非发酵革兰氏阴性杆菌

非发酵革兰氏阴性杆菌 第十一章 非发酵革兰阴性杆菌 一、教学大纲要求 (1) 非发酵菌的概念、种类和初步鉴定特征。 (2) 假单胞菌属的分类、临床意义、细菌特性、实验室检查和耐药性。 (3) 铜绿假单胞菌的临床意义、细菌特性、实验室检查和耐药性。 (4) 荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌的临床意义、细菌特性和实验室检查。 (5) 不动杆菌属、寡养单胞菌属、产碱杆菌属和军团菌的临床意义、细菌特性、实验室检查和耐 药性。 (6) 黄杆菌属和莫拉菌属的细菌特性和实验室检查。 二、教材内容精要 (一) 非发酵菌的主要特点和分类 非发酵菌(Nonfermentative Bacilli)是一群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌;在分类学上分别属于不同的科、属和种，但生化特征十分接近，多为条件致病菌，主要引起院内感染。 非发酵菌包括的菌种较多，主要有下列菌属:假单胞菌属(Pseud‎‎omonas)、不动杆菌属(Acine‎‎tobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、伯克菌属(Burkholderia)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、无色杆菌属Achromobacter)、莫拉菌属(Moraxella)、金氏杆菌属(Kinge‎‎lla)、黄杆菌属(Flavobacterium)、艾肯菌( 属(Eikenella)、土壤杆菌属(Agrob‎‎acterium)、黄单胞菌属(Xanth‎‎omonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、食酸菌属(Acidovorax)等。 若某种未知的革兰阴性杆菌具有以下一种或几种特征，则怀疑其为非发酵菌: 1.氧化发酵试验常显示是氧化型或产碱型。 2.氧化酶阳性，非发酵菌中，除不动杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌外氧化酶试验均为阳性。但并非所有氧化酶阳性的革兰阴性杆菌都是非发酵菌，如巴斯德菌、气单胞菌、邻单胞菌和弧菌属等也是氧化酶阳性但不是非发酵菌。 3.动力，非发酵菌大部分为专性需氧菌，在半固体培养基上观察动力不明显，可用悬滴法或鞭毛染色法检测其动力。 (二)假单胞菌属 假单胞菌属(Pseudomonas)为严格需氧、有鞭毛、无芽胞、无荚膜的革兰阴性杆菌，氧化酶试验均阳性，是假单胞菌科的代表菌属。 1(分类 假单胞菌科由假单胞菌属及其亲缘关系密切的菌属(以前大部分属于假单胞菌属)组成，用于假单胞菌科分类的方案有两个，一是根据细菌的表型特征分为7个主要的组，二是根据rRNA-DNA同源研究将假单胞菌科分为5个rRNA群。 尽管假单胞菌科的绝大部分细菌原先都被归类于假单胞菌属，但现在只有rRNA?群的细菌属于假单胞菌属(Pseudomonas)，包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、曼多辛假 单胞菌、产碱假单胞菌和假产碱假单胞菌7种细菌。 rRNA?群的细菌属于伯克菌属(Burkhokderia)，包括13个种，其中类鼻疽伯克菌、葱头伯克菌、唐菖蒲伯克菌和皮氏伯克菌与人类疾病相关。鼻疽伯克菌是动物专性寄生菌，在极少数情况下可传播给人(通常通过皮肤的磨损)，是本菌属中唯一无动力的种，本属其他菌种与植物有关而与人类疾病无关。 rRNA?群的细菌属于丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)，本科包括两个菌属:丛毛单胞菌属(Comamonas)和食酸菌属(Acidovorax)，前者包括土生丛毛单胞菌等三个菌种，后者包括敏捷食酸菌等三个菌种。 rRNA?群属于短波单胞菌属(Brevundimonas)，包括两个菌种:缺陷短波单胞菌和泡囊短波单胞菌。 rRNA?群的细菌属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，只有一个菌种——嗜麦芽寡养单胞菌。 2(细菌特性 假单胞菌属是一类无芽胞、有荚膜、散在排列的革兰阴性杆菌，菌体直或微弯、有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼;专性需氧，生长温度范围广，最适生长温度35?