菌开盖平皿中,铺成约加薄层,在 、 、 、 、 、 。补加无菌蒸馏 紫外灯距光源 下分别照射 水到原体积,用直径为. 的无菌过滤器过滤除菌,采用管碟法【’】检测抑菌活 . 性。以发酵上清液作为对照来测定抑菌活性。每个处理均设个重复,利用 软件,选择法对试验结果进行方差分析。 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌菌株鉴定及其抑菌物质的研究 ..抑菌物质溶解性测定 取 拮抗菌.发酵上清液,加入等体积的乙酸乙酯、乙醚、石油醚,对 抑菌物质进行萃取。静置过夜后,用直径为.牡的无菌过滤器过滤除菌,采用 管 碟法【】检测有机相和水相抑菌活性。以有机溶剂和发酵上清液作为对照来 测定抑菌 活性。每个处理均设个重复,利用 .软件,选择法对试验结果进行 方差分析。 .. . 溶剂系统纸层析 取拈抗菌.发酵上清液,采用 种溶剂系统进行纸层析。测量抑 .软件,选择 菌物质的比移值尺值。每个处理均设个重复,利用 法对试验结果进行方差分析。 滤纸处理 × 选用新华一号滤纸,滤纸剪成 纸条, 长的纸条分别在其距两端 . 处用铅笔画上直线,并在其一端直线的中央点样处打上“×号作为原点, 另一端写上欲层析的系统号。 点样 用毛细管吸取拮抗菌.发酵上清液点于原点,点样直径大小控制在. 内, 点样量为 ,边点边用热风吹干。 展层 种溶剂系统的大试管中,使点样 将点样吹干后的滤纸条分别悬挂于 端.浸入各溶剂系统,室温下通风厨中进行展层。当溶剂上行扩展到距纸条上 端 . 时取出,并在溶齐;沿做标记,挥发除尽溶剂。 种溶剂系统/: ?水饱和的正丁醇: ?水饱和的正丁醇,内含%对甲苯磺酸; ?正丁醇:乙酸:水::; ?水饱和的正丁醉,内含%六氢吡啶; ?以正丁醇饱和的./、的磷酸缓冲液; ?正丁醇饱和的水,内含%对甲苯磺酸; ?苯:甲醇:,本系统所用滤纸先用./、的磷酸缓冲液处理后晾干; ?甲醇:水:,水内含%,本系统所用滤纸先用%处理后晾干才使用。 生物显影 将层析晾干后的纸条平贴在含菌琼脂平板上,在培养箱中放置分钟,使纸 上相应部位的活性物质扩散渗入到培养基中,做好标记,用小镊子取去纸条, 放置于 鬻煮煮爨慧纂篝攀坠??????一, ?培养箱中培养至出现抑菌圈,测量抑菌圈位置,孬孬荪;磊易荔露磊芦 .结果与分析 ..抑菌物质定位 ? 外 拮 物菌 , 和活 胞性 代胞 谢外 物代 抑物菌和活发 性酵 。原 采抑液 用菌的 管圈抑 碟结菌 法果活 分性 别见很 。 测表挠定近 抗证 蔺表明 爵珩 明抑 的谢。 ,菌 对 胞物 发内质酵代主 原谢要 液物为 、未胞 胞检外 内测代 代出谢 谢抑物。 . ? .. .啦. 兰一 表?温度对菌株发酵液抑菌活性的影响。 疏卸毗 。 咖的 ,. 。?。 .:. .士. .. .?. .:. .?. .士. .?./ .士. . . .:. .:圭. .士. ...阻. . :. .. .:. .士. .士.菌株鉴定及其抑菌物质的研究 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌 ,,,:同一列中的小同字母表示在.水平上有显著差异。 . . ,,,: ..抑菌物质稳定性 ...热稳定性 由表.可以看出,?、处理 和?处理 ,发酵上清液 抑菌活性与对照无显著差异;?处理 抑菌活性发生显著变化,随着时间继 续延长,抑菌活性下降更加明显。表明拮抗菌.发酵液中抑菌物质在以下具 有很好的热稳定性。 ...酸碱稳定性 处理 ,发酵上清液抑菌活性与对照无显著性差异,且 从表.可见,在 在 、 、 处理没有发生显著性改变;在 、 、 、 处理 发酵上清液抑菌活性发生明显下降,且随着碱性的增强,下降越多。由 此可 以看出,拮抗菌.发酵液中抑菌物质在 .之间较稳定,酸性条件稳定性优于 碱性条件。 表酸碱对菌株 发酵液抑菌活性的影响 一,,,,,:同一列中的不同字母表尔在.水平上有显著差异。 . . ,,,,,: ...紫外线稳定性 . 由表?可知,紫外线照射 ,发酵上清液抑菌活性与对照无显著性差异, 但随着照射时间延长至 ,抑菌活性略有下降。表明拮抗菌发酵液中抑菌物 质对紫外照射的稳定性较好。 