精卵识别的分子机制与受精过程

精卵识别的分子机制和受精过程 樊国达 （生命科学学院，河北大学，保定 071002） 摘要  哺乳动物精卵识别以及受精过程是一系列有序而复杂的过程，包括精子的获能，精子识别卵子的透明带；与透明带结合后发生顶体反应，完成顶体反应后的精子与卵子的质膜融合，融合后精子对卵子的激活，卵子对精子的激活，雄原核和雌原核的融合。 关键词  获能；顶体反应；质膜融合；受精 The molecular mechanisms of sperm-egg recognition and fertilization process Fan guoda (College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China) Abstract Mammalian sperm-egg recognition and fertilization process is a series of orderly and complex process, including sperm capacitation, sperm identify zona pellucida; acrosome reaction after Combined with zona pellucida, the fusion of plasma membrane of egg and sperm after completion of acrosome reaction, the activation of sperm to egg after the fusion, the activation of eggs to sperm, and the fusion of male pronucleus and female pronucleus. Key words  sperm capacitation; acrosome reaction; he fusion of plasma membrane; fertilization 哺乳动物精卵识别以及受精过程是一系列有序而复杂的过程，首先精子必须获能，使自身超活化，超活化后的精子能识别卵子的透明带，而且这种识别具有特异性，主要是一些糖蛋白的相互结合，与透明带结合后发生顶体反应，完成顶体反应后的精子与卵子通过一些膜上的蛋白物质进行质膜融合，融合后精子对卵子的激活，并且伴随着预防多精受精，卵子对精子的激活主要体现在对精核的重编程，最后雄原核和雌原核进行融合形成合子，完成受精。 1 精子的获能 在精子获能过程中，钙离子起重要作用。精子超激活运动就与鞭毛区 Ca 2+ 浓度升高有关。而在小鼠精子的鞭毛区发现了一种重要的钙离子通道，即Catsper通道。通过膜片钳技术发现Catsper通道在调控Ca 2+的内流中起重要作用。在后来的研究中发现，Catsper通道的激活依赖于精子内部的pH 值。当pH值变大，精子内部呈碱性时，可以激活Catsper通道。在人类精子中，通过全细胞膜片钳技术发现，Ca 2+内流主要通过鞭毛区的Catsper通道，而鞭毛区的Hv1通道的激活可以使精子内部H+浓度降低，从而使pH升高，进一步激活Catsper通道。Hv1通道的激活则与精子外环境有关，如外环境的碱性，或外部的Zn2+（精液中的Zn2+可以阻断Hv1通道，预防未成熟的精子提前活化）的去除，以及精子膜电位的去极化，这些都可以激活Hv1通道。而在小鼠精子中，内部碱性环境主要通过Na+依赖性的cl-/HCO3-交换器和Na+/H+交换器。这两个交换器都有膜电位的去极化激活[1]。 将精子内环境和外环境分隔开的精子质膜，被认为是获能的起始点。在一些早期研究中发现获能伴随着精子质膜成分的改变。去获能因子的作用是防止精子过早发生获能，存在于精浆中包被在精子表面，当精子在获能过程中时被自动移去。常见的去获能因子有牛精浆蛋白，如BSPs(bovine seminal plasma proteins)、gly-codelin-S等。PDC-109是牛精浆蛋白的一种， 它能与精子质膜的磷脂胆碱结合，通过阻止脂类自由移动，从而起到稳定精子质膜的作用，当精子通过输卵管时还能将精子绑定在输卵管上皮细胞上，延长精子的生存力。发生获能时 PDC-109 会连同质膜上的胆固醇一起被移去，从而诱发获能。