，少数细菌可在4?或42?生长，营养要求不高，普通培养基上均可生长;氧化利用葡萄糖，氧化酶、触酶试验阳性，麦康凯上可生长。除曼多辛假单胞菌、产碱假单胞菌和假产碱假单胞菌外，假单胞菌属的细菌在生长过程中可产生各种水溶性色素，主要为黄绿色的绿脓素、青脓素等。 3(临床意义 假单胞菌占70%~80%，主要为铜绿假单胞菌，其他较为常见的菌种有鲍曼不动人类非发酵菌感染中， 杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、产碱假单胞菌等。 4(微生物学检验 (1)检验程序 见图11-1。 医院环境用品、临床标本 肉汤培养基 分离培养基 血平板 麦康凯平板 可疑菌落 OF试验 涂片革兰染色 O 革兰阴性杆菌、氧化酶阳性 非发酵菌系列生化反应鉴定到种 产绿脓素、青脓素 42?生长、极端单鞭毛 乙酰胺酶阳性 铜绿假单胞菌 图11-1 非发酵菌检验程序 (2)标本采集 根据感染部位不同分别采集痰液、分泌物、尿液以及医院环境用品等。 (3)检验 非发酵菌鉴定较为复杂，应先进行初步分群(属)，然后再进行种的鉴定。初步分群的常用实验为葡萄糖氧化发酵试验(O/F试验)、氧化酶试验、动力观察。再进一步作生化试验进行菌种鉴定。 4.耐药性 假单胞菌属的细菌对有些抗生素天然耐药，临床治疗假单胞菌感染的抗菌药物主要有三类:β内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类。按美国临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)推荐，非肠杆菌科细菌除铜绿假单胞菌和不动杆菌属外，药敏试验不选用Kirby-Bauer法，应选用肉汤或琼脂稀释法或E-test法。 (三)铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是假单胞菌属的代表菌种，广泛分布于自然界和人体，其在外界环境中存在的重要条件是潮湿环境;为条件致病菌，主要引起医院内感染。 (细菌特性 1 (1)形态染色 革兰阴性杆菌，菌体呈球杆状或长丝状，长短不一;单个、呈双或短链状排列;无芽胞，有荚膜，一端有单鞭毛，运动活泼，临床分离株常有菌毛。 (2)培养特性 专性需氧菌，部分菌株能在兼性厌氧环境中生长，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，可生长温度范围是25?~42?，最适生长温度35?，4?不生长而42?生长是该菌的鉴别点之一。 在血平板、麦康凯平板上均可形成5种不同形态的菌落:?典型型，菌落呈灰绿色，大小不一，扁平湿润，边缘不规则，呈伞状伸展，表面常可见金属光泽;?大肠菌样型，菌落圆形凸起，灰白色半透明，似大肠埃希菌菌落;?黏液型，菌落光滑凸起，呈黏液状;?侏儒型，细小，无光泽半透明菌落;?粗糙型，菌落中央凸起，边缘扁平，表面粗糙。在血平板上常可见透明溶血环，有生姜气味;在液体培养基中呈混浊生长，表面可形成菌膜，在SS琼脂平板上，该菌经过24h培养形成较小无色半透明菌落，一般不易与沙门菌和志贺菌菌落相区别，但经48h培养菌落中央呈棕绿色。铜绿假单胞菌在普通琼脂平板上生长时，可产生多种色素，主要为绿脓素(为铜绿假单胞菌特征性色素)和青脓素(荧光素)，前者为蓝绿色。从临床标本分离的铜绿假单胞菌约有80%~90%产生绿脓素和青脓素。 (3)生化反应 氧化酶阳性，在OF培养基上，能氧化利用葡萄糖、木糖产酸，精氨酸双水解酶阳性，乙酰胺酶阳性，液化明胶，利用枸橼酸盐，还原硝酸盐并产生氮气，吲哚阴性。 (4)抗原构造 铜绿假单胞菌有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原、黏液(S)抗原和菌毛抗原。O抗原有两种成分:一种是外膜蛋白，为保护性抗原，免疫性强，具有属特异性;另一种为脂多糖(LPS)，具有型特异性，可用于细菌分型。 (5)抵抗力 铜绿假单胞菌对外界因素的抵抗力比其他无芽胞菌强，在潮湿的环境中能长期生存。对干燥、紫外线有抵抗力，但对热抵抗力不强，临床分离菌株对多种抗生素不敏感。 2(临床意义 铜绿假单胞菌可从医院内许多消毒不严的器皿和溶液中分离出来，常见为水溶液包括洗涤水、消毒液和液体药物等。