骨骼肌两型肌纤维的α运动神经元的形态和分布

骨骼肌两型肌纤维的α运动神经元的形态和分布 骨骼肌两型肌纤维的α运动神经元的形态 和分布 第32卷第2期 2009年4月 遵义医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEZUNYI Vo1.32No.2 Apr.2009 骨骼肌两型肌纤维的运动神经元的形态和分布 周播江,史楠,陆奎顺,范学斌,黄永坚 (遵义医学院人体解剖教研室,贵州遵义563003) 【摘要】目的通过观察趾长伸肌运动神经元(EDL—Mn)和比目鱼肌运动神经元(SOL-Mn)的形态特点及其在脊 髓的分布特征,探讨骨骼肌两型肌纤维的d运动神经元的形态特征及其与两型肌纤维功能之间的关系.方法应用 改良的肌球蛋白ATP酶组织化学染色法观察5只健康6-8周龄Wistar大鼠的趾长伸肌和比目鱼肌的肌纤维类型的 构成特点;应用神经束路逆行示踪法追踪20只健康6,8周龄Wistar大鼠的趾长伸肌和比目鱼肌的运动神经元.结 果趾长伸肌?型纤维占83%,92%,比目鱼肌I型纤维占87%一97%.支配趾长伸肌的神经元较大,以大多角形为 )外侧.支配比目鱼肌的神经元以圆主,主要分布在脊髓L4,L5节段的前角前群(核 形为主,主要分布在脊髓L4,L5 和L6节段的前角前群(核)内侧.结论支配趾长伸肌的运动神经元与支配比目鱼肌的运动神经元在数量和分布定 位上存在差异,虽不能充分说明支配I型纤维和?型纤维的运动神经元一定存在同样差异.但其面积方面的差异说 明了支配?型(快肌)纤维的神经元大于支配I型(慢肌)纤维的神经元. [关键词】趾长伸肌;比目鱼肌;肌纤维型;运动神经元 [中图分类号】R322.81[文献标识码】A[文章编号]1000—2715(2009)02-0099—04 Theappearanceandidstributionofa-motorneuronofmusclefiberI and?type ZHoUBo-jiang,SHINan,LUKui-shun,FANXue-bin,HUANGYong_iian (DepartmentofAnatomy,ZunyiMedicalCollege,GuizhouZunyi563003,China) [Abstract]ObjectiveTocomparethedifferencesofmotorneuronsdominatedtWOmusclefibertypes,weinvestigatedthe appearanceanddistributionofmotorneuronswhichdominateextensordigitommlongus(EDL)andsoleus(SOL)inspinal cord.MethodsThedistributionfeatureofmusclefibertypesofEDLandSOLwasobservedbyMyosinATPasestaining methodandtheappearanceanddistributionofmotoneurons(Mn)dominatedEDLandSOLwasinvestigatedbyretrograde fluorescenceandHRPtracing.ResultsThemusclefiber1ItypeofEDLwasfromeighty-threepercenttoninety-two percent,ThemusclefiberItypeofSOLwasfromeighty-seventoninetysevenpercent.EDL-Mnsweremainlybigger polygonandweredistributedinlateralanteriornucleusoflateralmotoneuroncolumnsinspinalsegmentL4and15,SOL- Mnsweremainlysmallerroundandweredistributedinmedialanteriornucleusoflateralmotoneuroncolumnsinspinal segmentL4,15andL6.ConclusionsThereweresomedifferencesinnumbers,distributionandareasbetweenEDL—Mns andSOL— Mns.Thoughtheirdifferencesinnumbersanddistributioncannotthoroughlyprovethattheremustbethesame differencesbetweenthemotoneuronsofmusclefiberIandIItype.theirdiscrepancyofareasdemonstratedtl1atthe motoneuronsofthemusclefiber?