抗体效价

抗体效价 对狂犬病免疫球蛋白效价测定(小鼠法)的认识和应用 质量管理部:姜志文 我公司狂犬病免疫球蛋白效价检测主要是对原料血浆、原液、中间品和成品进行检定，检定有酶免法和小鼠法。原料血浆用酶免法，原液、中间品和成品用小鼠法。在公司开展狂免效价测定(小鼠法)以来，为了做好狂免效价的检定工作，就要掌握其检定方法和一定知识。 我对这一检定项目的认识有如下几点: 一、 必备知识 1、必须理解和掌握狂犬病免疫球蛋白效价测定的方法，见《中国药典》2010版第三部附录?J第一法。 -22、狂犬病毒的传代:从中检所购买冻干CVS毒株后，取其制成10悬液，脑内 -2攻击小鼠0.03ml/只，每只小鼠10,12g，待发病后取脑再制成10悬液，攻击小鼠脑内进行传代，传至2,3代后选用第5天发病并麻痹的小鼠取脑制成冻干中和用毒种或-70?冻存的中和用毒种。 -23、狂犬病毒CVS的制备:启开毒种，稀释成10悬液，接种10,12g小鼠0.03ml/只，不少于10只，每只脑内攻击传代，选择攻击4,5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入2%或20%小牛血清PBS制成悬液(每只鼠脑加3ml)，经 -12000转离心沉淀20分钟后，取上清液经病毒制成10滴定毒力和无菌检查符合规定后分装0.5ml/支作攻击病毒用。 4、病毒的保存:将第5天发病并麻痹的小鼠脑用2%或20%的小牛血清PBS研磨 -1稀释至10悬液，经2000转20min离心沉淀，取上清液混匀分装0.5ml/支小管，存-70?冰柜待用。 由于狂犬病毒不耐热，为此，保存病毒要在低温条件下才比较稳定，病毒脑组织在-70?或用50%甘油放置-30?，可保存数年，其感染滴毒下降不超过一个对数，病毒在甘油中可提高稳定性，如把病毒放在50%甘油中，于4?保存，病毒感染性可由稳定2,3个月延长至一年，病毒在真空干燥状态下，其稳定性可大大提高，冻干的病毒在低温下可长期保存，病毒的保存液与病毒对温度稳定性有关，在蒸馏水中比在生理盐水或缓冲液中更不稳定，在生理盐水加2%小牛血清或更高浓度的血清，则其稳定性可大大提高，人血白蛋白和牛血清白蛋白等也 提高病毒的稳定性，另外要注意尽量不要使病毒反复冻溶，在做同样条件实验时，应将一批病毒分装在小管内每次使用时拿出一支，因为反复冻溶会促进灭活影响结果，还应注意对病毒测定其活力时，必须把病毒放在冰水中进行，以免影响滴度。 5、病毒悬液LD的预测:即滴定病毒的毒力强度，取分装好0.5ml/支狂犬病毒50 悬液一支以10倍递次稀释法稀释成不同稀释度，分别攻击10,12g小鼠0.03ml/只，每个稀释度6只，每个稀释度病毒接种的小鼠放在一起，写明稀释度标记，每天观察小鼠死亡情况，14天后计算其LD。 50 6、狂犬病毒对温度和PH的抵抗力:狂犬病毒对温度的抵抗力很弱，在高温下很不稳定，病毒悬液在56?.30min或60?，10min即可灭活，煮沸2min病毒全部死亡，但是机体组织内的病毒加强灭活的时间要延长些，狂犬病毒的脑组织在常温，自溶条件下，可保持活力7,10天，在日光和紫外光线照射下，或强酸、强碱的环境下，病毒灭活的时间会缩短。 狂犬病毒在PH7.4,8.0较为稳定。若PH超过7.4,8.0的范围以外则病毒亦易灭活。另外用电子显微镜观察，低PH诱导狂犬病毒糖蛋白的构象发生改变，证明糖蛋白的天然构象和低PH失活构象间存在着PH依赖的平衡，而且低PH的糖蛋白易聚集。 7、病毒对化学因子的抵抗力:甲醛、乙醚、高锰酸钾和季胺类化合物(如苯扎溴铵)等化学药品对狂犬病毒都有杀伤作用。1%甲醛、3%来苏尔，15min即使病毒灭活。组织培养收获的病毒悬液于1:5000甲醛浓度下，在37?一天便可灭活。用1:6000-丙内酯于37?放量2h亦可灭活。