医院内铜绿假单胞菌所致的肺部感染常见的入侵途径是雾化吸入、氧气吸入，各种侵袭性检查和治疗，如纤维支气管镜、导管、胆道、手术后引流等，破坏了机体皮肤或黏膜屏障，常引起本菌侵袭。 严重铜绿假单胞菌感染常发生在局部组织损伤或抵抗力降低的患者，如烧伤病人、各种癌肿患者和应用广谱抗生素、激素、抗肿瘤药及免疫抑制剂等患者;早产、先天畸形儿童和囊性纤维化等疾病及老年患者，也易发生严重的铜绿假单胞菌感染。 铜绿假单胞菌的致病作用与多种毒力因子有关，主要有以下几种: (1)黏附和定植 形成黏附的条件包括:?铜绿假单胞菌表面的荚膜多糖物质阻止白细胞和吞噬细胞的吞噬作用;?细菌表面的黏附素(主要是菌毛)和上皮细胞上存在的相应受体结合;?宿主防御机制异常。后者使细菌得以驻足，并保持和上皮细胞长时间的接触。 完整的皮肤黏膜是天然的屏障，故铜绿假单胞菌很少成为健康人的原发病原菌，但改变或损伤宿主正常的防御机制，如皮肤黏膜破坏、留置导尿管、气管切开插管或免疫机制缺损如粒细胞缺乏、低蛋白 各种肿瘤患者、应用激素和广谱抗生素的患者，常可导致感染。烧伤焦痂、婴儿或儿童的皮肤、血症、 脐带和肠道、老年人的尿道则是较常见的原发病灶或入侵门户。如果人体抵抗力降低或细菌毒力强，数量多，就可在血中生长繁殖，发生败血症。 (2)外毒素A 为主要毒力因子，是铜绿假单胞菌产生的最强有力毒素，可抑制蛋白质合成，对皮肤黏膜有坏死作用，约90%菌株产生外毒素A，在烧伤病人，其致死作用特别突出。 (3)其他尚有蛋白酶、胞外酶S、溶血素、肠毒素、色素、杀白细胞素 、内毒素等。 3(微生物学检验 (1)检验程序 见图11-2。 血液、环境用品 分泌物、穿刺液、痰、尿、胸腹水等 肉汤增菌 分离培养 直接涂片、革兰染色、镜检 (血平板、麦康凯) 35? 18,24h 初步鉴定 最后鉴定 革兰阴性杆菌 菌落特征 色素 生化 42? 分型 氧化酶阳性 气味 鉴定 反应 生长 (血清学 绿脓素 噬菌体) 葡萄糖OF:O 精氨酸水解酶， 乙酰胺酶， 明胶液化， 图11-2 铜绿假单胞菌检验程序 (2)标本采集 按疾病和检查目的分别采取不同的临床标本，如伤口分泌物、尿液、脓及穿刺液、血液、脑脊液、胸腹水、关节液等。医院环境检测可从空气、水、物体表面等处采样。 (3).检验方法 1)显微镜检查 脑脊液、胸腹水离心后取沉淀物涂片，绿色脓汁、分泌物直接涂片革兰染色镜检。为革兰阴性杆菌，有鞭毛。 2)分离培养 血液和体液标本可先增菌后在转种血琼脂平板和麦康凯平板，脓液、分泌物、中段尿等可直接接种上述培养基。 3)鉴定与鉴别 根据培养物的菌落特征、产生水溶性绿色色素、特殊的生姜气味、氧化酶试验、OF试验等即可作出初步鉴定。但对色素产生不典型的铜绿假单胞菌还需要做其它生化反应(如明胶液化、精氨酸双水解试验、42?生长试验等，乙酰胺酶检测试验有一定的价值，)与其他假单胞菌鉴别。 从临床标本中分离出铜绿假单胞菌，需要排除污染，从患者血及无菌体液、尿液中分离到本菌，特别是反复检出者，结合临床表现即可确定是感染病原菌，铜绿假单胞菌下呼吸道感染需连续三次痰培养阳性才能确立，如患者无感染的临床表现，虽然分离到铜绿假单胞菌亦应作为正常菌群。 (4)耐药性 铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认为是由于该菌具有外膜的低通透性(主要是外膜微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质)，最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多采用联合治疗，如选用一种β内酰胺类抗生素与一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合治疗严重的铜绿假单胞菌感染。 (四)荧光假单胞菌 1(细菌特性 革兰阴性杆菌，呈单个或成对排列，一端丛毛菌，运动活泼，偶见无鞭毛无动力的菌株。专性需氧，营养要求不高，在普通培养基上可生长，在麦康凯和SS平板上亦可生长，最适生长温度为25?~30?，大多数菌株在4?生长，37?或42?不生长。约94%的菌株产生水溶性荧光素(青脓素)，在紫外线(360nm)照射下呈黄绿色荧光，有些菌株产生蓝色色素，不扩散。氧化酶阳性，氧化葡萄糖、木糖产 酸，对麦芽糖多不分解，水解精氨酸，多能液化明胶，卵磷酯酶阳性。本菌对卡那霉素敏感。 2(临床意义 荧光假单胞菌(P.fluorescens)存在于土壤和水等环境中，常与食物(鸡蛋、血、牛乳等)腐败有关，可作为咽部的正常菌群存在，是人类少见的条件致病菌，偶从泌尿道感染病人尿中分离出。