1.1植物根系酸性磷酸酶活性测定

1.1植物根系酸性磷酸酶活性测定 植物根系酸性磷酸酶活性测定 1.原理 该方法以对硝基苯磷酸二钠(即p-NPP)为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚(即p-NP)，该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的 -1-1-1对硝基苯酚(p-NP)的量来示(μg?h?g鲜根或μg?h/株)。 2.测定方法 1)称取(1.2?0.1)g鲜根，加入8 mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.8)，然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。 2)取上清液1mL于15mL离心管中，加入2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠(醋酸钠缓冲液配制)，摇匀后加盖，于37?水浴30min。 3)水浴后加入2mL 0.5mol/L CaCl及2mL 2mol/L NaOH以终止反应，摇匀。 2 4)2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。 5)取上清液在410nm波长比色，并吸光值A。 410 3.标准曲线的制作 1)取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表1加入试剂。 表1对硝基苯酚标准曲线配制表 离心管号 0 1 2 3 4 5 6 0.005μmol/mL pNP0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 (mL) HO(mL) 0.8 0.79 0.78 0.77 0.76 0.75 0.74 2 pNP含量(μmol) 0 0.00005 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025 0.0003 离心管号 7 8 9 10 11 12 0.005μmol/mL pNP0.07 0.08 0.09 0.10 0.11 0.12 (mL) HO(mL) 0.73 0.72 0.71 0.70 0.69 0.68 2 pNP含量(μmol) 0.00035 0.0004 0.00045 0.0005 0.00055 0.0006 摇 匀 0.2mol/L pH6.5醋酸钠缓冲液 8 0.5mol/L CaCl(mL) 2 2 2mol/L NaOH(mL) 2 2)混匀后，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A。 410 3)以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量。 n(,mol),a，b，A410 4.计算方法 根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对 -1-1-1硝基苯酚(p-NP)的量来表示(μg?h?g鲜根或μg?h/株)。 ,1,1即 根系酸性磷酸酶活性(,g,h,g鲜根),n，M，稀释倍数(/W，t)式中: n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度(μmol); M—对硝基苯酚的相对分子质量(139.11g/mol); t —反应时间(h); W—样品鲜重(g)。 稀释倍数—8 a.醋酸盐缓冲液(pH=5.0) A:0.2mol/L 醋酸溶液(11.5mL，稀释至1000mL) B:0.2mol/L 醋酸钠溶液(16.4g CHONa 或27.2g CHONa?3HO 定容至1000mL) 2322322 14.8ml A + 35.2ml B混合即得