在人类精液中的Zn2+也是一种去获能因子，它会被子宫和输卵管的上皮细胞吸收，从而使精子表面的质子交换器（Hv1）活化。 胆固醇外流在精子获能中起重要作用。在一些体外受精实验中，介质中血清白蛋白(通常使用小牛血清白蛋白，BSA)是非常重要的成分，BSA可以与胆固醇结合，在一定程度上起到诱导胆固醇外流的作用。胆固醇外流可以改变质膜结构，使得质膜通透性和流动性增加，导致质膜中一些转运体(例如NBC(H+ /HCO3 - )转运体)和离子通道(例如Ca 2+通道CatSper) 激活，促使精子获能中需要的信号调节因子进入 cAMP-PKA 信号通路传递状态，最终参与精子获能。2010年，Botto等[2]发现β-环状糊精(β-CD)能代替BSA引起精子质膜上胆固醇外流，并通过cAMP-PKA信号通路增加蛋白酪氨酸磷酸化，促进精子获能，且效果比BSA好。 2 精子与卵透明带的相互作用及分子机制 卵透明带是卵外的一道物理屏障，在精卵识别和结合中起重要作用。卵透明带是伴随着卵子的发生而形成的。透明带中有ZP1，ZP2，ZP3三种糖蛋白，三者比例是1：2：2，分子间以二硫键连接，构成网络：ZP2和ZP3交互排列成锁状的异构二聚体，ZP1在其二维结构上交叉连接，三者之间形成一种三维网状结构ZP3是第一精子受体，能与顶体完整的精子结合，并诱发顶体反应，使精子失去头部质膜，暴露顶体膜[3]，段崇文利用ZP3探针进行原位杂交，发现ZP3由卵母细胞或卵泡细胞分泌，从而形成卵透明带。他们还发现ZP3蛋白合成的两个时期，在卵母细胞最初的生长期合成大量的ZP3蛋白，在生长后期合成量减少，而卵丘细胞开始大量合成ZP3蛋白，通过这两个时期形成卵透明带[4]。对于精子表面的ZP3受体识别分子的研究，研究人员用交叉连接和亲和层析的方法在小鼠精子质膜上分离出了sp56蛋白。它是一种外周膜蛋白，在精子顶体边缘呈三个月状分布，定位在精子顶体上端的质膜上，是ZP3的结合部位位点。经研究表明，sp56参与了ZP3识别，并与ZP3的O-连接寡糖链特异性结合。赵明，孙册等研究人员在猪的精卵识别中发现了不同的机制，他们发现精子质膜上的蛋白与ZP3的结合需要凝集素的介导[5]。还有一种识别机制是距离识别，如海胆卵胶中存在一种精子激活肽Resact，能与精子上的受体结合，增加 ATPase 活性，进而加强精子尾部摆动，促使精子定向朝卵母细胞游动[6]。精子暴露顶体膜后，顶体膜与ZP2通过精子蛋白酶相互作用，以维持精子与卵的结合，而且只有与ZP2结合的已发生顶体反应的精子才能穿过透明带，即ZP2为第二精子受体，而ZP1只起连接作用。 3 精子与卵膜的相互作用及分子机制 3.1 去整合素(ADAM)和整合素结合方式 精子和卵子质膜融合的位置开始于精子赤道段。在精子精子表面的去整合素和卵膜上的整合素的相互作用。 精子表面具有去整合素金属蛋白酶 (ADAM) 家族成员，目前已发现39种，它们都具有去整合素结构域和一个富含半胱氨酸结构域。而且近一半的ADAM家族成员是睾丸特异性或高表达的，可能参与精子的发生和功能的形成，所以ADAM分子被认为参与了精卵质膜的融合。其中ADAM1、ADAM2和ADAM3是研究最广的分子[7]。ADAM1和ADAM2形成异二聚体，分布于睾丸精子整个头部质膜,在附睾转运过程中, ADAM1的去整合素蛋白肽段在加工时大部分被水解，所以成熟的ADAM1可能不能与卵细胞膜上的受体整合素结合。最近用红外二向色性法测得的实验数据提示ADAM1可能作为激发精卵融合的中间体来起作用。ADAM2在附睾中成熟的过程中保留了去整合素结构域、富含半胱氨酸结构域。光亲和标记的去整合素结构域保守序列Asp-Glu-Cys-Asp(DECD)多肽能够抑制精卵融合，并且这种光标记存在于整个卵子表面,提示去整合素结构域能够与卵膜结合[8]。 由于精子表面 ADAM 分子有去整合素结构域，有些研究者认为卵子表面的整合素作为去整合素的受体在精卵质膜融合中起重要作用。已发现由18种α亚基和8种β亚基组成了24种不同的整合素蛋白，比如在小鼠卵质膜上微绒毛区域发现了整合素蛋白α6β1，卵子表面整合素α6的抗体能抑制体外精卵质膜融合[9]。ADAM3是一种精子顶体膜蛋白，定位于顶体内膜和赤道区域。ADAM3单抗可显著降低体外的精卵结合和融合能力。