血清游离前列腺特异抗原免疫放射诊断试剂盒研制报告

血清游离前列腺特异抗原免疫放射诊断试剂盒研制 血清游离前列腺特异抗原免疫放射诊断试 剂盒研制报告 中外医学研究2009年7月第7卷第7期CHlNESEANDF0REIGNMEDICALRESEARCH Ill?磐0誊..-I..-一?.0_l0-?:lllll..誊0.ll?.llI? 血清游离前列腺特异抗原免疫放射诊断 试剂盒研制报告 王高升谷泽亮 宝坻县人民医院(天津宝坻300O00)北京北方生物技术研究所 【摘要】研究的免疫放射诊断试剂盒采取二种单克隆抗体,分别用于包被和I的标记,与总的PsA所使用的单克隆抗体符合等克 分子的要求,具有灵敏度高,特异性强的优点,同时采用包被管分离技术便于操作和使用.结合对总的PsA的检测可以为前列腺良性 增生与恶性肿瘤的筛查和鉴别诊断提供参考.本法灵敏度为0.1nml,批内变异cV为6%,批间变异10%,曲线范围为0.5— 32nm1,参考值范围为当PSA>4nml时,FPSA/PsA<O.1为阳性. 【关键词】游离前列腺特异性抗原免疫放射诊断单克隆抗体 Research0fradj0immun0assayl'itf0rFPSAllSingcoatedtllbesystem.?GGn0一sk,Guze—Z彻g.1.epe叩Zep.ZQ厂 曰?n.曰?d3000o0,?2.ee叭,e60zce? 【Abstract】Todevelopmentaradioimmunoassay(RIA)f0rFPsAusingtw0kindsofmonoclonalantibod ies0fFPsAusedascoatingand 1abelingmateria1respeetively.Thesemonoclonalabtibodiesarehighsensitive,morespecif icityandcorrespondsivewiththeequimolar0fPSAS monoclina.Atthesametime,usingcoatedtubetechnique,theoperati0nofthekitisverysimpl e.Combingthetest0fPSA,FPSAkitcanplayan imp0rtantmletorec0nizethehyperplasia0fpmstateorprostatecancerTheassaysensitivityof thekitis0.1ng/ml_TheCV%withinassayis 6%,TheCV%be 【weenassayis10%.TheexpectedvaluesisthatwhenPSA>4nml,FPSA/PSA<0.1isn orrnal_ 【Keyw0rds】FPsAPmstaLecancerHyperplasia0fpmstate 1前言美国很多公司甚至大公司生产的各种PSA试剂盒不是等克分子 前列腺特异抗原(PmstateSpecmcAntigen,PsA)是分子量为的,目前在欧洲已被排除. 30kD的单链糖蛋白,被认为是一个有效的肿瘤标志,且是靶器官虽然PSA巳被成功地用作Pca早期诊断肿瘤标志(结合指 特异的,但它并不是肿瘤特异的.正常男性的PsA值低于4肛检查),以及评价治疗和特定治疗后的康复情况,但PsA的生 L,而在男性前列腺癌(Pca)和良性前列腺疾病间,PsA的浓度分物学方面仍有相当多是未知的,目前有研究表明,PsA可在女性 布有很大的重叠,特别在4—20L之间,这个范围因此也称为体内检出,并且可能与乳腺癌等肿瘤密切相关,因此高灵敏度 诊断灰色区域.为了提高PSA诊断前列腺癌的精确性,人们已TPSA/FPsA试剂的研制,对于探索PsA的生物学意义以及提高 经提出了多种解决,包括年龄参考范围,PsA密度,PsA生成其在临床价值方面还有很大的潜力. 速率,神经网络衍生的各项指标和PSA的分子形式等.目前看我所研制开发的FPsA免疫放射诊断试剂盒采取单克隆抗 来,在PsA的分子形式研究方面最有希望.