植物乳杆菌ST_蛋白酶活性的研究

植物乳杆菌ST_蛋白酶活性的研究 植物乳杆菌 ST-?蛋白酶活性的研究 *陈帅,郭本恒,吴正钧,王荫榆 ,光明乳业股份有限公司技术中心,上海 200436, 摘 要,植物乳杆菌 ST-?,Lb. plantarum S T-III,是一株具有降低血清胆固醇能力的益生菌,其在脱脂 乳中生长缓慢,产酸能力弱。实验选取一株凝乳性较好的植物乳杆菌CZ 2112作为参照 ,对植物乳杆菌ST-?蛋白酶活性进行研究。植物乳杆菌 ST-?蛋白酶活性及蛋白水解能力比植物乳杆菌CZ 2112低, 而氨肽酶和羧肽酶活性与之差异较少,推测得出植物乳杆菌ST - III 在脱脂乳中不能很好生长和凝乳的 原因是该菌株蛋白酶活性较低,生长初期不能很好利用外源蛋白质营养。在添加鱼蛋白胨等促进生长 后,植物乳杆菌 ST-?可以将蛋白质、多肽水解成一系列的寡肽或氨基酸,满足菌体生长的氮素营养。 关键词,植物乳杆菌 ST-?,蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶 中图分类号,Q939.98 文献标识码,A 文章编号,1671-5187,2009,05-0224-04 Study on the Protease A ctivity of Lactobacillus plantarum ST-III *Chen Shuai, Guo Benheng, Wu Zhengjun, WangYi nyu ,Technology Center Bright of Dairy & Food Co., Ltd, Shanghai 200436, Chin a,Abstract: Lactobacillus plantarum ST- ?,a probiotics with ability to remove cho lesterol in vitro andin vivo, demonstrated weak bility a to grow in skim milk and to clot milk by acidification. To illustrate the impacts of the proteolytic activity Lb.of plantarum S T-? on the growth of itself, the extracellular protease and intracellular peptidase activity Lb. plantarum of S T-? were compared with Lb. plantarum CZ 2112, a strain growing ll wein skim milk supplemented with glucose and clotting milk proteins rapidly. Compared with Lb. plantarum CZ 2112, Lb. plantarum ST - ? had lower protease activity , whereas there was no obvious difference in the activity of aminopeptidase and carboxypeptidase activi) ties between the two Lactobacillus strains. Therefore, it was presumed that deficiency inproteaseactiv i) ty of Lb. plantarum S T-?, which was responsible for hydrolyzing large milk proteins int o small pep) tides when the bacteria were cultivated in skim milk, was correlated with the poor a bility of Lb. plan) tarum ST-? to grow in and clot milk. Key words: Lactobacillus plantarum ST- ?; protease,aminopeptidase; carb oxype ptidase 乳酸菌水解蛋白过程中蛋白酶 发挥了重要解菌株对蛋白的水解能 力与乳酸菌 生长关系是 的作用。一般文献认为,乳酸菌利用无机氮源合 非常重要的。最近几年一些学者对乳酸菌蛋白水 成氨基酸的能力非常弱,主要依赖于菌体的蛋白 解的复杂过程作了具体的研究。 