(fast— twitchmuscle)typeisbiggerthanthemotoneuronsofthemusclefiberIslow— twitchmuscle)type. [Keywords]extensordigitorumlongus;soleus;motoneuron;musclefibertype 一 般认为,受同一运动神经元支配的所有肌纤 维具有相同的类型,并且其形态,代谢和生理特征都 [收稿日期]2008—11-14 【作者简介】周播江(1963一),贵州省遵义人,副教授,复旦大 学在读博士后,研究方向:干细胞心血管实验形态学. 相一致.由于趾长伸肌是典型的快肌,比目鱼肌是典 型的慢肌【lI2】.因此根据骨骼肌肌纤维类型由其运动 神经元决定的观点,说明两肌的运动神经元存在功 能上差异,由此我们推测其形态上也可能存在差异. 石葛明【3指出支配趾长伸肌的运动神经元(EDL—Mn) 群和支配比目鱼肌的运动神经元(EDL—Mn)群均位 于L4,L5节段,但目前关于两肌运动神经元的形态 ? 99? 遵义医学院32卷 特点及其分布特征,文献报道尚少.因此,本研究选 用大鼠作为研究对象,应用快蓝和荧光金逆行标记 示踪法和HRP逆行示踪法追踪两肌的运动神经元, 观察两型肌纤维运动神经元的形态特点和分布特 征,并探讨神经元,肌纤维类型及其功能之间的关 系. 1和方法 1.1动物健康Wistar大鼠25只(6—8周龄1,体重 200—250g,雌雄不限,购于遵义医学院动物实验中 心.随机分组:?肌纤维型组:5只;?束路追踪组20 只.(1)荧光组:1)同侧双标组:动物5只;2)双侧单 标组:动物5只;(2)辣根过氧化物酶组:1)HRP— EDL组:动物5只;2)HRP—SOL组:动物5只. 1.2主要试剂辣根过氧化物酶(horseradishpero— xidase,TypeV[一A,HRP),荧光金(Fluorogold,FG)和快 蓝(fastblue.FB),购于美国sigma公司. 1.3方法 1.3.1肌纤维型观察运用在Guth&Samahat41 的基础上改良的肌球蛋白ATP酶组织化学染色法圈 对趾长伸肌和比目鱼肌的肌纤维型进行检测.Wistar 大鼠5只.戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,取左侧 趾长伸肌和右侧比目鱼肌各5ram的组织块,放人液 氮(一196?)中速冻.一20?下复温,冰冻切片机 (LeicaCM1900)连续切片,片厚10txm.贴片,室温下 干燥.4%多聚甲醛固定5min,Tris洗液漂洗1次,预 孵液孵育15min,经Tris洗液漂洗2次后,37?孵育 液孵育60min,l%CaCI洗液洗3次,置2%氯化钴 (CoC1)液中3min,蒸馏水漂洗4次,置1%硫化铵 [(NH)2s]液中3min,自来水冲洗后脱水透明,中性树 胶封片.光镜下观察. 按下列方法进行统计分析,每张切片随机取4 个视野,测量150条肌纤维,分别统计I或?型纤维 的数目.隔lO张取一张切片,每块肌3张切片.共测 量450条肌纤维. 1.3.2逆行柬路追踪法?双荧光标记逆行示踪 法:麻醉后,用微量注射器在左侧趾长伸肌注入FG. 回笼正常喂养,动物存活2d后,同侧双标组大鼠暴 露同侧比目鱼肌,双侧单标组大鼠暴露对侧比目鱼 肌,分别注入FB溶液.回笼继续喂养,动物存活5d 后,麻醉,开胸,经左心室插管,先快速灌注21?生理 盐水冲洗血液,后灌注4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸 缓冲液固定.取脊髓L3,S节段,先置于上述固定液 ? 1oo? 中后固定过夜,再依次浸入10%和20%蔗糖的 0.1mol/L磷酸缓冲液中.冰冻切片机连续切片,片厚 301~m,切片方位一致,均为与脊髓纵轴垂直的横切 面,每隔一张取一张切片.甘油缓冲液封片.激光共 聚焦显微镜和荧光显微镜下观察.?辣根过氧化物 酶(HRP)逆行示踪法:按鞠躬等提出的HRP逆行束 路追踪法进行[61.腹腔麻醉后,HRP—EDL组大鼠暴露 左侧趾长伸肌,HRP—SOL组大鼠暴露右侧比目鱼肌, 分别注入3%的HRP.动物存活2天,麻醉,开胸,经 左心室插管,灌注固定.取脊髓L3一S节段,冰冻切片 机连续切片,片厚301xm,切片方位一致,均为与脊髓 纵轴垂直的横切面,每隔一张取一张切片.按3,3, 5,5四甲基联苯胺(1'MB)显色反应法显色.