六月雪水提取物对乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞的保护作用.doc

六月雪水提取物对乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞的保护作用.doc 六月雪水提取物对乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞的保 护作用 摘要:前期研究发现六月雪[Serissa serissoides (DC.) Druce]对乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤有良好的保护作用，因此进一步在细胞水平上探讨六月雪水提取物对乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞的保护作用。采用体外细胞培养人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞，将GES-1细胞用0,10%的乙醇孵育4,6 h，建立胃黏膜损伤模型。将参试GES-1细胞分为正常组、模型组、荆花胃康胶丸组、六月雪水提取物剂量组，正常组不做任何处理培养24 h，其他组加入一定浓度的乙醇处理一段时间后，加入含荆花胃康胶丸、六月雪水提取物各浓度剂量的培养基，正常组、模型组不加入药物，继续培养24 h，利用MTT各组GES-1细胞的活性。将MTT筛选后效果最佳的六月雪3个浓度以及荆花胃康胶丸组1个浓度分别定为高、中、低剂量组和阳性药物组，运用吖啶橙荧光染色法检测各组细胞凋亡情况，采用Western-Blot 法检测各试验组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白的达情况。结果表明，5%的乙醇孵育GES-1细胞4 h是造成胃黏膜损伤的最佳细胞模型，对GES-1细胞的抑制率达到40%。六月雪水提取物组中，60、70、80 μg/mL 3个浓度效果最佳，与该组其他浓度比较差异显著(P<0.05);荆花胃康胶丸组中，在浓度为160 μg/mL 时细胞增殖最明显;均高于其他浓度的荆花胃康胶丸组;吖啶橙染色后显微镜下观察正常GES-1细胞形态均一、生长良好，而模型组大量细胞明显出现衰老或凋亡，荆花胃康胶丸组、六月雪水提取物组GES-1细胞生长情况明显好于模型组; 模型组bFGF的蛋白表达水平明显高于正常组，差异显著(P<0.05);与模 型组比较，六月雪水提取物组的bFGF蛋白表达水平明显增加，差异极显 著(P<0.01);六月雪水提取物组与荆花胃康胶丸组比较，bFGF的表达水 平差异也达极显著水平(P<0.01)。 说明六月雪水提取物可以保护乙醇损 伤的人胃黏膜上皮系GES-1细胞，可以增加bFGF的蛋白表达水平，提高 溃疡愈合速度。 关键词:六月雪;水提取物;乙醇;人胃黏膜上皮细胞 中图分类号:Q949.781.1 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2016) 08-2035-04 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.029 DOI: Abstract: Previous research found that junesnow[Serissa serissoides (DC.) Druce] has protect effect on gastric mucosal damage of rat caused by alcohol， further research was conducted on cellular level to explore the protect effect of junesnow on human gastric mucosal epithelial cells injured by alcohol. Epithelial cells GES-1 was cultured in vitro， then incubated under alcohol stress(0,10%) for 4,6 h to set gastric mucosal damage model. The experimental cell were divided into normal group， model group， Jinghuawenkang group and Junesnow group. Normal group was cultured for 24 h without any treatment; while the rest groups were treated by alcohol for certain time