酶水解外源蛋白,释放出大小不同的肽和游离的 蛋白水解酶可分为内肽酶, 肽链内切酶,和 [1-3] 氨基酸以满足自身生长的需要。与其它菌属的 端肽酶,肽链端解酶,两大类。蛋白酶即 内肽酶细菌相比,乳酸菌的蛋白水解能力是较低的。乳 ,endopeptidase,,水解蛋白质和多肽链内部的肽 酸菌蛋白酶一般分布在细胞的细胞 质和细胞 壁 键,形成各种多肽和寡肽。端肽酶又称为外肽酶 中,乳酸菌的胞外蛋白酶可限制性地水解乳中的 ,exopeptidase,,从肽 链 的 一 端 开 始 水 解 ,将 氨 基 蛋白质,将水解的多肽释放于培养基中,再经 肽 酸一个一个地从多肽链上切下来。外肽酶根据其 作用性质不同可分为氨肽酶、羧肽酶和二肽酶。酶进一步水解为氨基酸或更小的肽类。因此,了 氨肽酶从肽链的氨基末端开始水解肽链,羧肽酶 收稿日期,2009-03-31, 从肽链的羧基末端开始水解肽链,二肽酶的底物 作者简介,陈帅,男,硕士研究生,从事乳品开发方面研究 通, *为二肽,将二肽水解成单个氨基酸。蛋白质在内 讯作者,郭本恒, 解成蛋白目示、胨、多肽,最后完全分解成氨基酸。A至所需要的浓度,冰浴中超中,调整菌悬液的 600 植物乳杆菌 ST-?胞内蛋白酶活力水平可能 声波破碎菌体。冷冻离心,10000 r/mi n,10 min, 比较低,不能将脱脂乳中的酪蛋白和乳清蛋白水解 4 ?,, 收 集 上 清 夜 , 即 为 菌 体 无 细 胞 提 取 利用,从而限制了其在脱脂乳中生长。为了进一步 液 [5] 分析验证,将以本实验室筛选并保存的一株在脱脂 ,CFE,,-20 ?下储存备用。 乳中生长良好的植物乳杆菌CZ2112 为对照 ,研究 1.2.2.2 菌体无细胞提取液氨肽酶活力的测定 氨 肽酶活力的测定采用 LNA 法,首先加入 3 比较二者的蛋白水解能力和蛋白酶、肽酶的活性。 mL 的 Tris-HCl 缓冲液和 L-亮氨酸-对硝基苯胺 ,100 μL 2.5 mmol/L,,然后加入 100 μL 的无细胞 1 材料与方法 [7]提取液,放置 5 min 后,于 405 nm比色测 定酶活。 1.1 材料与设备 酶活力定义,37 ?,每分钟分解 L-亮氨酸-植物乳杆菌 ST?,光明乳业技术中心实验 - 对硝基苯胺产生 1 μmol 的对硝基苯胺所需酶量 室保藏,植物乳杆菌 CZ2112,江南大学食品学院 即为一个酶活单位。酶活公式,酶活,U/mL,=,k× 微生物实验室保藏。邻苯二甲醛 ,OPA,,L-亮氨 w,,/ v×T,。其中 K 为酶液稀释倍数,W为生 成的酸-对硝基苯胺,Sigma 公司,其它试剂均为国产 对硝基苯胺量,μmol,,V 为反应酶液体积,mL,, ,分析纯,。 T 为反应时间,min,。厌氧培养箱,Ruskin Technology公司, 高速 1.2.3 羧肽酶活力的测定冷冻离心机,Beckman Coulter公司 ,超净工作台, 1.2.3.1菌体无细 胞提取液的制备 Labconco公 司,紫外分光光度计 UV754,美国- 同 1.2.2.1。 Lab Tech公司 。 1.2.3.2菌体无细 胞提取液羧肽酶活力的测定 羧肽 1.2 实验方法 酶是一种可以从肽链羧基端降解多肽的 1.2.1 乳酸菌蛋白酶活力的测定 外肽酶,在适宜的条件下,从肽链的羧基端水解蛋 1.2.1.1 蛋白酶粗酶液的制备 白质或多肽,释放出游离的氨基酸。此次试验应用将待测菌株接入 MRS液 体培养基中,37 ? Cbz-Gly-Tyr 作为底物与 100 μL 的无细胞提取液 培养 24 h,连续转接活化两代,以1 %,/v/v,接种 [7]反应释放出 Tyr,其在 A340有 强烈的吸收。 量接入三角瓶中进行增殖培养,将不同菌龄的菌 酶活力定义,37 ?,每分钟分解 Cbz-Gly-Tyr体培养液取出,离心,5316 r/mi n,15 min,4 ?,收 产生 1 μmol 的 Tyr 所需酶量即为一个酶活单位。集菌体。菌体用 pH 7.0,50 mmol/L的磷酸 缓冲液 酶活公式,酶活,U/mL,=,k×w,,/ v×T,,其中 K 为 洗涤,调整菌悬液的 A至所需要的浓度。37 ? 600 酶液稀释倍数,W为生成的 Tyr 量,μmol,,V 为反 培养 2 h,离心,8235 r/min,10 min,4 ?,后收集 [4]应酶液体积,mL,,T为 反应时间,min,。 上清夜。上清液待测蛋白酶活。 1.2.4 乳酸菌乳蛋白水解活性的测定 将活化的乳 1.2.1.2 蛋白酶活 性的测定 酸菌以 1%,v/v,的接种量接种于 取 50 μL 浓 度 为 1 %,w/v, 牛 血 清 蛋 白 12%的脱脂乳中,37 ? 