经脱水,透 明后,中性树胶封片.光镜下观察.并用LeicaQvin3 系统进行图像分析. 1.3.3统计学处理分别按脊髓节段统计EDL— Mn,SOL—Mn的数目和面积,对统计结果进行方差分 析和t检验.所有数据均用SPSS11.5统计软件处理. 2结果 2.1肌纤维型观察结果肌球蛋白ATP酶染色 (pH9.4)显示:I型染色较浅,?型染色较深,肌纤维 呈多边形或不形,在横切面呈铺路石样分布,边 界清晰.两肌均含有50,100条大的同型维聚集.趾 长伸肌?型纤维占83%,92%,平均(88.7+3.06)%. 在肌的浅层IIb型纤维较多,深层则IIa型纤维较多, I型纤维散在其间.比目鱼肌的I型纤维占87%, 97%,平均(91.7+3.39)%(表1),?型纤维散在其间. 表1趾长伸肌和比目鱼肌的肌纤维型(%,n=5) Tab1ThemusclefibertypeofEDLandSOL(%,n=5) 2.2逆行束路追踪法结果?荧光标记逆行示踪法 结果:荧光金标记的EDL—Mn:左侧脊髓L4,L5节段 可见金黄色空洞样标记神经元,以L5居多,其他节 段未见标记细胞.细胞体积较大,呈多角形,三角形, 圆形,不规则形等,以大多角形为主,直径>25Ixm, 突起较明显.主要分布于脊髓前角前群(核),偏外 侧,紧靠灰质交界处(图1). 周播江等?骨骼肌两型肌纤维的仪运动神经元的形态和分布 图1脊髓内逆行荧光标记神经元(激光共聚焦显微镜摄片) NenronslabeledbyFGorFBinspinalcorde 1为FG标记的黄色EDL—Mn(红色箭头示),2为FG标记的 蓝色SOL-Mn(红色箭头示) 快蓝标记的SOL—Mn:无论在脊髓的左侧或右侧 标记的神经元均呈蓝色空洞样细胞,细胞形态多样, 以圆形为主.体积稍小,直径<25Ixm,突起不明显 (图1).神经元分布于L4一L6节段,以L5最为集中, 其他节段未见标记细胞.细胞位于前角前群(核),偏 内侧. 在同侧双标记组未见到双荧光标记细胞.在双 侧单标记组未见到对侧交叉标记的细胞. ?辣根过氧化物酶(HRP)逆行束路追踪法结 果:HRP标记神经元,经TMB显色后,在光镜下呈蓝 黑色胞浆内可见HRP颗粒,为蓝黑色. 1)HRP—EDL组:分布于脊髓L4,L5节段,以L5 最多.细胞体呈大多角形,三角形,梭形,不规则形, 圆形等.以大多角形为主,突起较粗大.细胞主要分 布在前角前群(核)的外侧,在前角前群(核)内侧,前 角前外侧群(核),前角后外侧群(核)均有散在分布. (图2). 2)HRP—SOL组:分布于脊髓L4,L5,L6节段,以 L5最为集中.细胞体呈多角形,三角形,梭形等.以 中等大小的多角形为主,突起较细小.细胞主要分布 在前角前群,稍偏内侧.在前角前群外侧及前角前, 后外侧群(核)也有散在分布,可见SOL—Mn群与 EDL—Mn群在位置上有部分重叠(图2). 3)统计分析结果:EDL—Mn的数目在L5节段多 于L4节段,差异有显着性(P<0.05).SOL-Mn的数目 在L5节段也多于【4节段,差异也具有显着性(火 0.05).EDL—Mn的数目与SOL—Mn的数目相比较,在 L4节段EDL—Mn少于SOL—Mn,其差异无显着性 (P>0.05),在L5节段EDL—Mn多于SOL—Mn,其差异 有显着性(0.05). EDL—Mn的面积和SOL—Mn的面积在L5节段 均大于L4节段,差异没有显着性(尸>O.05).但EDL一 图2HRP逆行标记神经元(脊髓冰冻切片,xl00) NeuronslabeledbyHRP(spinalcordsections.xl00) 1为脊髓L5节段横切片,示EDL-Mn;2为脊髓【4节段横切 片,示SOL-Mn Mn的面积与SOL—Mn的面积相比较,EDL-Mn的面 积在L4节段和L5节段均大于SOL—Mn的面积,其 差异均有显着性(P<0.05)(表2,3). 表2趾长伸肌和比目鱼肌的运动神经元数目在脊髓 各节段的比较(M,n=5) Table2ComparingthenumberofEDL—Mnand SOL-Mnineachspinalsegment(M,n=5) 与其它节段相比,差异有显着性.P<0.05 表3趾长伸肌和比目鱼肌的运动神经元胞体面积在脊 髓各节段的比较(p,m2,M,n=5) Table3ComparingtheareaofEDL-MnandSOL- Mnineachspinalsegment(m2,M,n-5) ,差异有显着性,P<0.05 与SOL相比 3讨论 3.1趾长伸肌和比目鱼肌的肌纤维类型特征本文 用肌球蛋白ATPase法(PH9.4)对趾长伸肌和比目鱼 肌的肌纤维型进行观察,发现趾长伸肌的?