20%乙醚、10%氯仿、25%酒精]5%碘酊和0.1%胰蛋白酶等也可使病毒灭活，灭活的速度也与病毒所处的状态有关，越是纯度高，没有细胞和组织保护下，可灭活的速度越快，相反灭活速度要慢些。 8、小鼠脑组织的获取 8.1取鼠脑前的准备:先用自来水多次冲洗小鼠，去掉身上脏物。用新洁尔灭消毒液浸泡换洗小鼠，3—5分钟。操作用(解剖钳、手术刀、剪刀、镊子)，用蒸馏水煮开10—15分钟后将水到掉，经高压后用。 8.2取脑步骤:将小鼠放在平皿上，固定小鼠，使用带齿的解剖钳,手术刀和剪子，完全切开从颅部到咀部的皮肤，同时去掉耳朵和上眼睑。左手用钳子固定住 动物的咀部并用镊子开脑腔，首先切开从眼窝到中线，自颅顶骨到两侧。 用干净的镊子和剪刀切取脑前部无脑膜的脑组织，然后切取大脑髓质，最后切取视交叉部分，将标本置于所需器具中。取脑过程中须是无菌操作。 9、脑内接种法:小鼠脑内接种时用左手大拇指与食指固定鼠头，可用碘酒消毒动物左侧眼耳之间上部注射部位，然后与眼后角耳前缘及颅中线所构成之三角形的中间进行注射，进针2-3mm，乳鼠注射量为0.02mm成年鼠为0.03mm。 10、对感染动物的观察: 对感染动物的观察是实验的重要内容，需要每日观察 必要时每天观察数日，实验动物是否发病应注意以下几个方面的情况: 10.1感染动物的食欲、活动及粪便情况。 10.2局部反应及全身情况，神经系统病毒感染可出现震颤、毛松、软弱、弓背、狂躁不安。 10.3 动物的体温及体重情况，测量需在同一时间进行，小动物体温可用半导体温度计测试，为便于比较及确定感染后的真实变化，在感染前进行3天的体温及体重测量。 二、中和实验技术 特异性抗病毒免疫血清(中和抗体)与病毒作用能够抑制病毒对敏感细胞的吸附，穿入和脱衣，从而阻止了病毒的繁殖，失去了感染能力。这一反映不仅现为质的方面，即一种病毒只能被相应的免疫血清所中和。而且也表现在量的方面，即中和一定量的病毒感染力，需要一定效价的抗体。 中和实验是以测定病毒的感染力为基础，结果的判定是要比较病毒受免疫血清中和后的残余感染力为依据，这就决定了此项实验必须在病毒的敏感动物进行，并需要严格的对照实验。 因为中和实验是一种特异较高的血清学方法。用中和实验测定的体液抗体水平，在一定程度上反映出机体的抗病毒感染的免疫能力，中和抗体在受病毒感染后的机体内存在时间较长，对那些既无血凝性，又无其他快速诊断方法的病毒来说，目前是一种鉴定病毒，检测抗体的可靠方法。 中和实验的影响因素: 病毒的中和反应是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因数有病毒、抗血 清、宿主细胞和实验操作误差等诸多因数，这些因数都会影响中和实验的规律。 1、病毒:在敏感动物能稳定传代培养的病毒株，制成新鲜的病毒悬液，实验前，经感染滴度(LD50)测定，因为动物存在个体差异，所以每一次中和实验时病毒的感染滴度(LD50)不一样。 2、血清:用于中和实验的病毒特异性抗血清(免疫血清)，阴性对照血清(与制备免疫血清同种动物的正常血清)及被检血清。均必须保持无菌，一般使用前需加热灭活，冷却后用于实验，不能反复冻溶使用。 3、孵育温度和时间:病毒与抗血清混合，0?情况下，不发生中和反应，5?以上中和反映即可发生，常规采用37?水浴1小时，一般病毒可发生充分中和反映，但针对不同耐热的病毒，孵育温度和时间应有所增减。 4、实验动物的选择:实验动物的质量，可直接影响中和实验的结果。狂免效价测定用小鼠质量为10-12g。 病毒感染的主要途径，狂犬病在体内典型的感染过程是由唾液中带有狂犬病毒的疯动物咬伤，使病毒从伤口进入机体内，在侵入部位一般不增生，也不侵入血液，故病毒血症，狂犬病毒冲局部侵入，周围神经组织内，沿着神经向心性传递至中枢神经系统。