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第四章DNA的复制Chapter4DNAReplication第四章DNA复制DNAReplication1引言---基因组复制与细胞分裂的关系2复制子3DNA复制的几种形式4DNA聚合酶5原核生物DNA复制的基本过程6真核生物DNA复制7DNA复制的调控8小结重点内容：①几个重要概念：DNA的复制、复制子、复制眼、复制叉、DNA聚合酶、DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制、DNA的先导链、DNA的后随链、冈崎片段；②不同生物基因组复制子数目；③线性DNA复制末端问题的提出及解决；④θ-复制、滚环复制及D-环复制的机制；⑤大肠杆菌DNA聚合酶I、II、III的性质比较，DNA聚合酶Ⅰ与缺口平移法制备探针；⑥DNA复制的起始、延伸及终止。了解内容：①基因组复制与细胞分裂的关系；②复制叉移动方向的确定；真核生物DNA聚合酶的种类及各自的功能；③DNA复制的调控。2复制子(replicon)2.1复制子的定义2.2不同生物复制子的数目2.3复制眼概念2.4复制叉概念及其移动方向的实验确定2.5复制的模式---起点、方向和速度2.1复制子的定义DNA中发生一次复制的单位称为复制子(replicon)。复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，在复制启动位点具起始点（origin)，在复制终止位点具终点（terminus)。起始点仅作用于所在复制子。注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制，且只发生一次。质粒一般是一个自主环状的DNA基因组，构成一个独立复制子；原核生物基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；真核生物基因组含多个复制子（一般40-100kb/个）。2.2不同生物复制子的数目2.3复制眼概念复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域Replicationeye复制叉:双螺旋DNA两条亲本链分开使复制能进行的部位。2.4复制叉的概念及其移动方向的确定复制叉移动方向的确定放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。单向复制：在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标记；双向复制：在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。2.5复制的模式---起点、方向和速度单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向3DNA复制的几种形式3.1线性DNA双链的复制3.2环状DNA双链的复制3.1线性DNA双链的复制3.1.1线性DNA复制的具体现3.1.2线性DNA复制时末端问题的提出3.1.3线性DNA复制时末端问题的解决方案3.1.1线性DNA复制的具体表现3.1.2线性DNA复制时末端问题的提出所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5`端向3`端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是5`→3`；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5`端如何起始呢？这就提出了线性DNA末端复制的问题。复制能在新合成链的3`端结束，它如何在5`端启动呢？3.1.3线性DNA复制时末端问题的解决方案(1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如λ噬菌体：滚环产生多聚复制子）；(2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5`端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA)。(3）DNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端。草履虫（Paramecium）的线性线粒体DNA的复制中就形成了一种交联；(4）末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）；（1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子TherollingcirclereplicatesDNAPhageλArollingcircleappearsasacircularmoleculewithalineartailbyelectronmicroscopy.Adenovirusterminalproteinbindstothe5`endofDNAandprovidesaC-OHendtoprimesynthesisofanewDNAstrand.（2）某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制AdenovirusDNAreplicationisinitiatedseparatelyatthetwoendsofthemoleculeandproceedsbystranddisplacement.（3）DNA末端形成特殊结构AtypicaltelomerehasasimplerepeatingstructurewithaG-T-richstrandthatextendsbeyondtheC-A-richstrand.TheG-tailisgeneratedbyalimiteddegradationoftheC-A-richstrand.（4）末端长度可变AloopformsattheendofchromosomalDNA.The3single-strandedendofthetelomere(TTAGGG)ndisplacesthehomologousrepeatsfromduplexDNAtoformat-loop.Watchingflash3.2环状DNA的复制3.2.1θ-复制3.2.2滚环复制3.2.3D-环复制3.2.1θ-复制replicationbyθ-structure3.2.2滚环复制replicationbyrollingcyclesstructureφX174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。TheAproteiniscis-actingPhageφX174Thereplicationbyrollingcyclestructure3.2.3D-环复制ReplicationbydisplacementloopstructureD-环复制（Replicationbydisplacementloopstructure)4DNA聚合酶4.1大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能4.2真核生物DNA聚合酶的种类及其功能4.3DNA聚合酶所具有的共同结构4.1大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能SOS修复性质聚合酶I聚合酶II聚合酶III3`→5`外切+++5`→3`外切+--新生链的合成--+生物学活性10.0515生物学功能切除引物修复DNA修复DNA复制4.1.1大肠杆菌DNA聚合酶I、II、III的性质比较（1）DNA聚合酶I103kDa的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，C端的2/3包括聚合酶活性位点；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10个碱基）。