有证据显示，ADAM3的去整合素结构域参与了精卵相互作用。在IVF条件下，应用其去整合素结构域的合成多肽或单抗可明显抑制精-卵的结合和融合[10]。 但是后来的一系列实验发现推翻了之前的假设，这些实验主要采用了基因敲除的方法，缺失ADAM2或ADAM3基因的小鼠精子能与卵子正常结合并融合，这说明ADAM2或ADAM3 分子在精卵质膜结合融合方面并非必需[11]。 研究人员还发现了卵子质膜上一种四次跨膜蛋白（TM4）CD9也参与精卵的质膜融合，排出了CD9通过整合素结构与ADAM的结合方式后，有些研究人员提出一种新的假设，妊娠特异性糖蛋白（PSG）家族成员PSG17是CD9的配体[13]。重组蛋白试验表明，PSG17 直接与CD9的胞外大环（EC2）结合，确定了PSG17 是CD9的受体。卵子表面的CD9以反式作用与精子表面的PSG17相关配体相结合参与精卵质膜的融合。 3.2富含半胱氨酸的Crisp家族蛋白DE Crisp是一个进化上非常保守的蛋白质家族，其主要特征是Crisp家族蛋白C末端均富含半胱氨酸。例如DE蛋白，在小鼠和大鼠体内都发现有该蛋白的存在。精子沿附睾管腔成熟的过程中，DE分子逐渐附着于精子表面。 间接免疫荧光标记显示，DE 蛋白定位于大鼠精子顶体区的背部，体外获能5 h后, 51％的精子DE蛋白聚集于赤道板区。如果获能液缺乏Ca 2+ ，DE的分布不发生变化，而离子载体A23187诱发顶体反应后， DE 蛋白分布发生变化的精子比例增大。大鼠体内实验也显示精子在穿过卵子透明带后DE 蛋白存在同样的分布。DE 蛋白与精子的亲和力并不均一，大部分在获能过程中从精子释放，余下的黏附紧密的 DE 迁移到赤道板区。体外实验中，抗 DE 多克隆抗体对精子活动力以及精子和去透明带卵子结合没有明显作用，但显著抑制精卵质膜的融合[12]。 3.3 免疫球蛋白超家族成员Izumo Izumo是第一个被证实与精卵质膜融合有关的关键精子蛋白，氨基酸序列表明它属于免疫球蛋白超家族成员，属I型膜蛋白, 在细胞外免疫球蛋白结构域存在一个可能的糖基化位点。在完整精子上, Izumo不能被抗体到，而在已发生顶体反应的精子头部呈阳性反应，提示 Izumo 可能存在于顶体内膜，在顶体反应后暴露。用同源重组法建立的Izumo基因缺失小鼠，证实了Izumo在精卵质膜融合中的关键作用。Izumo -/- 雌鼠表观正常，精子能正常结合卵子透明带和发生顶体反应，但卵子无一受精，穿过透明带的精子全部聚集在卵周间隙。说明Izumo不会影响精卵识别，但会影响精卵质膜融合[14]。 3.4 阻止多精受精的溶菌酶样蛋白1（SLLP1） 在小鼠和人精子顶体中发现了溶菌酶样蛋白1（SLLP1），用重组小鼠SLLP1(mSLLP1)和抗mSLLP1的抗体处理卵母细胞都能显著地抑制精卵结合，该蛋白具有N-乙酰葡糖胺结合残基推测mSLLP1 可以结合到透明质酸或在卵黄周隙中的相关分子上，并且向卵膜发出精子已经进入卵黄周隙的信号，然后触发精子与卵细胞膜的融合。因为mSLLP1结合位点在受精过程之后消失，所以推测SLLP1可能阻止多精入卵[15]。 4 精子和卵子的相互激活 在受精之前,哺乳动物的成熟卵子阻滞于第二次减数分裂中期（MⅡ）期。通过一系列生理变化解除阻滞，这个过程称为卵子的激活。这些生理变化包括钙振荡的发生、皮质颗粒的释放和第二极体的释放等。 4.1 钙离子振荡 其中，钙振荡的发生是卵子激活的一个重要的生理变化。在哺乳动物中,由于内质网通过I型1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)受体释放钙离子[16]，使得受精过程中卵内钙离子浓度升高，而内质网中钙离子浓度下降，这时会内质网膜上的STIM1作为钙离子感受器检测到内质网钙库排空后，会从内质网膜上脱落聚集到质膜上，从而引起Orai1在质膜上聚集，进而激活SOC通道引起胞外钙离子内流，进一步诱发胞内钙离子回流到内质网中，为下一次钙离子释放做准备，从而引起钙离子振荡。如图1[23]。 图1精子抽提物诱发的卵子钙振荡图 Figure 1 sperm extract induced calcium oscillation of egg 而三磷酸肌醇的产生依赖于精卵膜融合后精子带来的磷脂酶Cζ，它不会分解膜上的脂酰肌醇4，5-二磷酸，而直接作用于卵质中的一种含有脂酰肌醇4，5-二磷酸的囊泡。