and then cultured with medium adding different dose of Jinghuawenkan or junesnow for 24 h. MTT experiment was used to exam the cell activity of each group. The results were taken to confirm high， meddle， low dosage of junesnow and positive drug group of Jinghuawenkang. Acridine orange staining method was used to measure apoptosis of each group; and Western-Blot to measure expression of bFGF. Results showed that incubating GES-1 in 5% alcohol for 4 h could establish the best gastric mucosal damage model as the inhibitory rate of cell could reach to 40%. In Junesnow group， 60， 70， 80 μg/mL treatments had the best effect (P Key words: junesnow [Serissa serissoides (DC.) Druce];water extract; ethanol;human gastric mucosal epithelial cells 随着人们生活水平的提高，饮酒成了日常生活中十分普遍的现象，但 由乙醇引起的消化道疾病则呈逐年增加趋势，大量饮酒可引起急性的消化 道患疾，主要有胃炎、胃溃疡等胃肠道疾病。乙醇对胃黏膜损伤机制非常 复杂，主要有化学灼伤及诱导胃黏膜细胞凋亡、坏死等[1]。中药六月雪 又名白马骨，系茜草科(Rubiaceae)植物六月雪[Serissa serissoides (DC.)Druce]的干燥全草[2]。全国各地均产。在江西省赣南地区资源丰 富。为常用民间草药。六月雪早在《本草拾遗》中就有记载，其能活血、 凉血、疏肝泻湿、消肿止痛[3]。现代医学主要用于急慢性肝炎、黄疸、 流行性腮腺炎、肾性水肿、血尿及高血压等症[4]。六月雪水提取物对乙 醇所致的大鼠胃黏膜损伤有保护作用，能明显减少溃疡面积的发生;而且 六月雪、黄花倒水莲联合用药对无水乙醇、阿司匹林、盐酸所致的大鼠胃 黏膜损伤有明显的保护作用，并且有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用机制可能和凝血因子以及调节激素水平有关[5-7]。2013年7月至2014年6月，在前期实验动物大鼠研究的基础上，课题组采用乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞为模型，以细胞活性、细胞凋亡、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)为检测指标，观察六月雪水提取物对乙醇造成的人胃黏膜上皮细胞损伤的保护效果，进一步在细胞水平上探讨了六月雪对胃黏膜细胞保护的作用机制，现将结果如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞 人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞由赣南医学院第一附属医院馈赠。 1.1.2 试(药)剂 中药炮制品六月雪购自赣州市医药公司，经鉴定为正品;荆花胃康胶丸，由天津天士力制药股份有限公司生产，批号:20130916;吖啶橙(AO)、高糖培养基DMEM、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品;胎牛血清由杭州四季青公司提供;一抗bFGF兔抗人多克隆抗体、二抗羊抗兔辣根过氧化物酶抗体、β-acting蛋白由上海长岛生物技术开发有限公司提供;PVDF膜为美国Millipore公司产品。还有乙醇、NaOH、磷酸盐缓冲液(PBS)、CO2等。 1.1.3 仪器 主要有Olympus CK40荧光倒置显微镜(日本光学工业株式会社)、CO2培养箱(德国Heraeus公司)、Thermo-354酶标仪(美国热电公司)、电泳系统(美国Bio-Rad公司)、培养瓶、培养板(美国Corning 公司)等。 1.2 方法 1.2.1 样品溶液的制备 取干燥六月雪药材500 g，加去离子水，过液面2 cm，煮沸2次，30 min/次，浓缩至400 mL，加3倍量的95%乙醇，放冰箱静置过夜，次日减压过滤，并回收滤液中乙醇，继续浓缩滤液得无醇味的提取物。