由于具有嗜冷性，可在冰箱储存血液中繁殖，若输入含有此菌的血库血液，可导致病人不可逆性的休克而死亡。 3(微生物学检验 尿、分泌物等临床标本可直接接种在血平板上，血液标本可先于20?~30?进行增菌后再接种血平板分离。不能在35?或37?进行培养，以免发生假阴性。本菌鞭毛3根以上，42?不能生长，不产生绿脓素，可以与铜绿假单胞菌相区别。本菌的最低鉴定特征有:单端鞭毛3根以上，动力阳性;氧化分解葡萄糖，不分解麦芽糖，氧化酶阳性，精氨酸水解阳性，明胶液化阳性;可产生荧光素，不产生绿脓素，4?生长，42?不生长。 (五)恶臭假单胞菌 1(细菌特性 革兰阴性杆菌，有些菌株为卵圆形，单端丛毛菌，运动活泼。专性需氧，最适生长温度25?~30?，42?不生长，4?生长不定，菌落与铜绿假单胞菌相似，但只产生荧光素(青脓素)，不产生绿脓素，借此可与铜绿假单胞菌相区别，其陈旧培养物有腥臭味。 2(临床意义 恶臭假单胞菌(P.putica)为鱼的一种致病菌，常从腐败的鱼中检出，可作为人类咽部的正常菌群，是人类少见的条件致病菌，偶从人类尿道感染、皮肤感染和骨髓炎标本中分离出，分泌物有腥臭味。 3(微生物学检验 鉴定中注意与其他假单胞菌相区别，只产生荧光素不产生绿脓素，42?不生长可与铜绿假单胞菌区别;不液化明胶、不产生卵磷酯酶、陈旧培养物上有腥臭味，有别于荧光假单胞菌。 (六)斯氏假单胞菌 1(细菌特性 革兰阴性杆菌，一端单鞭毛，运动活泼;最适生长温度35?，4?不生长，大部分菌株在42?生长，氧化葡萄糖产酸，在6.5%高盐培养基中可生长;营养要求不高，普通平板可生长，新分离菌株在培养基上可形成特征性干燥、皱缩样菌落，黏附于琼脂表面难以移动，可产生黄色色素，无荧光。 2(临床意义 斯氏假单胞菌(P.stutizeri)存在于土壤和水中，在医院设备及各种临床标本中亦有发现，本菌引起的感染并不多见，偶可引起抵抗力低下患者伤口、泌尿道、肺部感染等。 3(微生物学检验 注意与曼多辛假单胞菌相鉴别，其特征性菌落、精氨酸双水解试验阳性、不分解麦芽糖和甘露醇，有别于曼多辛假单胞菌。 (七)不动杆菌属 不动杆菌属(Acinetobacter)归于奈瑟菌科，1986年巴斯德研究所的Bouvet等根据DNA-DNA杂交和 营养特征将不动杆菌分成17个基因种，但只有6个基因种有菌名，模式菌是醋酸钙不动杆菌。 1(细菌特性 不动杆菌属为一群不发酵糖类、氧化酶阴性、硝酸盐还原阴性、不能运动的革兰阴性杆菌。菌体多为球杆状，常成双排列，看似双球菌，有时不易脱色，可单个存在，无芽胞、无鞭毛，黏液型菌株有荚膜。专性需氧菌，营养要求不高，普通培养基上生长良好，最适生长温度35?，可在麦康凯培养基上生长，菌落呈无色或淡粉红色，但在SS上有些菌株生长不良。 2(临床意义 不动杆菌广泛分布于自然界、医院环境和健康人的皮肤。在临床标本中，最常见的是鲍曼不动杆菌，它是仅次于铜绿假单胞菌而居临床分离阳性率第二位的非发酵菌，为条件致病菌。医院内感染最常见的部位是呼吸道、尿道和伤口;致病条件有抗生素治疗、手术、应用器械、ICU病房等;所致的疾病包括肺炎、尿路感染、皮肤和伤口感染、心内膜炎、脑膜炎和腹膜炎等。 3(微生物学检验 (1)检验程序 见图11-3。 尿液、痰液、脓汁 直接涂片 分离培养 革兰染色 (血平板、麦康凯) 35? 18,24h 镜检 可疑菌落 涂片革兰 动力 KIA 全面生化反应 染色 革兰阴性球杆菌 阴性 底层斜面 最终鉴定 氧化酶阴性 不变色 报告 图11-3 不动杆菌属检验程序 (2)标本采集 根据临床疾病的不同采集不同的标本，常见为痰液、尿液和分泌物。 (3)检验方法 1)显微镜检查 临床标本采集后先做涂片，革兰染色后镜检，为革兰阴性球杆菌，常成双排列，在吞噬细胞内也有存在，易误认为奈瑟菌属细菌。 2)分离培养 在血平板和麦康凯平板上经35?~37?培养18h~24h后，可形成圆形、灰白色、光滑、 湿润、边缘整齐、直径2~3mm的菌落，无色素形成;洛菲不动杆菌菌落较小，直径为1~1.5mm;溶血不动 杆菌在血平板上可产生β溶血;有些菌株苛养，在血平板上呈针尖样菌落，在营养肉汤中不生长;某些氧 化葡萄糖的不动杆菌可使血平板呈独特的棕色。氧化酶阴性，动力阴性，硝酸盐还原试验阴性。 3)鉴定与鉴别 培养物经涂片、染色，如为革兰阴性成双排列的球杆菌，形态似奈瑟菌;KIA底层 及斜面均不变色、无动力;氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阴性，可初步确定为不动杆菌属的细菌(后三 项试验均为阴性者在革兰阴性杆菌中极为罕见)。