下培养 24 h,采用未接种 ,BSA,,酶液 450 μL,与浓度为 0.1 mol/L,pH 7.0 乳酸菌的 10 %,v/v,的脱脂乳作为空白。准确吸取 的 1.5 mL 乙酸钠缓冲液混合,在 37 ?下保温 5 2.5 mL 样品,加入试管中,加入0. 5 mL 重蒸馏水混min。以 0.5 mL 浓度为 10 %的三氯乙酸终止反 [5] 匀,加入 0.5 mL 浓度为 0.75 mol/L 的三氯乙酸 应,在 280 nm 处测定吸光值。 ,TCA,,经旋涡混合仪混 匀 , 于 室 温 下 静 置 10 空白对照管,以蒸馏水代替酶液如上同样条 min,3000 r/min下离心 5 min,取上清液备用。取 件操作。 上清液 1 mL 加入试管中,加入 3 mL 的 OPA试 酶活力定义,37 ?,每分钟分解牛血清蛋白 剂混匀,室温下反应 2 min 后于 340 nm 处测定吸 产生 1 μmol 的色氨酸所需酶量即为一个酶活单 光度。对应曲线得出蛋白水解活性相当于酪氨 位。酶活公式,酶活,U/mL,=,k×w,,/ v×T,,其中 K 酸的量,A作为 OPA指数也可 直接用于比较。 340 为酶液稀释倍数,W 为生成的色氨酸量μ,mol,,V 邻 苯 二 甲 醛 ,OPA, 的 配 制 采 用 改 进 的 为反应酶液体积,mL,,T 为反应时间,min,。[9,10] Church等方法 ,现配现用,避光保存。 1.2.2 氨肽酶活力的测定 酶活力定义,37 ?,每分钟分解牛奶蛋白产 1.2.2.1 菌体无细胞提取液的制备 生 1 微摩尔的酪氨酸所需 酶量即为一 个酶活单 菌体收集同 1.2.1.2。菌体收集后重悬于PBS 位。酶活公式,酶活,U/mL,=,k×W,,/ v×T,,其中 K 为酶液稀释倍数,W 为生成的酪氨酸量μ,mol,,VST?和 CZ 2112如图 2 所示,植物乳杆菌 - 为反应酶液体积,mL,,T 为反应时间,min,。氨肽酶的活性随生长时间的 延长都具 有大致相 同的增长趋势。总的来说,氨肽酶的活性在这两 个细胞中的变化情况大致相同。 2 结果与讨论 2.3 植物乳杆菌 ST?与 CZ 2112羧肽酶活 力 -2.1 植物乳杆菌 ST-?与 CZ 2112蛋白酶活 性 的比较 比较 羧肽酶是一种可以从肽链 C 端水解多肽,产 植物乳杆菌 CZ2112是本 实验室筛选并保存 生游离氨基酸的外肽酶。常用的有 A、B、C 及 Y 4的一株植物乳杆菌,在脱脂乳中生长良好,添加 种来自动物胰脏,C来自 柑橘叶,种羧肽酶,前 2 葡萄糖后能很快凝乳,。由于植物乳杆菌 ST-?在 Y 存在于酵母细胞中。使用最广泛并研究最多的 脱脂乳中不能生长,因此用 MRS培养基 分别培养 是羧肽酶 A 和 B。ST-?和 CZ2112,测定比较二者的蛋白酶活性, 如图 3 所示,以氨基端 被保护的合 成二肽结果如图 1 所示。 Cbz-Gly-Tyr 为底物时,测得羧肽酶活力随着时 间增加,菌株生长呈上升趋势。两株菌的羧肽酶 ,1 -L 活力的变化情况基本相同。m ? U/ , 性 活 酶 ,1 - 白 L m蛋 ? U / , 活 酶 酶 肽 羧 图 1 在 MRS 培养基中的植物乳杆菌ST-?和 CZ 2112 总蛋白酶活性的对照 从图 1 可以看出,植物乳杆菌 ST-?和 CZ 时间/h 2112蛋白酶活 差异较大。CZ2112 蛋白酶在培养 图 3 在 MRS 培养基中的植物乳杆菌ST-? 和 CZ 2112 初始就显示出较强的酶活,且随着时间的延长蛋 羧肽酶活性的对照 白酶的活性增强,这可能是由于蛋白酶不断积累 [11-13]2112在脱脂乳中蛋白水解 2.4 植物乳杆菌 CZ 的结果。而植物乳杆菌 ST-?的蛋白酶活性与 能力的验证 CZ 2112相比相对 弱得多。 通过以上试验可以发现,与植物乳杆菌CZ 2.2 植物乳杆菌 ST?与 CZ 2112氨肽酶活 力 - 2112相 比,ST-?的蛋白酶活性较低,而氨肽酶、 的比较 羧肽酶活性差别不大。进一步将植物乳杆菌CZ 虽然蛋白酶是生物体的能够获得蛋白质机制 2112接 种到脱脂乳中培养,用 OPA 法测定生长 的重要部分,但是生物体的肽酶亦同样重要,它能 过程中脱脂乳中游离氨基末端的含量,进而可以 够将变性的、有缺陷的蛋白质转变,能够激活酶原。 反映乳中低分子片段多肽的含量情况。 氨肽酶是一种外肽酶,可以从 N端水 解。 OPA法是 一种迅速、敏感、方便、简单的应用 在牛奶或缓冲溶液中测定牛奶蛋白水解的方法。 1, - L 通过与邻苯二甲 醛和 β巯基乙 醇的水解 反应,- m ? Uα-氨基酸组被释放出来,并形成一种在 340 nm / ,活 酶 有强吸收的混合物。