从而产生1，4，5-三磷酸肌醇。进一步激发内质网中钙离子的释放。 4.2 第二极体的排出 卵子在激活前停滞于第二次减数分裂中期，而要进入后期则依赖于卵细胞成熟促进因子(MPF)的失活。在钙振荡的每次钙离子峰值时，钙离子与钙调蛋白结合，激活钙调蛋白激酶II，细胞生长抑制因子（CSF）会保持成熟促进因子的活性使卵细胞停滞于第二次减数分裂中期，而钙调蛋白激酶II使细胞生长抑制因子失活，使周期蛋白B被降解，成熟促进因子失活，从而使卵细胞进入后期，成功排出第二极体[17]。 4.3 皮质反应 皮质反应主要的作用是防止发生多精受精，阻断多精受精的方式分两步，第一步是快阻断，当精卵质膜融合后1-3s，卵膜发生去极化，使其他精子无法融合。第二步是慢阻断，在海胆卵膜下存在大量皮质颗粒，内含透明素、蛋白酶、过氧化物酶和粘多糖类。在精卵质膜融合处，皮质颗粒破裂并扩散至卵质膜和卵黄膜之间的区域，在该区域形成受精膜进一步阻断多精受精。 研究发现，磷脂肌醇信号通路在皮质反应中起重要作用，主要通过该通路的两种产物二酰基甘油（DAG）和三磷酸肌醇。前者可以激活卵细胞质膜上的蛋白激酶C，蛋白激酶C可以诱导皮质颗粒释放。另一方面，三磷酸肌醇引发的钙离子升高，也可以诱发皮质颗粒的释放，关于钙离子的作用机制有两种说法，一种是钙离子通过与钙调蛋白结合激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶类，该类激酶直接作用于皮质颗粒，诱导皮质颗粒的释放；还有一种说法是，通过钙调蛋白依赖性激酶激活蛋白激酶C，从而诱导皮质颗粒的释放[18]。 4.4 雌雄原核的形成及融合 在精卵质膜融合后，开始形成雄原核和雌原核。哺乳动物的精核在受精前，组蛋白被鱼精蛋白（精蛋白）取代，精核呈现高度致密化，可以抵御各种物理和化学损伤。所以，在受精后首先发生的是精核的去致密过程，成熟的第二次减数分裂中期的卵母细胞使精核去致密的能力最强，因为此时还原型谷胱甘肽（GSH）的含量达到最大，还原型谷胱甘肽参与精核的去致密，它将鱼精蛋白的二硫键还原成巯基，本身被氧化（GSSG），卵细胞中的依赖NADP的谷胱甘肽还原酶使GSSG被还原，从而不断地打开二硫键，当二硫键打开到一定数量时，卵细胞中的精核去致密因子才会移动到精核染色质周围，进而实现组蛋白替换。 精卵质膜融合后，还有一个重要事件是DNA的复制，除了海胆的DNA复制发生在雄原核和雌原核融合之后，哺乳动物的DNA复制发生在雄原核和雌原核相互靠近过程中。质膜融合前，卵子DNA聚合酶均与分布于卵质中，质膜融合后卵子DNA聚合酶开始向核区移动。海胆精子不含DNA聚合酶，故DNA复制依赖于卵子中的DNA聚合酶，而哺乳动物精子中线粒体中含有DNA聚合酶，故不依赖卵子中的DNA聚合酶。卵子在完成自身雌原核形成后，卵子便失去使精核去致密的能力。所以从卵子激活到雌原核形成的时期是精核去致密化的时段。 另外与原核形成密切相关的另一个因素是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK），在第二极体形成释放和核去致密过程中，MAPK活性较高，可能参与核膜的降解。所以在原核形成中，即核膜重建时，MAPK的活性最低甚至消失。MAPK的活性只有在MPF被完全激活后，通过mos基因的表达，才能被活化[19]。 雄原核和雌原核形成后，二者开始融合。在斑马鱼中，雄原核和雌原核向动物极和植物极的中轴线移动，并在此处进行融合。雌雄原核完全融合，来自父本和母本的染色体融合形成一个具有双倍染色体的合子[20]。太平洋牡蛎的受精过程中, 雌、 雄原核沿一定的路线移动到卵子中央, 各自形成独立的染色体 , 两组染色体相互靠拢 , 以染色体联合的方式结合在一起[21]。而在栉孔扇贝的受精过程中,雌、雄原核是弥散的,原核融合后才形成致密的染色质,其两性原核是以染色质相互融合的方式结合为合子[22]。对于雌雄原核的运动路径可能与卵子中的纺锤体有关，因为在卵子激活过程中，纺锤体参与了染色体的分离和第二极体的排出，之后解体的微管蛋白是否会在雌雄原核移动中起作用还有待研究。 参考文献 (references) [1] Polina V. 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