型纤维 在83%-92%之间,平均88.7~3.06%.这进一步证实 了Armstrong~的观点:趾长伸肌以快肌(?型97%) 为主,比目鱼肌以慢肌(I型87%)为主.由于肌构筑 学研究表明比目鱼肌倾向于力量型,趾长伸肌 倾向于速度型设计.因此,我们根据两肌的纤维类型 构成特点及肌构筑学特征,认为趾长伸肌属于决肌, 比目鱼肌属于慢肌. 3.2EDL—Mn和SOL—Mn的分布特征我们发现 EDL—Mn主要分布在脊髓L4,L5节段,神经元数目 以L5居多,且经统计分析表明节段之间的差异具有 显着性(P<O.05).而SOL—Mn主要分布脊髓L4,L5, ? 101? 遵义医学院32卷 L6节段,神经元数目也以IJ5最为集中,其节段之间 的差异也具有显着性(P<0.05).因此,我们认为支配 两肌的运动神经元主要分布在L5节段.我们还发现 EDL—Mn的数目与SOL—Mn的数目相比较,在L4节 段EDL—Mn少于SOL—Mn,其差异无显着性(JP> 0.05),在L5节段EDL—Mn多于SOL—Mn,其差异有 显着性(P<O.05).这提示EDL—Mn数目多于SOL— Mn的数目.但由于神经元数目与肌的大小,运动单 位的大小及肌纤维类型的构成比等有关,因此,关于 支配I型或?型肌纤维的神经元数目及其差异尚需 更深入的研究来证实. 脊髓灰质前角运动神经元聚集成群,可分为内 侧群,中央群,外侧群.外侧群又分为前群,前外侧 群,后外侧群和后外侧后群.EDL-Mn主要分布在前 角前群(核)的外侧,在前角前群(核)内侧,前角前外 侧群(核),前角后外侧群(核)也有散在分布.SOL— Mn主要分布在前角前群(核)的内侧,在前角前群 (核)外侧,前角前外侧群(核),前角后外侧群(核)均 有散在分布.HRP示踪法的结果显示,EDL—Mn群与 SOL—Mn群在位置上有部分重叠,而同侧双荧光标 记结果显示EDL—Mn在SOL—Mn的外侧.以上结果 说明EDL—Mn与SOL-Mn从前外向后内排列.这与 支配躯干肌的神经元位于内侧群和支配四肢肌的神 经元位于外侧群的观点以及支配伸肌,展肌的神经 元沿前角外周排列和支配屈肌,收肌的神经元排列 在深部的观点基本吻合.石葛明l3】报道SOL—Mn位于 EDL—Mn的内侧,与我们的实验结果相一致.因此, 我们认为支配趾长伸肌和比目鱼肌的运动神经元在 脊髓的排列分布具有一定的规律性:即支配趾长伸 肌的运动神经元位于支配比目鱼肌的运动神经元外 侧.形成这种分布差异的原因可能是两肌分属不同 的肌群,而支配不同肌群的神经元在脊髓发育过程 中发生不同的位置迁移所致.尽管趾长伸肌主要由 ?型(快肌)纤维构成,比目鱼肌主要由I型(慢肌) 纤维构成,但由于趾长伸肌和比目鱼肌分属不同肌 群,支配?型纤维和I型纤维的运动神经元是否也 存在同样的分布规律尚需进一步的研究证实. 总之,支配趾长伸肌的运动神经元与支配比目 鱼肌的运动神经元在数量和分布定位上存在差异, 但由于两肌大小,运动单位大小不同以及两肌分属 不同的肌群等原因,还不能说明支配I型纤维和? 型纤维的运动神经元是否也存在同样差异. ? l02? 此外,荧光双标示踪没有观察到双荧光神经元 和对侧交叉支配的神经元,表明趾长伸肌和比目鱼 肌均由同侧脊髓前角运动神经元支配. 3.3I型(慢肌)和?型(快肌)纤维神经元的形态特 征我们通过荧光示踪法和HRP法显示支配趾长 伸肌和比目鱼肌的神经元,结果发现趾长伸肌的神 经元形态不一,有多角形,三角形,圆形等,以大多角 形为主,体积较大.与此类似,比目鱼肌的神经元形 态多样,但以中等大小的多角形为主.进一步统计分 析表明支配两肌神经元的面积在节段间无显着性差 异,但EDL-Mn的面积显着大于SOL—Mn的面积.因 此根据两肌的肌纤维类型特征,我们认为支配?型 (快肌)纤维的神经元大于支配I型(慢肌)纤维的神 经元. 一 般认为体积较大的运动神经元其轴突较粗 大,反之其轴突较细小.而轴突的横切面积与神经元 传导速度有关,轴突较粗者传导速度较快,反之则较 慢.因此,EDL—Mn的面积大于SOL—Mn的面积的这 种差异对决定两肌的不同收缩特征有重要的意义. 所以,我们认为EDL—Mn的面积比SOL—Mn大是 EDL—Mn的传导速度比SOL—Mn快的形态基础,这 为实现趾长伸肌(快肌)和比目鱼肌(慢肌)的功能提 供了形态学保证. 【参考文献】 【1]R.I.Close.Dynamicpropertiesofmammalianskeletal nmscles[J].PhysiolRev,1972,52:129-197. 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