【doc】乙烯雌酚诱发大鼠泌乳素腺瘤动物模型的建立

【doc】乙烯雌酚诱发大鼠泌乳素腺瘤动物模型的建立 乙烯雌酚诱发大鼠泌乳素腺瘤动物模型的 建立 ? 3l8?中国微侵袭神经外科杂志(CMINS),2003,8(7) ? 实验研究? 乙烯雌酚诱发大鼠泌乳素腺瘤动物模型的建立 初明,胡志强,魏兰兰,杨孔宾,王超,胡恩喜,董齐,刘恩重 (哈尔滨医科大学第一附属医院1.神经外科;2.基础学院,黑龙江哈尔滨150001) 摘要:目的建立大鼠泌乳素腺瘤动物模型,观察大鼠不同性别,用药时间和去势等因素对其发生的影响.方法将Wistar大鼠分 为注射乙烯雌酚(DES)的雌性鼠试验组,去势鼠试验组和雄性鼠试验组,每组内设对照组.分别于第2,4,8和12周时观察大鼠脑垂 体重量及血清泌乳素(PRL)水平和垂体组织病理学改变.结果雌性组和去势组8周时大鼠均形成腺瘤,血清PRL水平达高峰.雄 性组12周时大鼠均形成腺瘤,PRL水平和垂体重量随着DES作用时间的延长而持续增高.结论腹腔注射DES可以引起Wistar大 鼠泌乳素腺瘤的形成,是一种制作简便,可靠的动物模型,大鼠性别,是否去势对其形成无明显影响. 关键词:雌激素;Wistar大鼠;泌乳素腺瘤;垂体肿瘤 中图分类号:R739.4l文献标识码:A文章编号:1009一l22X(2003)07-0318—04 DevelopmentofaprolactinpituitarytumormodelinWistarratsinducedbydiethylstilbestrol CHUMing',HidZhiqiang',WEILanlan,etal 1.DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital;2.MedicalCollege,HarbinMed icalUniversity,Harbin150001,China Abstract:ObjectiveTodevelopaprolactinomamodelinWistarratsandtoinvestigatetheinflu enceofthegenderdifferences,timetaking ofthediethylsti1bestrol(DES)andovariectomy.MethodsWistarratsweredividedintoDES—treatedfemalegroup(F),DES—treated ovariectomizedfemalegroup(0),DES— treatedmalegroup(M)andtheircontrolgroups.FiveratsinDES?treatedandcontrolgroupsWeT~ executedrespectivelyafter2,4,8,and12weekstoinvestigatetheweightofpituitarygland,seruHlprolactin(PRL)level,pituitarylight microscopeandimmunocytochemistry.ResultsBy8weeks,100%pituitaryglandsoffandOdevelopedprolactinomas,associatedwith increasedserllmPRLlevels,peakedat8weeks.By12weeks,allthepituitaryglandsofMbecameprolactinomas,associatedwithincreased serunlPRLlevelsandtheweightofpituitaryglandinatime—anddose— dependentpattern.ConclusionIntraperitonealDESinjectioncan formingprolactinomainWistarrat.ItisaconvenientandstablepituitarytUlIlOrmode1.Genderdifferenceandovariectomyarenotsignificantly differenttoformingprolactinoma. Keywords:estrogen;Wistarrat;pmlactinoma;pituitarytumor 泌乳素(PRL)腺瘤是人类最常见的功能性垂体肿 瘤【lj.