表紫外线对菌株一 发酵液抑菌活性的影响. .. .. .士. .?. .?. .士. .士. .士. .士. .士。 .士. .:. . . .. ,,:同一列中的不同字母表示在.水平上有显著差异。 ,,:. . ..抑菌物质溶解性 由表可以看出,发酵上清液经过乙酸乙酯、乙醚、石油醚萃取,抑菌活性仍 然存在于水相中。表明拮抗菌发酵液中抑菌物质不溶于有机溶剂乙酸乙酯、 乙 醚、石油醚。 表抑菌物质溶解性结果 ???????????????????????????????????????~。 吼砒’ . 响:。?? .. 溶剂系统纸层析 捷克学者依据前人经验曾提出了八种溶剂系统。由于各类抗生素的酸碱性、 极性 和溶解性不同,根据它们在八种溶剂系统中呈现出来的值所画成的图谱也各 有一定甜瓜细菌性斑点病拮抗菌一 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 的特征,而把抗生素分为不同的大类。 由图.可以看出,在溶剂系统即水饱和的正丁醇、溶剂系统即含%六氢吡 啶的水饱和的正丁醇和溶剂系统即苯:甲醇:,/中值为;在溶剂系统 即含%对甲苯磺酸的水饱和的正丁醇、溶剂系统即正丁醇:乙酸:水::, 和溶剂系统即甲醇:水:,/中值较小而在溶剂系统即正丁醇饱和的 . 和溶剂系统即含%对甲苯磺酸的正丁醇饱和的水 /的磷酸缓冲液 中值较大;其值的折线图形似船帆型。经过与标准纸层析图谱比较,表明拮抗 菌.发酵液中主要抑菌物质属于碱性水溶性物质。 . . 髓. . .图抑菌物质在.溶剂系统中纸层析结果 .? 注::水饱和的正丁醇;:含%对甲苯磺酸的水饱和的正丁醇;:正丁醇:乙酸: 水::,//;:含%六氢吡啶的 水饱和的正丁醇;:正丁醇饱和的./的磷酸缓冲液 ;:含%对甲苯磺酸的正丁 醇饱和的水;:苯:甲醇 :,功;:甲醇:水:,/.:: ;:% ;:: ./ :::,//;: %;:;? % ;:::,/; :::,/. .小结 甜瓜细菌性斑点病拮抗菌.发酵液中抑菌物质主要为胞外代谢物,不溶于石油醚,乙醚, 处理 乙酸乙酯等有机溶剂;在?处理 或紫外线照射 ,该物质抑菌活性不变: 、 纸层析结果表明,该物质主要为碱性水溶性物质。甜瓜细菌性斑点病拮抗菌 菌株鉴定及其抑菌物质的研究 第四章甜瓜细菌性斑点病拮抗菌. 摇瓶发酵优化 .前言 菌株本身的性能是决定微生物发酵生产的基本条件,但有了优良的菌种后,必需 有最佳的外界环境条件,才能使其生产能力充分的表现出来。菌种的发酵工艺条件包 括培养基组成、培养温度、培养时间、初始值、通气量等,为此设计合理的发酵工 艺条件,使菌种处于最佳的外界环境条件下,才能得到优质高产的效果。对拮 抗菌? 摇瓶发酵条件的研究,为今后放大培养提供理论依据。 利用微生物发酵生产各种有用代谢产物,其培养基成分种类繁多,各成分间的相互 作用也错综复杂。因而,微生物培养基的优化就显得尤为重要,数学统计中的多种优 化方法已开始广泛地应用于微生物发酵培养基的优化工作中,主要包括正交设计法、 均匀设计法、?设计法、中心组成试验设计法和响应面法等。 ?设计法是基于不完全平衡块原理,能从众多的变量中快速筛选出最 为重要的因素【。啊应面法 ,简称是利用合理 的试验设计并通过实验得到的一定数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值 之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一 种统计方法。响应面法在优化研究中应用频繁,是降低开发成本、优化加工条件、提 高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法,它已广泛地应用于农业、 生物、食品、化学、制造等领域引。 .材料与方法 ..仪器 压力蒸汽消毒器:上海博讯实业有限公司医疗设备厂 .. ..超净工作台:苏州净化设备有限公司 ?电子天平: 日本 一酸度计: 上海雷磁仪器厂 一生化培养箱:
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