体包被,标记,与TPsA所使用的单克隆抗体符合等克分子的要 在体外,PsA能与蛋白酶抑制剂结合成复合体,在血清中,大求,具有灵敏度高,特异性强的优点,同时采用包被管分离技术, 多数PsA(80%,90%)与蛋白酶抑制剂结合,而只有少量(10%便于操作和使用,结 合TPsA的检测可以为前列腺良性增生与恶 , 20%)以游离形式存在,血清中PSA分别与ACT和A2M形成性肿瘤的筛查及鉴别诊断提供参考. 复合物.良性前列腺增生(BPH)病人,Pca病人血清中FPsA的2研制所使用的材料 差别有统计学意义.有学者通过多因素实验模型推断FPSA是研究所使用的材料见表1. 诊断Pca的独立指标,并推荐25%FPsA是PCa和BPH的分界3包被工艺研究 点,即在TPSA为4—10L时,FPSA>25%提示该前列腺疾病开发研制过程中对比了不同包被缓冲液,不同包被管,不同 为良性,而不必参考病人年龄和前列腺的大小.游离PsA<25%包被温度及时间等因素对包被效果地影响. 者,则具高风险的Pca.这种25%上限可检测出95%Pca,而漏3.1使用5ml包被浓度比较不同包被缓冲液对包被效果的 诊的PCa病人多为年长者,且总的说来肿瘤的等级及大小都很少影响分别使用O.02MPBs(pH=7.4)/0.02Mc.B(pH=9.6)两 具有威胁.种缓冲液配制包被液,抗体包被浓度为5ml,2—8?包被18一 目前各种TPsA,FPSA的商用测试法结果出入较大,主要是24h.倒出包被液后加入封闭液(使用固相包被通用封闭液 因为抗体的特异性及对FPSA,PSA—AcT复合体形式的识别不O.O2MPBs:含15%蔗糖,5%乳糖,O.5%BsA,O.1%NaM,2—8? 同.因此目前国际上强调,在建立TPsA检测方法时,必须采用存放,有效期1年)15,30cC封闭2h,干燥密封保存.对比结果 与PsA—ACT和FPsA等克分子反应的单克隆抗体,多克隆抗体见表2. 不是等克分子的,应用时会出现测定值偏高,所以一般不能应用. 论着中外医学研究2O09年7月第7卷第7期CHINESEANDF0REIGNMEDICALRESEARCH 表1研究所使用材料的名称,产地,批号等分析 表2不同包被缓冲液对包被 效果的影响(rr0talcpm:26O000) 由表1可见,0.02MC.B(pH=9.6)包被效果好于0.02MPBs (pH=7.4),所以选定0.02Mc.B(pH=9.6)为包被缓冲液. 3.2使用5ml包被浓度比较不同包被管对包被效果的影响 分别使用国产六角星与进口(丹麦Nuck公司)六角星管保被, 抗体包被浓度为5ml,2,8?包被l8,24h.倒出包被液后加 入封闭液(使用固相包被通用封闭液)15—30?封闭2h,干燥密 封保存,对比结果见表3. 表3不同空白管对包被效果的 影响(T0tal.pm:260000) 结果表明,进口管与国产管包被效果无明显差别. 3.3使用5ml包被浓度比较不同包被温度,时间对包被效果 的影响选定了25?16h,24h,48h及4,8?16h,24h,48h不同 包被温度及时间做包被条件进行对比,抗体包被浓度为5ml, 2—8?包被l8,24h.倒出包被液后加入封闭液(使用固相包被 通用封闭液)15,30?封闭2小时,干燥密封保存.对比结果见 表4,表5. 一 2一 表425?不同包被时间对包被效果的 影响(Totalcpm:26000O) 表54—8?不同包被时间对包被 效果影响(T0talcpm:260000) 由表4,表5可见,4,8?与25?包被效果无明显区别,包被 时间16h时已达到饱和. 3.4包被平台的选择按前面选定的包被条件,对包被抗体的 实用浓度进行选择,以确定最佳包被浓度.不同浓度的结果差异 见表6. 表6不同包被浓度选择造成结果 差异比较(T0talcpm:25O000) 由表6可见,包被浓度为5ml时已达到饱和.所以现用 抗体选定5ml为使用浓度. 中外医学研究2009年7月第7卷第7期CHINESEANDF0REIGNMEDICALRESEARcH 弦多00.???00l1萋?.|.;..0?0_0...0萋? 3.5包被管稳定性考察将包被管分成两组,分别密封存放在果见表7.