有研究显示,长期给予大鼠雌激素,可诱发大鼠垂 体泌乳素细胞增生和PRL腺瘤的发生.建立稳定,可靠 的大鼠垂体PRL腺瘤模型对研究PRL腺瘤的形成机 制和寻找有效的治疗措施具有重要意义.本实验用乙 烯雌酚(DES)诱发大鼠垂体PRL腺瘤,并观察大鼠不 同性别,用药时间和去势等因素对腺瘤发生的影响. 1材料与方法 1.1动物的分组和处理实验用雌性和雄性Wistar 大鼠,鼠龄28-30d,体质量80-100g.随机分成注射 DES的实验组和不用任何药物的对照组.将试验组进 一 步分为:雌性鼠试验组(F),去势鼠试验组(O)和雄 性鼠试验组(M),每组以同性别,同龄鼠做为对照组. 收稿日期:2003一o4—04;修回日期:2003—06一o4 作者简介:初明(197l一),男,黑龙江哈尔滨市人,医学博士,哈尔滨医 科大学附属医院主治医师研究方向:垂体腺瘤的基础和临床研究 疆 去势组及其对照组于用药前1周行腹腔内注射芬太尼 0.3mg/kg+美托咪定0.3mg/kg合剂麻醉,腹部常规消 毒,行正中纵形切口,长2,3cm,切除大鼠双侧卵巢. 试验组大鼠腹腔内注射DES(5ms/ks,2次/周, Sigma公司),对照组腹腔内注射生理盐水(10ml/kg,2 次/周),各组分别于用药后2周,4周,8周和12周处 死5只大鼠.采眶动静脉血2-3ml,3000r/min,离心 15rain分离血清,一70?保存.同时迅速开颅,将鼠脑 翻向腹侧,垂体位于视交叉后下方的蝶鞍内,面有 脑膜覆盖,两侧为三叉神经.显微镜下取出垂体,称取 重量,观察垂体有无出血坏死,剔除后叶(位于垂体中 央,有包膜,易与垂体前叶分离);将垂体前叶一半冻 存于液氮中,另一半用4%多聚甲醛固定. 1.2大鼠血清PRL水平放射免疫测定PRL放免测 定试剂盒由美国NIDDK提供,按照其提供的标准程 序改进后测定血清PRL浓度.分离剂为二抗加聚乙烯 二醇(PEG)法.以氯胺一T法制备I标记大鼠泌乳素 抗原,检测灵敏度为0.24g/L,批内和批间变异系数 第7期.初明,等.乙烯雌酚诱发大鼠泌乳素腺瘤动物模型的建立?3l9? (CV)分别为5.1%和9.1%. 1.3垂体组织病理学和免疫组化检查大鼠垂体组 织常规石蜡包埋,切片4~5m,行HE染色,光镜观察 组织学形态.一部分切片采用免疫组化ABC法显示垂 体组织PRL蛋白的表达和分布.石蜡切片脱腊后采用 3%H20室温孵育5-10min,蒸馏水冲洗,用l%PBS浸 泡5min,以封闭非特异性结合位点,倾去血清,滴加抗 大鼠PRL抗体(浓度l:l000),同时用PBS代替一抗做 为对照,4?过夜后,滴加生物素标记的羊抗大鼠抗体 (1:200),37?孵育20min,滴加辣根过氧化酶标记的 链霉卵白素工作液,37?孵育20min,行DAB染色. 1.4统计学处理实验数据以均数?标准差表示, 组间比较用成组设计资料t检验和两因素析因设计的 方差,用SPSS10.0统计软件进行处理. 2结果 2.1大鼠垂体重量的变化(表l,图1)大鼠腹腔注射 DES后,从第2周开始,F组和O组垂体重量渐增,与 对照组比较差异有显着性意义从第4周开始M组垂 体重量渐增,与对照组比较差异有显着性意义.8周时 F组和O组大鼠垂体重量约为M组大鼠的2倍,P<0.05. 2.2血清PRL水平的变化(表l,图2)试验组大鼠 的血清PRL水平从第2周开始显着升高,其中F组 和O组在第8周时达到高峰,而M组的血清PRL水 平在第l2周仍持续升高,与各组对照组之间差异具 有非常显着性意义,P<0.0l.l2周时F和O组大鼠血 清PRL水平约为M组大鼠的2倍,P<0.05. 2.3垂体组织病理学改变和免疫组化结果F组,O 组和M组2,4周的垂体标本肉眼可见体积增大,颜 色呈灰白色,与正常垂体颜色基本相同.光镜下细胞 体积增大,数目增多,胞核大小基本一致,核质染色不 均匀,无核异型性.免疫组化染色发现泌乳素细胞较 对照组显着增加,胞浆内PRL含量增多.F和O组8, l2周与M组l2周垂体体积增大更明显,呈暗红色, 组织较软,易碎,切面可见出血.光镜下细胞数目增多 更明显,细胞呈圆形或多角形,细胞间可见新生血管. 胞浆带增宽,核大小不一,深染,有核异型性(图3, 4).免疫组化染色PRL阳性细胞充满视野,M组PRL 阳性细胞较多,着色较深(图5-7).M组8周时只有 一 部分大鼠垂体的细胞学改变与其l2周垂体相似. 