提取物加去离子水至500 mL，使药液为相当于生药复方1 g/mL，用0.5% NaOH调整pH为7.0，置冰箱中备用。 1.2.2 GES-1细胞损伤模型的建立 分别以含0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%乙醇浓度的培养液作用人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞，作用时间分别为2、3、4、5、6 h，分别观察造成GES-1细胞损伤的程度，MTT法检测到的GES-1细胞抑制率达到40%左右时的试验参数即可作为最佳的GES-1细胞损伤模型，此时MTT法测得的吸光度值(OD值)在0,0.7范围内。后面的试验均以建模最佳乙醇浓度及作用时间制作GES-1细胞损伤模型。 1.2.3 GES-1细胞分组及处理 将参试GES-1细胞分为正常组(对照)、模型组、荆花胃康胶丸组、六月雪水提取物组4个组。处理过程如下:将GES-1细胞复苏，取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×103/mL，按照每孔100 μL 接种于96孔板，置于37 ?、5% CO2培养箱中常规培养24 h;贴壁后，吸出上清液，PBS洗2次。正常组GES-1细胞加入完全培养基，其余加入筛选出的乙醇浓度孵育一定时间后吸出的上清液，PBS洗2次。最后将六月雪水提取物组、荆花胃康胶丸组GES-1细胞加入含不同浓度的相应药物培养基100 μL，正常组、模型组不加药物，继续培养24 h。 1.2.4 MTT检测GES-1细胞活性 将六月雪水提取物组和荆花胃康胶丸组分别换上含不同浓度六月雪(10、20、30、40、50、60、70、80、100 μg/mL)和荆花胃康胶丸(10、40、80、120、160、200、240、280 μg/mL)的培养液100 μL，正常组加入无药物培养基100 μL，每组5个重复孔，各组分别培养24 h后，加入5 % MTT 10 μL，继续培养4 h。吸出培养液，每孔加入DMSO 100 μL，振荡溶解10 min。用酶标仪检测吸光度值(OD值)，检测波长490 nm，应用MTT比色法计算GES-1细胞活性。 1.2.5 吖啶橙荧光染色检测GES-1细胞凋亡 选择效果最佳的六月雪3个梯度剂量作为高、中、低剂量，选择最佳效果剂量的荆花胃康胶丸组作为阳性对照，正常组(对照)、模型组处理同上，将各组制备成GES-1细胞爬片，无菌PBS溶液洗去培养液，用95%乙醇固定液固定15 min，放置稍干燥后，滴加AO染液，避光静置2,3 min。将附有单层细胞染色后的小盖玻片反置于载玻片上，以滤纸吸取盖玻片周围的多余液体。使用相应的滤光片(绿光激发)，用荧光显微镜观察，凋亡的GES-1细胞呈现为染色减弱、荧光较亮、均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构，而非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。 1.2.6 Westernblot 检测bFGF蛋白的表达 分组同1.2.4，细胞培养6孔板中每4孔为一个样本，收集各组GES-1细胞上清液后，用PBS冲洗1次，弃去PBS，胰蛋白酶消化并收集GES-1细胞，加入细胞裂解液，4 ?、12 000 r/min离心30 min，取上清液，即是细胞总蛋白，Bradford法进行蛋白含量测定。制备的蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后用电转膜法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，一抗为bFGF抗体，二抗为羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，β-acting 蛋白作为对照。利用ECL化学发光法进行显色反应。检测结果以X线胶片曝光。用美国image J成像系统软件对条带进行灰度值扫描，以bFGF蛋白条带的灰度值与β-acting内参的灰度值之比作为蛋白的相对表达量。 1.3 数据处理 试验所得数据用x?S表示，采用Prism4.0统计软件进行分析，用配对t检验法进行组间差别比较。 2 结果与分析 2.1 GES-1细胞损伤模型选择 不同浓度乙醇作用GES-1细胞后在不同时间段的MTT法检测结果见表1。从表1可见，不同浓度乙醇作用后均对GES-1细胞造成损伤，其中5%的乙醇孵育4 h对GES-1细胞的抑制率达到40%，符合试验要求，表明5%的乙醇孵育4 h是最佳的GES-1细胞损伤模型。 2.2 各组细胞活性检测 正常组、荆花胃康胶丸组、六月雪水提取物组的GES-1细胞加入筛选出的乙醇浓度孵育后，经培养，测得的各组GES-1细胞OD值结果见表2。