（2）利用DNA聚合酶I进行缺口平移法制备探针的基本原理4.1.2DNA聚合酶I与缺口平移法制备探针Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.DNaseⅠ4.2真核生物DNA聚合酶的种类及其功能真核生物由不同DNA聚合酶分别负责起始和延伸三种细胞核DNA复制酶具有不同的功能:DNApolymeraseα起始新链合成DNApolymeraseδ延伸先导链DNApolymeraseε可能与后随链合成有关，也可能具有其他功能4.3DNA聚合酶所具有的共同结构许多DNA聚合酶有一个由三个结构域组成的大裂隙，类似于手形。ThecommonorganizationofDNApolymeraseshasapalmthatcontainsthecatalyticsite,fingersthatpositionthetemplate,athumbthatbindsDNAandisimportantinprocessivity,anexonucleasedomainwithitsownactivesite,andanN-terminaldomain.5原核生物DNA复制的基本过程5.1DNA复制的起始5.2DNA合成链的延伸5.3DNA复制的终止5.1.1单链DNA的产生5.1.23`-OH引发末端的产生5.1.3复制复合体的形成5.1DNA复制的起始5.1.1单链DNA的产生解旋酶(helicase):使DNA的两条链分开，它通常利用ATP水解来提供必需的能量；拓扑异构酶（DNATopisomerase）拓扑异构酶的种类分为Ⅰ型和Ⅱ型。原核拓扑构酶Ⅰ：MW=100kD，单肽链，含3~4个Zn。作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。原核拓扑构酶Ⅰ作用机制：①酶与DNA结合使双链解旋；②使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转；③酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来；④酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋。拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶Ⅱ也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。ReplicationmachineryreplicationPositivesupercoilBreakDNATopoisomeraseIIpassDNAthroughthebreaknegativesupercoil单链结合蛋白（single-strandbindingprotein):单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态φX174噬菌体的DNA在三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：在复制起始点，噬菌体A蛋白使病毒（+）链产生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使两链分离。SSB包绕单链形成稳定的单链形式。ThreeproteinsunwindφX174DNA5.1.23`-OH引发末端的产生多种方法可以产生3`-OH末端1)3)2)起始需要解旋酶、单链结合蛋白和引发酶5.1.3复制复合体的形成5.2DNA合成链的延伸5.2.1半保留复制合成两条新的DNA链5.2.2DNA的合成是半不连续的5.2.3连接酶将冈崎片段连接在一起5.2.4前导链和后随链的协调合成5.2.5DNA复制忠实性的控制(1)半保留复制的概念DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconsertivereplication)。5.2.1半保留复制合成两条新的DNA链(2)半保留复制实验证据（Meselson-Stahl)1958年Meselson&stahl用同位素（15N）示踪标记加密度梯度离心技术实验,该实验跟踪了生长了三代的大肠杆菌，了DNA是采取半保留的方式进行复制。[15N][15N-14N][14N][15N-14N][15N-14N]5.2.2DNA的合成是半不连续的（semidiscontinuousreplication)DNA复制在合成先导链（leadingstrand)时是连续的；而在合成后随链(laggingstrand)时是先形成小片段（Okazakifragment），随后再将它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制（semidiscontinuousreplication)。两条新链具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment5.2.3连接酶（Ligase)将Okazakifragment连接在一起5.2.4前导链(Leadingstrand))和后随链(laggingstrand)的协调合成5.2.5DNA聚合酶控制复制的忠实性DNA聚合酶造成的复制错误可分为两类：移码（frameshift):指一个核苷酸的插入或缺失。替换（substitution):指掺入错误核苷酸（不正确配对）Note:DNA聚合酶通常具有3`-5`核酸外切酶活性，可以切除错配碱基；通过校正机制，复制忠实性还可提高100倍。(10-3→10-8-10-10)细菌的DNA聚合酶仔细检查延长链末端的碱基对，如果是错误的会予以切除。DNApolymeraseshaveexonucleaseactivity修复会把含损伤碱基的一小段DNA替换掉5.3DNA复制的终止一般说来，链的终止不需要特定的信号，也不需要特殊的蛋白质来参与，到达终止位点后，DNA聚合酶离开DNA双链，终止发生。真核生物DNA复制P47-487DNA复制的调控P48-508小结复制子、复制眼、复制叉的概念线状DNA分子复制时末端问题的解决DNA通过半保留半不连续方式合成细菌和真核生物都有一种以上的DNA聚合酶。DNA合成包括：起始、延伸和终止三个阶段起始(initiation)：涉及一种蛋白质复合物，它识别复制起始点(origin)。在DNA合成之前，母链必须分开，并（短暂地）保持单链状态，然后在复制叉处起始子链的合成；延伸(elongation)：由另一个蛋白质复合体完成。只有当蛋白质复合体和DNA在复制处的特殊结构结合时，复制体(replisome)才存在，在复制体延DNA移动时，母链分开而子链合成；终止（termination)：在复制子末端，终止反应是必需的。终止后，加倍的染色体必须分开。