表1DES对大鼠垂体重量(rag)和血清PRL水平(ng/m1)的影响(i?s) 注:与对照组比较,P<0.05;P<0.01 FOM 图lDES用药8周后各组大鼠垂体重量 注:与各对照组比较,P<0.0I.M组与F组和0组比较,P< 0.05:F组与0组比较,P<0.05 F'OM 图2DES用药l2周后各组大鼠血清PRL水平 注:与各对照组比较,P<0.O1;M组与F组和O组比较,P< 0.05;F组与0组比较,P<0.05 _0蔓.?,?一:譬罄鞋姓岱联l籍鞋",垂鞋翳弘l_ 咖姗潞瑚? 一IlII一富蜒目 蚰加?蛐??加mO 一g一卿恻 ? 32O?中国微侵袭神经外科杂志(CMINS),2003,8(7) 图38周时F组大鼠腺垂体组织,可见增大的细胞核和酸性核仁(HE染色×200)图4正常雌鼠腺垂体组织,可见正常垂体嗜染 细胞和嫌色细胞(HE染色×200)图5正常去势雌鼠腺垂体组织(免疫组化染色× 800)图68周时0组大鼠腺垂体PRL阳 性细胞(免疫组化染色×800)图712周时M组大鼠腺垂体PRL阳性细胞(免疫组 化染色×800) 3讨论 雌激素长期作用于敏感种系大鼠可以导致其垂 体前叶PRL细胞增生,PIlL大量分泌,以及PIlL腺瘤 形成.有人认为组织学上垂体增生只是细胞密度增大 和胞浆增宽,而腺瘤形成时细胞密集排列,细胞形态 不一,可见核异形性给予雌激素的大鼠,肉眼可见其 垂体增大,通过明显增加的垂体重量可以判断垂体瘤 的形成.有人认为认为垂体重量大于50mg即可判断 为腺瘤,也有人认为垂体重量升高为正常大鼠垂体的 3倍,并伴高PRE血症是诊断为垂体泌乳素腺瘤形成 的标准『2】.本研究显示F组和0组8周时大鼠血清 PRL水平分别达3441.8ng/ml和3665.7ng/ml,达 对照组的207倍和226倍;垂体平均重量为83.3mg 和86.9mg,是对照组的6.9和7.O倍.M组大鼠l2周 时血清PRL水平达1983.3ng/ml,比对照组升高152 倍;垂体平均重量为78.8mg,是对照组的6.7倍.这表 明:DES可以引起Wistar大鼠垂体泌乳素细胞增生, 并最后形成腺瘤.随着DES作用时间的延长,垂体重 量,垂体泌乳素细胞内和血清PRL水平逐渐增加,是 垂体泌乳素细胞从增生到腺瘤形成的过程.综合上述 标准进行判别,F组和O组8周时100%的大鼠形成 腺瘤,血清PRL水平达高峰,但l2周时垂体重量仍有 增加,达102.5mg和108.0mg.M组8周时仅2O%的 大鼠形成腺瘤,12周时100%的大鼠形成腺瘤,血清 PRL水平和垂体重量随着DES作用时间的延长,仍持 续增高. 本研究显示:注射相同剂量的DES,8周和12周 时F组和O组大鼠的垂体重量,PRL水平和肿瘤发生 率两组间差异无显着性意义,P>0.05,提示雌鼠是否 去势对DES诱发大鼠泌乳素腺瘤的发生无明显影响. 8周时F组和O组大鼠泌乳素腺瘤发生率和垂体重 量均明显高于M组.12周时F组和O组垂体重量虽 明显高于M组,但其肿瘤发生率差异无显着性意义, P>0.05.提示不同性别Wistar大鼠均可诱发出泌乳 素腺瘤,但雌性鼠需时较短,这可能与雌激素受体的 表达高低有关.注射相同剂量的DES,F组和O组大 鼠血清PRL水平明显高于M组,且PRL免疫组化染 色M组PRL阳性细胞较多,染色较深,提示M组的 肿瘤细胞贮存PRL较多,而F组和O组的肿瘤细胞将 较多的PRL释放出来,引起血清PRL水平升高. 雌激素诱发大鼠垂体泌乳素腺瘤的机制可能与 下列因素有关:雌激素减弱或消除了下丘脑结节漏斗 束多巴胺能神经元对PRL分泌的抑制作用;雌激素直 接作用于腺垂体组织的雌激素受体;雌激素通过调控 雄激素应答基因(PTFG),碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达,在 泌乳素腺瘤发生的早期分子机制中起作用[3'41. ?百一——]丽,飘 一0h一一}..,,I 中国微侵袭神经外科杂志(CMINS),2003,8(7)?321? 参考文献 【l】NomikosP,BuchfelderM,FahlbuschR.Currentmanagement ofprolactinomas【J1.JNeurooncol,200l;54(2):139—150, 【2】SpaayTJ,McCombRD,ShullJD.Estrogenactionintheregu— lationofcellproliferation,cellsurvival,andtumorigenesisin theratanteriorpituitarygland【Jj.Endocrine,1999;11(3): 217—233. 