结果表明管子在室温存放条件下的稳定性良好. 4,8?及室温(15—30?),于15d,30d,60d时进行对比,实验结 表7管子稳定性考察结果 说明:标记物连续使用6Od. 4标准制备 4.1参比标准品DPC及佳科公司产品标准. 4.2稀释液配制方法50%新生牛血清+0.02MPBS(pH= 7.4)+0.1%pr0clin30O,SO为100%. 4.3标准范围确定将标准母液用DPc及佳科公司产品标准 进行校正定值后倍比配制成系列标准品,按上述加样方法加样后 实验检验,结果见表8.最终确定标准范围为0.3,15ng/m1. 4.4标准稳定性研究将标准分装后分别存放在4,8?,一 18?,37?,分别于3d,7d,12d时进行对比实验,结果见表9. 5标记工艺研究 5.1.标记工艺的确定按IgG抗体的通用标记工艺进行标记:标 记方法:氯氨一T氧化还原则采用偏重亚硫酸钠;投料:50g抗 体+Na圯I1mci+0.2MPBs(pH:7.4)50,100l. 氧化时间:1分20秒至1分40秒,还原时间1分至1分30 秒;sephadexG一50分离,使用前用淋洗液平衡;淋洗液为 0.02MPB,流速1滴/秒至1滴/2秒. 表8标准范围确定情况(Totalcpm250000 包被管批号:0l0825) 表9标准稳定性实验结果统计 结果表明标准在37?,7d时与低温保存的标准相比较无明显变化,12d时下降了27%. 测仪器本底后收集产品峰值2倍本底后开始收集产品;峰值 回落至本底3—4倍时结束产品收集,并继续淋洗至游离碘峰结束 并恢复至本底计数.将收集好的产品存于4?冰箱,有效期42d. 5.2标记物稀释液的配制配制方法:0.02MPBs(pH=7.4)+ 50%新生牛血清(NBs)+0.1%pr0c1in300+0.01%的食品红,每 50o毫升稀释液加1支庆大霉素,4?存放,有效期9od. 5.3标记物稳定性研究将标记物配制后分成两份,分别放置 在4—8qC,37?,分别于3d,5d,9d时进行对比实验,实验结果见 表10. 表10标记物稳定性实验结果 (rr0tal:265o00批号:01o9叭) 一 3一 论中外医学研究2O09年7月第7卷第7期CHINESEANDF0REIGNMEDICALRESEARCH .= 考?lll?-誊|||?薯孽净ll董llll??善lll譬|一誊||l拳.1?.??露ll誊?? 结果表明标记物稳定性良好. 6加样及反应条件的确定 根据产品特性,对比了不同加样及反应条件对检测结果的 影响. 6.1不同加样方法对检测结果的影响实验结果见表l1,反应 条件为37?2h.加样方法选定为100+1001. 6.2不同反应条件对检测结果的影响实验结果见表12.最终 选定为37?2h做为试剂盒的最终反应条件. 7'成品稳定性考察 , 将成品试剂盒分别于2,8qC,37oC存放,并对比其主要指标的 变化情况.对比结果见表13.成品在有效期内的稳定性良好. 表11不同加样方法对指标的影响 表12不同反应条件对指标的影响 8临床验证 检测了61份正常男性样品,24份正常女性样品,3份已确诊 为前列腺癌的病人样品,9份已确诊为前列腺良性增生的病人样 品,检测结果如表l4. 9主要技术指标 9.1灵敏度小于O.1nml. 9.2精密度批内cV<6%,批间cV<10%. 1O小结 血清游离PsA放射免疫诊断试剂盒的使用一般是与总PsA试剂盒配套进行,随着我国的经济发展及人们体检意识的提高, 此项指标越来越成为了一项常规的检测项目. 表13成品稳定性考察结果 表14总PsA结果分布情况 参考文献 [1]徐艳存.血清和性激素六项联合检测与前列腺良恶性疾病的 关系.标记免疫分析与临床,2o08,15(1):28,3O [2]王瑛,等.tPsA,sA,ePsA的临床分析.标记免疫分析.2008, l5(5):312,313 ———— [3]张阳,等.老年男性体检者血清PsA结果分析.标记免疫分 析.2009,16(2):49,50 【收稿日期】2009—05—23