病毒运行，扩散过程的长短与潜伏期有关，一般为20-60天或者更长或更短，这与病毒侵入部位与数量有关，在此过程中，若对机体进行疫苗接种，提高机体的抗感染免疫能力，则可预防发病。 当狂犬病毒进入中枢神经，侵犯脑组织和脊髓的神经系统，并大量增生病毒而引起中枢神经功能紊乱和退行性病变，机体开始出现症状，一旦发病，目前尚未医治 狂犬病抗体测定的目的是为了测定暴露前免疫及暴露后治疗的疫苗免疫能力程度，WHO狂犬病专家委员会认为抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保护，如抗体滴度低于0.5IU/ml应该进行多个剂量的加强免疫，直到有主够的抗体为止。 抗体检测主要是检测血清中狂犬病毒的特异性抗体，其意义是: 1、 对未接种过狂犬疫苗的患者，采集其早期和晚期的双份血清进行抗体测定。如有4倍以上的增长，则可作为狂犬病诊断依据之一; 2、 对未接种疫苗的群体动物采血进行中和抗体的测定，可以了解动物狂犬 病隐性感染情况; 3、 测定疫苗接种后的抗体水平; 4、还可作为毒株之间的抗原性比较。 三、狂犬病毒实验管理 1、 狂犬病毒操作管理: 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在生物安全实验室内进行。有一个封闭的环境，专做狂犬病毒感染性工作。通过缓冲更衣间并限制一定的专业人员进出。穿专用的实验室隔离无菌衣和鞋。操作完毕对操作台进行消毒(当材料偶然的溢出时应立即用3%的来苏尔溶液或其他相应的消毒剂消毒)。每次实验前后应至少消毒地板一次。所有用后剩余的标本、尸解工具、实验材料在拿出实验室前应进行高压蒸汽消毒。 在实验室内禁止用口操作吸管、吃食物和使用化妆品，禁止带戒指等饰物:离开狂犬病诊断实验室时务必要洗手和更换实验室衣服和鞋。 所有能够产生气溶胶的操作如研磨组织或用注射器和注头接种实验室动物均应在安全柜内进行。 在生物安全柜或隔离器内打开动物盖骨的操作很困难，技术人员在操作这项工作时应带面罩，护目镜、手套和围裙。 与狂犬病相关的狂犬病病毒对人的致病性还不是很了解，所有操作可能含有这些病毒的标本均应在生物安全柜内进行。 个人防护管理:采用后开口工作服、工作帽、厚橡皮手套、防护眼镜、口罩、橡皮成塑料围裙等。特别在对动物开颅及取脊髓时，必须注意手套戴严密，扎紧脑部，防止碎裂玻璃器皿及碎骨等刺破。 伤口的处理:在实验过程中，凡被动物咬伤、抓伤或其他带毒的实验用具伤害皮肤和肌肉时，必须用肥皂水或自来水冲洗数分种，然后用5%碘酒烧灼伤口。若刺伤过深，可作清创术，伤口冲洗后再用3%HO溶液、0.1%高锰酸钾或0.1%22 新洁尔灭处理，最后在伤口周围用抗狂犬病毒免疫球蛋白作侵润性注射。 气溶胶的预防:因狂犬病毒气溶胶能够使人感染，研磨病毒的匀浆器须在严密的容器内操作，用吸管吹吸亦可造成气溶胶，因此必须在负压超净台中操作。操作前后须经紫外光充分照射。 疫苗预防性注射:操作衔毒的实验室人员必须事先注射狂犬病疫苗，一般注射疫苗3针，第一针5,7天后注射第二针，再隔1个月加强一针，末针后一个月取血清检测中和抗体，如抗体仍为阴性，则再行加强，直到抗体转阳。此后如果有感染接触的危险，则每隔1,3年加强一次。经过预防性接种已经产生抗体的人，如受狂犬咬伤，再加强一针疫苗即够，如无中和抗体产生的人咬伤后则需接受疫苗全程注射。 2、狂犬病毒观察实验室管理: 狂犬病毒实验必须在隔离实验室内进行，室内实验用具应配套，不能随意携出。进行狂犬病毒试验(病毒接种、解剖等)时，应穿隔离服、戴帽子、厚橡皮手套、防护眼镜、口罩、橡皮成塑料围裙等，实验完毕用消毒液纱布擦拭实验台、泡手。 狂犬病毒感染的动物要求严格隔离饲养，动物笼有明确的标签记录动物数，严防动物逃出，如意外减少，要立即报告，追查原因并及时处理。 进行狂犬病毒实验用过的动物笼、未吃完的食物、水瓶等应经高压消毒后方可处理。 