【3】HeaneyAP,HorwitzGA,WangZ,eta1.Earlyinvolvementof estrogen--inducedpimimrytumortransforminggeneandfibrob?- lastgrowthfactorexpressioninprolactinomapathogenesis【J]. 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[4】HeaneyAP,FemandoM,MelmedS.Functionalroleofestro— geninpituitarytumorpathogenesis【J】.JClinInvest,2002;109 (2):277—283. ? 基层专科IZl地? 双管引流和尿激酶溶解术治疗高血压脑出血(附56例) 谭翱,王有存,谢宝君 (河池市第一人民医院神经外科,广西宜州546300) 关键词:高血压脑出血;尿激酶;引流;双管 中图分类号:R743.34文献标识码:B文章编号:1009—122X(2003J07—0321一Ol 我院20o0年l1月~2002年12月采用CT定位, 床边锥颅双管引流术治疗56例高血压脑出血病人, ll缶床效果满意.现报告如下. 1对象与方法 1.1一般资料:本组男39例,女17例;年龄33,76 岁,平均51.6岁.人院时收缩压20,33kPa,有明确高 血压病史者41例.CT示血肿量15,180ml.其中幕下 7例,血肿量为l5,60ml;破入脑室系统3l例.嗜睡 13例,浅,中度昏迷32例,重度昏迷ll例.单侧瞳孔 散大32例,双侧瞳孔散大2例,双侧瞳孑L缩小4例. 1.2手术方法:采用CT定位,用卡尺测出血肿在 头部的体表投影,标记血肿量最多层面的中心部位和 患侧侧脑室前角两点,单纯性血肿则取前后两点为锥 颅穿刺点,计算进针深度.局麻,用自制直径6mm锥 颅器锥孔,穿刺针穿破硬脑膜,用钝头带侧孔的硅胶 引流管(外径5mm,内径3.5mil1),按计算深度置人血 肿最大径的中心或血肿稍后方,即有陈旧性暗红色血 液流出.固定引流管,用注射器抽吸,如出现负压即停 止.血肿破入脑室系统者,以同样方法锥颅穿刺侧脑 室前角引流.术后即复查CT,视血肿残留情况,调节 引流管方向和深度,将1万U尿激酶等混合液10--15ml 从引流管注入血肿腔,闭管,如无明显高颅压表现, 3-4h后开放引流,冲洗,每日1-2次,一般2d内血肿 可完全清除.如病人出现药物反应,则不予闭管,立即 收稿日期:2003—02—17:修回日期:2003—05—26 作者简介:谭翱(1967一),男,广西东兰人,河池市第一人民医院主治 医师.研究方向:颅脑损伤及脑血管疾病 开放. 2结果术后复查CT,按多田氏公式血肿计算法, 最大血肿清除率69.6%,92.1%,平均80.9%.3例发生 再出血.出院时随访,恢复良好2l例(37.5%),好转 25例(44.6%),重残6例(10.7%);死亡4例(7.1%), 均死于中枢性衰竭. 3讨论高血压脑出血发病后6~7h后血肿周围出 现水肿,脑组织坏死,且随时间延长加重.在此之后手 术,术后脑功能恢复差,后遗症重.6h内进行有效处 理,可以显着改善预后.我们认为床边锥颅双管引流 术是目前治疗高血压脑出血较为理想的方法之一. 双管引流术的优点:?设备简单,操作简便,局麻 下床边进行,易推广.?手术时间短,10-15min即可. ?钝头引流管对脑创伤小,避免了穿刺道出血,减少 了并发症,尤其适用于丘脑,基底节,幕下小血肿清 除.?双管或多管引流,使血肿腔内形成对流,避免颅 内积气,且引流管方向和深度可根据需要进行调节, 引流管内径大,利于血肿吸出.?适应证广泛,适用于 高龄重症脑出血病人早期减压.?减轻病人痛苦,节 省医疗费用. 术中注意:选择非重要功能区锥颅,锐器穿刺硬 脑膜.如果有新鲜出血,可经引流管注入凝血酶等药 物,必要时行开颅血肿清除.对血肿量多,中线偏移明 显,脑疝者,我们主张早期锥颅抽吸血肿,初步减压 后,仍尽早开颅行充分减压.本组l例幕上基底节出 血破人脑室(血肿量180ml,双侧瞳孔散大),1例小 脑出血(血肿量60m1),经锥颅置管引流术后,病人基 本生活自理.