对所有的 α-氨基酸组混合物 酶 肽 氨 的吸收率都是相似的。而且,对于含有 α和 ε氨 -- 基酸组的蛋白质吸收率都是相似的。此外,当蛋 白质在十二烷基硫酸钠中被降解时,不受当时环 时间/h 境的影响。因此,对每个样品背景都是固定不变 图 2 在 MRS 培养基中的植物乳杆菌ST? 和 CZ2112- 的。并且,通过蛋白水解释放出来的α 氨基酸组- 提供了一种方便的方法来终止蛋白质的水解,并ST-?和 CZ 2112菌株 二者蛋白酶、肽酶酶活的 且确保所有氨基酸的释放和氨基 酸的全部反 应差异。结果表明,与植物乳杆菌CZ 2112相比 ,[13]。由图 4 可以看出,A与酪氨酸的含量呈线性 ST-?的蛋白酶活性较低,而氨肽酶、羧肽酶活性 340 关系,以酪氨酸含量,μg/mL,为横坐标,A为纵 差别不大。植物乳杆菌 CZ 2112在脱 脂乳中生长 340 坐 标 , 通 过 线 性 拟 合 得 到 回 归 方 程 为 y =能够水解牛乳中蛋白,使得游离氨基末端的含量 2增加。从另一个侧面也能说明植物乳杆菌S T-? 0.00178+x0.002,4R=0.999,7。据此标准曲线可以 在脱脂乳中不能生长可能 是由于其 蛋白酶活较 方便地计算出基于此原理的蛋白质水解程度。参 低或不太适合水解牛乳蛋白所致。考 Church的邻苯 二甲醛,OPA,方法绘制酪氨酸 标准曲线。 参考文献 [ 1 ] Pollock M R. Exoenzymes In I. C. Gunsalus and R. Y. Stanier [J]. The Bacteria, 1962 , 4: 121-178. [ 2 ] Cowman R A, Swaisgood H E. Proteinase enzyme system of lactic streptococci II Role of membrane proteinasin e c ellu) 2 lar function [J]. Bacteriol, 1 967, 94: 942-948. [ 3 ] 赵建.肽酶高产菌株的筛选及其生物学特性研究[J]. 乳业 科 学与技术,2007,69-72. [ 4 ] E. 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Appl Environ Microbiol, 2000, 66: 3898-3904. 由图 5 可以看出,植物乳杆菌 CZ2112在 生 [10] Frank C.church, Harold E.swaisgood. Spectrophotometric as) say using o-Phthaldi aldahyde for determination of proteol)y 长过程中,伴随着时间的延长乳中游离氨基末端 sis in milk and isolated milk proteins [J]. Dairy Sci., 198 2, 含量迅速增加,说明 CZ 2112的 蛋白酶系能够水 66: 1219-1227. 解牛乳中酪蛋白、乳清蛋白等,产生更多分 子较 [11] Fuller R. Probiotics in man and animals [J]. Appl. Bacteri) 小的多肽、寡肽,并由此满足菌体生长的氮 源需 ol, 1989, 66: 365-378. [12] Barry A. Law and Jens Kolstan, Proteolytic systems in 要。而植物乳杆菌 ST-?由于其在乳中不能生长, lactic acid bacteria [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 198 3, 所以 OPA指数 几乎没有变化,大分子的乳蛋白不 49: 225-245. 能为 ST-?菌株所利用。 [13] M. Kojic, D. Fira. Characterization of the cell wall -bound proteinaseof Lactobacillus CaseinHN14 [J]. Appl Environ Microbiol, 1991, 6: 1753-1757. 3 结论 [14] Lilly D M. Probiotics: Growth promoting factors produced by 本实验以一株能在牛乳中生长 良好的植物 microorganisms [J]. Sci1965,., 147:747-748. 乳杆菌 CZ 2112为 对照,分析比较了植物乳杆菌