死亡动物应放入专用袋或桶内高压消毒后再焚烧。 作好动物销毁记录。 3、实验人员管理: 所有实验室工作人员务必进行狂犬病疫苗暴露前免疫，这些人的综合抗体应定期进行检查，所有意外的暴露于感染时必须立即报告负责人。 当操作人员标本(血清)时，传染HIV和乙肝的危险性亦应考虑，工作人员必须注射乙肝疫苗。 当接种实验动物或操作感染的细胞培养时，特别是制备大量的高浓度病毒时，主要的传染来源为手指被有感染的玻璃或工具刺伤或割破，新糜烂的皮肤或黏膜与感染动物接触也认为是一种感染的危险。虽然固定毒的毒力已大为下降，但仍有一定的危险性，因此操作固定毒必须十分小心。 四、实验操作过程的体会 1、病毒制备:取小鼠脑组织时将小鼠血先放掉后取得的脑组织不带血，这样不会影响所得病毒悬液浓度。取每只小鼠脑组织都要换新的剪刀，以保证无菌操作。 研磨时加少量小牛血清缓冲液把脑组织研磨融烂后再加所需缓冲液至需要量。研磨时间尽量快。离心时应在2?离心悬液。 2、稀释病毒和样品时应吹打10次以上，吹打时尽量不可产生气泡，每个稀释度的吹打次数、力度、高度应一致，这样可保证稀释质量。 3、孵育时一定保证水浴温度和时间，水应埋过样液，到30分钟时拿出水浴用手震荡一次，使其中和均匀。 4、注射攻击时速度尽量快，应其注射量小，注射器取样时手法要快，排尽气泡。进针2-3mm，看脑内注射量时眼与注射器尽量平行。拿准攻击部位，从脑内退针时用大拇指和食指捏一下注射部位，以防止小鼠颅内压高而使注射液量外溢。 5、实验观察过程中注意小鼠的饮食情况、温度、湿度，勤换垫料，因氨浓度对小鼠质量有一定的影响。勤捡死亡和发病小鼠，防止其他小鼠对其撕咬等交叉感染。以达到最理想的实验结果。 6、攻击注射时一定记住样品和从浓稀释度往稀稀释度注射，病毒对照回滴从稀稀释度往浓稀释度注射。最好是每个稀释度换一支注射器。 7、因实验小鼠质量存在个体差异，中和用病毒悬液经孵育后病毒量要求在32,320LD之间，中检所作100 LD，我在做病毒回滴时做150 LD。 505050 五、小结 为了保证动物实验的质量，防止实验动物之间发生交叉感染以及避免实验人员实验室感染，我在今后实验中要以严谨的工作态度、科学的工作作风，在实践中不断的学习、总结和积累经验。 表 2009/2010年狂免小鼠法和酶免法结果比较 批号 小鼠法效价(IU/ml) 酶免法效价(IU/ml) 两法差 20091001 126 127.5 1.5 20091202 168 180.4 216.6 12.4、48.6 20091103R 141 177.8 36.8 20100101R 120 209.6 220.6 89.6、100.6 20100102R 152 169.8 191.4 17.8、39.4 20100101 133 171.6 165.4 38.6、32.4 20100103R 141 128.1 126.9 12.9、14.1 20100302 152 122.2 114.6 29.8、37.4 20100403 135 105.6 29.4 20100404R 141 109.6 31.4 20100504 141 83.6 57(4 20100505R 105 117.5 117.3 12.5、12.3 20100506R 105 116.6 122.3 11.6、17.3 平均差 29.4、35.3 以上13批实验样品中最低效价差为1.5，最高效价差为100.6。我认为用以上批次求小鼠法和酶免法的实验结果效价差不合理，在今后的实验中取一批和中检所结果接近的样品用小鼠法和酶免法分别作10次以上，将结果求平均差，用其作为质控品。这样就可以比较小鼠法和酶免法的实验结果。 如有机会可以去中检所学习第二法快速荧光抑制法，用其与小鼠法和酶免法作一下比较。