本菌属内种的鉴定参见表11-1，并注意与类似菌的鉴 别(表11-2)。 表11-1 不动杆菌菌种的鉴别 醋酸钙 鲍曼不 溶血不 琼氏不 约氏不 洛菲不 不动杆菌 动杆菌 动杆菌 动杆菌 动杆菌 动杆菌 葡萄糖 + + +或- - - - 木 糖 - + +或- - - - 乳 糖 + + - + + + 精氨酸双水解酶 + + + + -或+ - 鸟氨酸脱羧酶 + + - - - - 苯丙氨酸脱氨酶 + + - - - - 丙二酸盐利用 + + - - -或+ - 柠檬酸盐利用 + + + +或- + - 溶 血 - - + - - - 液化明胶 - - + - - - 生长温度 37? + + + + - + 41? - + - + - - 42? - + - - - - 表11-2 不动杆菌与类似菌的比较 醋酸钙 洛菲不 铜绿假 粪产 不动杆菌 动杆菌 单胞菌 碱杆菌 氧化酶 - - + + 硫化氢 - - -/+ - 吲 哚 - - - - 动 力 - - + + 硝酸盐还原 - - + -/+ 葡萄糖 + - + - 木 糖 + - + - 乳 糖 (+) - - - 麦芽糖 (+) - - - 甘露醇 - - - - 蔗 糖 - - - - 精氨酸双水解酶 - - + - 柠檬酸盐利用 + - + + (4)耐药性 不动杆菌均对青霉素、氨苄西林和头孢拉啶耐药;大多数菌株对氯霉素耐药，不同菌株对二代和三代头孢菌素的耐药性不同，所以每个分离菌株均应进行药敏试验。非发酵菌中，仅本菌属细菌与铜绿假单胞菌可采用Kirby-Bauer法做药敏试验。多重耐药最多见于醋酸钙不动杆菌、鲍曼不动杆菌和溶血不动杆菌。 (八)寡养单胞菌属 寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)是一个新命名的菌属，属于假单胞菌科的RNA同源群?，只有一个菌种——嗜麦芽寡养单孢菌(S.maltophilia)，此菌的名称先后有嗜麦芽假单胞菌、嗜麦芽黄单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌。 1(细菌特性 革兰阴性杆菌，菌体直或略弯，单个或成对排列，一端丛毛菌，有动力。最适生长温度为35?，4?不生长，近半数菌株42?生长，专性需氧菌，营养要求不高，在普通琼脂平板上生长良好，麦康凯平板可生长。 2(临床意义 为条件致病菌，主要引起院内感染，最常见的是:呼吸道感染、尿道感染、伤口感染，也可引起脑膜炎、菌血症、医源性败血症、心内膜炎等。引起本菌定植和感染的危险因素有:机械通气、广谱抗生素的预防性应用、化疗、插管和中性粒细胞减少等。在非发酵菌引起的感染中，仅次于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌而居临床分离阳性率的第三位。 3(微生物学检验 (1)标本采集 血液标本先肉汤增菌，尿液、痰、胸水、伤口等标本直接接种于血平板和麦康凯平板。 (2)检验方法 1)显微镜检查 临床标本直接显微镜检查意义不大。细菌涂片革兰染色镜下为短至中等大小的革兰 阴性杆菌;不染色标本显微镜下动力检查，本菌运动活跃;鞭毛染色后镜检，本菌为一端丛毛菌，多数菌株鞭毛在3根以上。 2)分离培养 在普通琼脂平板上形成中等大小、圆形、黄色或棕黄色不透明的菌落，在血平板上菌落不溶血，有氨气味。氧化酶阴性，DNA酶阳性，赖氨酸脱羧酶试验阳性，葡萄糖氧化分解缓慢，可快速氧化分解麦芽糖，能液化明胶，硝酸盐产氮气阴性，部分菌株硝酸盐还原试验阳性。 3)鉴定 下列特征可用来推测性地鉴定嗜麦芽寡养单胞菌:在血平板或麦康凯平板上生长良好;氧化酶阴性;OF麦芽糖氧化产酸，但OF葡萄糖氧化分解可以阴性或产弱酸性反应;赖氨酸脱羧酶阳性、DNA酶阳性;一些菌株产生黄色色素;对碳青霉烯类抗生素天然耐药。 (3)耐药性 本菌对大多数临床常用的抗生素如氨基糖苷类和很多β内酰胺类(包括对铜绿假单胞菌很有效的抗生素，如碳青霉烯类)天然耐药，主要与该菌存在一种锌离子依赖金属β内酰胺酶有关，但对三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑天然敏感。目前尚无标准方法用于嗜麦芽寡养单胞菌的耐药性检测，可用肉汤或琼脂稀释法及E-test法检测其抗生素敏感性。 (九)产碱杆菌属 产碱杆菌属(Alcaligenes)在伯杰系统细菌手册中被分为2个种:粪产碱杆菌(A.faecalis)和木糖氧化产碱杆菌(A.xylosoxidans);后者又分为2个亚种:木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种(A.xylosoxidans subsp. xylosoxidans)和木糖氧化产碱杆菌脱硝亚种(A. xylosoxidans subsp.denitrificans)。有医学意义的产碱杆菌除上述三种菌外，尚有皮氏产碱杆菌(A.piechaudii)，典型菌种是粪产碱杆菌。 1(细菌特性 革兰阴性短杆菌，常成单、双或成链状排列，具有周鞭毛，无芽胞，多数菌株无荚膜。专性需氧，最适生长温度25?~37?，部分菌株42?能生长，营养要求不高，普通培养基上生长良好，麦康凯和SS平板亦可生长。氧化酶阳性，不分解任何糖类，葡萄糖OF培养基中产碱，本属细菌除能利用柠檬酸盐和部分菌株能还原硝酸盐外，多数生化反应为阴性。 2(临床意义 本属中临床分离最常见的是粪产碱杆菌，大部分感染是条件致病，主要来自潮湿环境，如雾化器、呼吸机和灌洗液等，血、痰、尿、脑脊液等是常见的发现部位，是医院感染的病原菌之 一。 3(微生物学检验 (1)检验程序 与不动杆菌属细菌检验程序相同。 (2)标本采集 根据临床疾病不同采集不同标本，如血、尿、痰、脓汁、脑脊液等。 (3)检验方法 1)显微镜检查 脑脊液、尿液离心取沉淀涂片，脓汁和痰液可直接涂片革兰染色镜检，本菌为革兰阴性短杆菌，有周鞭毛。 2)分离培养 血液、脑脊液标本需肉汤增菌后再转种固体培养基，脓汁、分泌物、尿液可直接接种血平板和麦康凯平板。经18h~24h培养后，在血平板上可形成大小不等、灰白色、扁平、边缘稍薄的的湿润菌落，粪产碱杆菌部分菌株有水果香味;在麦康凯和SS平板上形成无色透明菌落;在液体培养基中呈均匀混浊生长，表面形成菌膜，管底有粘性沉淀。 3)鉴定与鉴别 本属细菌与产碱假单胞菌极为相似，二者主要区别在于前者为周毛菌而后者为极端单鞭毛菌;在含有蛋白胨的肉汤培养基中产氨，使pH上升至8.6，为本菌的鉴别特征。木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种通过使OF葡萄糖和OF木糖产酸而很容易和其他产碱杆菌区别;粪产碱杆菌在碳水化合物培养基上呈强烈的产碱反应，大部分菌株形成细小、边缘不规则的菌落，某些菌株产生特征性的水果味并使血平板呈绿色，本菌的一个重要生化特征是能还原亚硝酸盐而不能还原硝酸盐。皮氏产碱杆菌通过能还原硝酸盐和能在6.5%NaCl中生长可与其他产碱杆菌区别;木糖氧化产碱杆菌脱硝亚种较少从临床分离到。 (4)耐药性 药物敏感试验的药物选择与假单胞菌相同，临床治疗可以用哌拉西林及替卡西林/克拉维酸，其他根据药敏试验结果选药。 (十)军团菌属 伯杰系统细菌学手册将其定为军团菌科，军团菌属。该菌属较为复杂，时有新种发现，现已命名的菌种分别来自人体和环境，共有39种及3个亚种，64个血清型。模式菌是嗜肺军团菌。 1(细菌特性 (1)形态染色 革兰阴性杆菌，无芽胞，无荚膜，有端鞭毛或侧鞭毛，动力阳性。 (2)培养特性 能在细胞内生长繁殖，专性需氧，同时生长环境中还需2.5%~5%的二氧化碳;其生长的pH范围较窄，最适pH6.4~7.2，在pH1.7时则死亡;最适生长温度35?，可生长的温度范围为25? ，在外环境中甚至水温达63?时亦可分离到本菌;营养要求苛刻，普通培养基、血平板和巧克力平~42? 板均不生长，生长过程中需要多种微量元素作为酶的协同因子或在代谢中起重要作用，同时需要氨基酸，以甲硫氨酸和半胱氨酸最为重要。生长缓慢，固体培养基在培养48h左右，在浓密涂种处可见生长。 不同培养基上菌落的形成和表现不同，目前公认的最适宜培养基是缓冲活性炭酵母浸出液，加上铁、L-半胱氨酸和α-酮戊二酸(在不含L-半胱氨酸的BCYE和血平板上不生长)，称之为BCYEa(buffered charcoal-yeast extract agar)培养基。 (3)生化反应 生化反应可作为鉴定时的参考，大多数菌种能产生β内酰胺酶和液化明胶、水解淀粉，触酶阳性，氧化酶弱阳性;硝酸盐还原、尿素酶和碳水化合物利用反应都是阴性;所有嗜肺军团菌血清型(血清型4和15除外)的各个菌株均具有极强的水解马尿酸盐的作用，而其他军团菌则阴性。 (4)抵抗力 军团菌已成为天然水环境中常在的一大类菌群，嗜肺军团菌的生存能力较强，在含有藻类物质的气溶胶中可长期存活，对紫外线敏感，对热和常用的化学消毒剂敏感。 