从表2可见，六月雪水提取物组GES-1细胞的增殖与浓度呈剂量依赖性，在10,60 μg/mL时增殖活性较明显，60,80 μg/mL时增殖速率有所减慢，但仍然呈现递增趋势，到100 μg/mL时呈现下降趋势，这可能是高浓度的六月雪水提取物对GES-1细胞产生了不良反应造成的。在荆花胃康胶丸组中，当浓度在160 μg/mL时，GES-1细胞增殖最明显，同时由于药物毒性，在剂量高于160 μg/mL时，GES-1细胞增殖开始减弱。 2.3 吖啶橙荧光染色 正常组(对照)、模型组、荆花胃康胶丸组(阳性对照)和六月雪水提取物高剂量组(80 μg/mL)、中剂量组(70 μg/mL)、低剂量组(60 μg/mL)分别用吖啶橙荧光染色后，于Olympus CK40荧光倒置显微镜下观察，并拍照，结果见图1。从图1A可见，正常对照组在显微镜下观察的GES-1细胞形态均一，细胞生长良好，吖啶橙染色后细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征，在荧光20倍下观察，整个视野未出现大量凋亡细胞。从图1B可见，模型组的GES-1细胞在乙醇作用下，大量GES-1细胞出现明显的衰老或凋亡，在荧光20倍下观察，能够观察到大量的凋亡细胞，凋亡细胞染色增强、荧光较亮、均匀一致地呈圆状或固缩状。从图1C可见，荆花胃康胶丸组(160 μg/mL)的GES-1细胞生长情况明显好于模型组。从图1D、图1E、图1F可见，六月雪水提取物高、中、低剂量组的GES-1细胞生长情况也明显好于模型组。 2.4 bFGF蛋白的表达 Westernblot检测bFGF蛋白的相对表达情况见图2。从图2可见，模型组bFGF的蛋白相对表达水平高于正常组，2组之间差异显著(P<0.05)。与模型组和荆花胃康胶丸组比较，六月雪水提取物的高、中、低剂量组中bFGF的蛋白相对表达均大幅增加，高、中、低剂量组与模型组、荆花胃康胶丸组之间差异极显著(P<0.01))。并且六月雪水提取物低剂量组的bFGF蛋白相对表达较高、中剂量组bFGF的蛋白相对表达水平有所减弱。 3 讨论 GES-1细胞来源于人胃黏膜上皮，该细胞能在体外稳定传代，目前乙醇损伤的GES-1细胞模型在大量的基础研究中被广泛应用，并证明其为良 好的实用型实验细胞模型[6]。试验结果表明，正常细胞生长良好，不同浓度乙醇作用GES-1细胞不同时间后会出现不同程度的损伤，其中5%的乙醇孵育4 h对GES-1细胞的抑制率达到40%，表明建模成功，且与临床中酒精所致的胃黏膜损伤相近，并且重现试验证明该方法简单、稳定性高。 六月雪在江西省赣南18个县均有分布、资源十分丰富，六月雪水提取物在赣南民间常用作酒精性胃出血的治疗，并且效果十分显著。前期研究[7]发现六月雪水提取物单独用药对乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤有明显的修复作用，能降低溃疡面积指数;并且六月雪与黄花倒水莲联合用药对无水乙醇、阿司匹林、盐酸致大鼠胃黏膜损伤有明显的保护作用，还有一定的抗炎、促血小板生成、促凝血作用，作用机制可能和凝血因子以及调节激素水平有关[5，7]。有文献[8，9]报道了荆花胃康胶丸对急慢性胃炎、消化性溃疡有较好的治疗效果，选择其作为阳性对照药物疗效稳定性较高。试验利用六月雪水提取物作用于人胃溃疡模型的GES-1细胞，结果表明，六月雪水提取物对乙醇损伤的GES-1细胞均有促进增殖的作用，但是药剂量逐渐增大到一定程度后对细胞的毒性也逐渐增大。吖啶橙荧光染色结果表明，GES-1细胞经乙醇作用后，能够观察到大量的凋亡细胞，凋亡细胞染色增强、荧光较亮、均匀一致的呈圆状或固缩状，其中荆花胃康胶丸组、六月雪水提取物组的GES-1细胞生长情况明显好于模型组。 正常胃黏膜组织中bFGF蛋白表达呈弱阳性;大量研究认为，当胃溃疡发生时，bFGF蛋白呈阳性表达，胃溃疡组织中bFGF表达高于正常的胃黏膜，在愈合期和瘢痕期均呈强阳性表达，但在愈合阶段其表达逐渐减弱[10]。试验通过免疫印迹分析bFGF结果可知，bFGF在正常组中有少量表 达，在模型组和给药组中表达非常显著，与正常组比较差异显著(P<0.05)。bFGF在胃溃疡愈合过程中的表达由弱到强，推测可能与溃疡愈合有关，低剂量六月雪水提取物组的bFGF表达较高、中剂量组有所减少，但仍呈高表达状态，这可能与细胞处于瘢痕期，其组织结构仍需要调整、仍然需要bFGF的作用有关，综上所述，六月雪水提取物对乙醇损伤GES-1细胞有保护作用，这为中药治疗乙醇导致的消化性溃疡开辟了一条新的路径。 参考文献: [1] 马方励，蔡鸿飞，巫燕莉，等.常欣卫口服液抗胃黏膜损伤作用[J].中药新药与临床药理，2010，21(6):601. 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