2(临床意义 军团病在世界各地均有发病，但主要在经济发达国家流行，国内多属散发报道。本菌广泛存在于土壤及自然和人工的水环境中，尤其是在空调冷凝水中的检出率最高。大多数病例(85%)是嗜肺军团菌引起的，其中嗜肺军团菌1血清型和6血清型占75%。高发于夏秋季，细菌通过空气传播，易侵犯患有慢性器质性疾病或免疫功能低下的患者，最常见的是肺炎型。 3(微生物学检验 (1)检验程序 见图11-4。 血液、胸水 痰、组织、(无菌手续制成悬液) 血清 增菌 BCYE 血平板 涂片革兰 直接荧光抗体检测 培养 巧克力 染色 抗原、核酸检测 35? 2.5,CO 平板 2 间接荧光 需O 2 抗体染色 ELISA 生长 检测抗体 48h后生长， 24h生长， 可疑菌落 非军团菌 涂片革兰染色 革兰阳性菌 革兰阴性杆菌 非军团菌 做军团菌鉴定 (直接荧光抗体染色、生物学特性、 气相色谱分析) 图11-4 军团菌检验程序 (2)标本采集 标本应小心收集避免气溶胶的形成，最好于收集后两小时内用无菌防漏容器在环境温度下小心送到实验室。 1)适用的标本主要包括 咳出的痰、用支气管镜收集的材料、经气管吸出物、胸腔积液和血液等。除胸水和血液外，其他标本中均混有正常菌群及其他病原菌，正常菌群对军团菌有杀灭作用，取材后应及时分离培养，并使用加抗生素的选择培养基。 2)病理组织标本 如闭合或开放的肺活检材料、尸体标本及实验动物的肝、脾等标本必须制成悬液，再进行涂片和分离培养。 3)环境污染标本 如水、土壤等，水标本应先浓缩再接种，土壤标本加入水中振荡30min取水样，参照水标本处理。 (3)检验方法 1)显微镜检查 标本直接涂片革兰染色，意义不大。 2)分离培养 本菌营养要求苛刻，生长缓慢，在35?,37?，相对湿度70%,80%，2.5%,5.0%CO2环境下，BCYE培养基上培养2,5d可形成直径1,2mm有光泽的菌落，在F-G(Feeley-Garman)琼脂培养基上，培养3,5d可见针尖大小的菌落，在紫外线照射下可产生荧光。标本如在血平板、巧克力平板上生长或在 BCYE或F-G平板上24h生长，则不是军团菌。临床标本如有污染，可在培养基中加入对军团菌无抑制作用的抗生素如头孢噻吩4μg/ml、多粘菌素E16U/ml、万古霉素0.5μg/ml、放线菌酮80μg/ml。 3)鉴定 在血平板、巧克力平板及不含L半胱氨酸的BCYE平板上不生长，而在含有L半胱氨酸的BCYE和F-G培养基上生长缓慢、形成典型菌落;革兰阴性小杆菌，有显著的多形性，均应怀疑为军团菌。对可疑菌株可作直接荧光抗体染色等血清学鉴定和生化反应，必要时作细菌脂肪酸的气液相色谱分析和DNA杂交、PCR试验。 4)免疫学检测 检测军团菌血清抗体的方法主要有间接免疫荧光染色(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及放射免疫测定等，其中以IFA在临床应用最多。急性期和恢复期双份血清抗体效价增加4倍以上并达?1:128或单份血清抗体效价达到或超过1:256为阳性。本法取恢复期血清需时较久(1,3个月)，且可能与其他细菌的抗体起交叉反应。 5)核酸检测 是快速特异方法，常用DNA探针和PCR方法检测军团菌rRNA，可用于军团菌的快速诊断。 (4)耐药性 军团菌体外抗生素敏感性试验尚无统一标准，且与临床治疗反应不一致，因此，并不主张对医院诊断实验室分离的军团菌进行体外抗生素敏感性试验。目前已取得明显临床效果的抗菌药物主要是大环内酯类药物、利福平、氟喹诺酮类药物，其次是四环素类。青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类抗生素治疗本菌无效。 (十一)其他非发酵革兰阴性杆 1(黄杆菌科 (1)细菌特性 本科细菌是一群无动力、无芽胞、氧化酶阳性的革兰阴性杆菌。触酶阳性，临床可分离到的菌株一般均可产生吲哚;脑膜败血金色杆菌DNA酶阳性，动物伤口伯杰菌脲酶强阳性。专性需氧，最适生长温度35?，营养要求不高，普通培养基上可生长，临床可分离到的菌株(除动物伤口伯杰菌外)均可产生不溶性的黄色色素，在麦康凯培养基上生长较弱或完全不生长，粘液威克菌可形成黏液样黏性菌落，难以从琼脂上分离。 (2)临床意义 本科细菌在医院主要存在于有水的环境和潮湿的物体表面，对人致病的有脑膜败血金色杆菌、产吲哚金色杆菌、短稳杆菌、粘液威克菌、动物伤口伯杰菌等，其中脑膜败血金色杆菌是使人类致病的最常见的菌种，对早产儿具有高度致病性，可致新生儿脑炎，在婴儿室引起流行，且死亡率较高，也可引起免疫力低下成人肺炎。 (3)微生物学检验 1) 分离培养与鉴定 经35?、18~24h培养后，在普通培养基上可形成光滑、有光泽、边缘整齐、直径1~1.5mm的菌落，典型菌落为淡黄色，也有的呈黄色或棕黄色。生化鉴定是黄杆菌科细菌鉴别的主要指标，详见表11-3。 2)耐药性 临床常见的脑膜败血金色杆菌对广谱抗菌药物如氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素等有耐药性，治疗最好根据药敏试验结果选择药物。临床经验用药可选用磺胺类和大环内脂类抗生素。 表11-3 临床常见黄杆菌科细菌主要鉴别特征 试验 脑膜败血 产吲哚 粘液 动物伤 短稳 金色杆菌 金色杆菌 威克菌 口伯杰菌 杆菌 氧化酶 + + + + + 麦康凯生长 V(26) - - - - 动力 - - - - - OF葡萄糖 + + - - V(80) OF甘露醇 + + - - - 吲哚 + + + + + 淀粉水解 - + - - V(40) 七叶苷水解 + + - - - ONPG + (41) - - - DNA酶 + - - - + 尿素 - - - ++ - 青霉素 R R S S R 多粘菌素 R R S R R 色素 微黄 亮黄 淡黄 - 淡黄 注:+，90,以上菌株阳性;-，90,以上菌株阴性;V，11,,89,的菌株阳性(表中数字为阳性率) 2(莫拉菌属 医学上重要的莫拉菌有:腔隙莫拉菌(M. lacun‎‎ate)、非液化莫拉菌(M. nonliquefaciens)、奥斯陆莫拉菌 (M. osloensis)、苯丙酮酸莫拉菌(M. phenylpyruvica)、亚特兰大莫拉菌(M. atlantae)、狗莫拉菌(M. canis)和林 肯莫拉菌(M. lincolnii)。 (1)细菌特性 革兰阴性球杆菌，菌体小，革兰染色不易脱色，常成双或短链状排列，类似奈瑟菌 ，无鞭毛、无芽胞、多数菌株有荚膜。专性需氧，大部分莫拉菌营养要求高，首次培养需加入兔血或其 他动物血清，如腔隙莫拉菌和非液化莫拉菌;奥斯陆莫拉菌和苯丙酮酸莫拉菌在血平板上生长良好，菌 落较大，不溶血;最适生长温度32?,35?。氧化酶、触酶阳性，不能分解任何糖类，不产生吲哚和 HS。 2 (2)临床意义 莫拉菌是人体黏膜表面的正常菌群，致病性较低，通常位于呼吸道。腔隙莫拉菌可 奥斯陆莫拉引起结膜炎、角膜炎、慢性鼻窦炎和心内膜炎;非液化莫拉菌可引起内眼炎和化脓性关节炎; 菌和苯丙酮酸莫拉菌在临床标本中很常见，一般对人类无致病性，但也有引起肺炎、结膜炎、脑膜炎、 化脓性关节炎、中耳炎和腹膜炎的报道;亚特兰大莫拉菌有引起菌血症的报道，狗莫拉菌是一个新种， 主要定植于狗和猫的上呼吸道，在人类血液和狗咬伤口处分离过本菌。 (3)微生物学检验 1)分离培养 细菌在血平板或含兔血清的琼脂上经35?培养24~48h后出现针尖大小(通常菌落直 径小于0.5mm)到直径2mm之间的圆形、凸起、光滑湿润、无色不溶血的菌落，有的菌落培养数日后，菌落 周围出现绿变区，时间延长可见柠檬色素或黄色色素。 2)鉴定与鉴别 根据本菌氧化酶、触酶阳性(可排除不动杆菌)、不分解任何糖类(可同大多数奈 瑟菌相区别)，首先确定其属;然后进一步鉴定其种，确定本属各种之间的生化反应见表11-4。 3)耐药性 大多数莫拉菌对低浓度的青霉素很敏感，所以临床上分离出的这些菌株一般不做药敏试 验，但现在产β内酰胺酶的菌株也开始出现，要注意临床分离株的β内酰胺酶的检测。 表11-4 莫拉菌主要鉴别特征 腔隙莫非液化狗莫林肯莫奥斯陆苯丙酮酸亚特兰大项目 拉菌 莫拉菌 拉菌 拉菌 莫拉菌 莫拉菌 莫拉菌 氧化酶 + + + + + + + 触酶 + + + + + + + 麦康凯生长 - V(17) + - V(49) + + 动力 - - - - - - - OF葡萄糖 - - - - - - - 尿素酶 - - - - - + - 苯丙氨酸脱氨酶 - - - ND - + - 七叶苷水解 + ND - - - - - 硝酸盐还原 + + + - V(26) + ND 亚硝酸盐还原 - - V V - - V(20) DNA酶 - - + - - - - 溶血(羊血) - - - - - - - 明胶水解 + - - - - - - 注:+，90,以上的菌株阳性;-，90,以上菌株阴性;V，11,,89,的菌株阳性;ND，没有资料。