DNA 提取步骤

DNA 提取步骤 第 20 章 细胞基因分离鉴定和原位杂交 第一节 细胞 DNA、RNA 的分离鉴定技术 一、培养细胞基因组 DNA 的提取及鉴定 人和哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离通常是在有 EDTA、Sarkosye 等一类去污剂存在下，用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经 RNase 处理和纯化来提取 DNA，可用于细胞凋亡中对所引起 DNA 断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关 DNA 的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的 DNA 还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。 一DNA 提取方法: 1取单层细胞，经无钙、镁 PBS 洗一次，用 0.25胰蛋白酶消化，细胞悬液经 PBS 洗 2次弃上清，取细胞沉淀。 2加入 2ml 细胞裂解液10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1SDS充分混匀，加入蛋白酶 K 至终浓度为 0.5,1g/L、Sarkosye 终浓度为 0.5，混匀裂解蛋白呈糊状。 350?水浴 2 小时，转入 37?水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止 DNA 断裂，约 3 分钟。 12000r/min 离心 15 分钟(室温) 4取水相，再加入等体积酚/氯仿1:1同样颠 15 分钟(室温) 5再重复步骤4，再用等体倒混匀，去除蛋白质 12000 r/min 离心 积酚/氯仿1:1抽提一次 6取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀 12000 r/min 离心 15 分钟(室温) 7取水相，加入 2 倍体积的预冷无水乙醇，沉淀 DNA，混匀-20?放置 1 小时 12000 r/min 离心 15 分钟(室温) 8用 70乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥 10 分钟。 9加入 RNase A 至终浓度 37?水浴消化 1 小时，消化污染的 RNA。 10加入蛋白酶 K 至终浓度 100mg/L， 0.4g/L、Sarkosye 至终浓度 0.5，混匀，50?水浴 2 小时，加入 Nace 至终浓度 10mmol/L。 11用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。 12吸上清，加入氯仿/异戊醇24:1，按上法再抽一次。 13取水相，加入 2 倍体积预冷无水乙醇，-20? 1 小时。 14取沉淀用 70乙醇洗一次，真空干燥 10 分钟后溶于少量 TE 中，4?贮存。 二DNA 纯度检测及含量计算 DNA 浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长 260nm 处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其 OD260/OD280 的比值应大于 1.75.低于此值，说明 DNA 中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于 1.9 明 DNA 链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。 取 少 许 DNA 溶 液 ， 经 紫 外 线 扫 描 ， 吸 收 峰 值 位 于 波 长 260nm 处 ， 其 纯 度 应 为OD260/OD2801.8 OD260 值为 1 的溶液大约含 50μg/mL DNA，故 DNA 的浓度μg/mLOD260 值×50mg/L×稀释倍数。 DNA 总量μgDNA 浓度μg/mL×总体积mL DNA 分子量大小测定，可用含溴化乙锭的 1琼脂凝胶电泳法测定，根据加入品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组 DNA，进一步进行Southern 吸印分析。 二、培养细胞总 RNA 的提取及鉴定 细胞中含有三类 RNA 即 rRNA、mRNA 和 tRNA，其中 mRNA 传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所有特殊意义不同的细胞所表达某种蛋白的 mRNA 的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的 mRNA 的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS 等。 提取细胞总 RNA 的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2 基因的 RT-PCR 法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总 RNA，也可从 总 RNA中提取 mRNA，从而分析 mRNA 表达量，建立 cDNA 文库，以及对 mRNA 的调控和进行反义 RNA研究。 变性液:7mol/L 盐酸胍，25m mol/L 棕檬酸钠 pH7.0，0.5Sarkosye，0.1mol/L β-巯基乙醇。 水平衡酚:在饱和酚中加入等体积 DEPC 处理的三蒸水或新鲜无菌的三蒸水混匀后去除水相，再重复处理二次即可。 所用玻璃、塑料制品、金属器材可用 0.1 DEPC 水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用 180?干烤 6 小时，以去除被污染的 RNA 酶。 一总 RNA 的提取方法: 1、消化收集细胞方法同前。 2、向离心管中的细胞沉淀物中加 1.5mL 变性液，立即充分混匀。 3、加入 1.5mL 水平衡酚、0.15ml 2mol/L 乙酸钠 PH4.0、以及 0.05mL 氯仿，剧烈振荡混匀 30 秒后，立即置冰上放置 15 分钟，4? 12000r/min 离心 15 分钟。 4、取水相，加入等体积酚/氯仿1:1混匀，剧烈振荡 10 分钟，4?12000rpm 离心 15分钟。 5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡 10 分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇或异戊醇混匀，低温放置 20 分钟，再同上离心。 6、取沉淀用 70预冷乙 DEPC 处理的三蒸水中以溶解 RNA，分装-20?冻醇洗两次，干燥 10 分钟，溶于 存。 二总 RNA 的鉴定及含量计算 1、RNA 纯度及含量测定 取 少 量 提 取 的 RNA ， 经 紫 外 线 扫 描 ， 吸 收 峰 位 于 波 长 260nm 处 ， RNA 纯 度 为OD260/OD2801.8,2。 OD260 值为 1 的 RNA 溶液约含有 40μg/mL，故 RNA 浓度μg/mLOD260 值×40μg/mL×稀释倍数。 2、RNA 分子量大小鉴定 2.1 配液: 41.2g2-N-玛琳代丙磺碱，110×MOPS 电泳缓冲液配制 将 2-N-morpholinoethanesulfonic acid，MOPS溶于800mL 经 DEPC 处理的 50mmol/L 乙酸钠液中，用 2mol/L NaoH 调整 pH 至 7.0，加入 20mL 经DEPC 处理的 0.5mol/L EDTApH8.0，再加经 DEPC 处理的水至总体积为 1000mL 过滤除菌，避光室温保存。 2甲醛加样缓冲液:1mmol/L EDTApPH8.0、0.25溴酚兰、0.25二甲苯青 FF、 50甘油 2.2 操作步骤: 1制平板胶:1.2琼脂糖煮沸，冷却至 60?，加入 10×MOPS 缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为 3.5:1.1:1，或三者的终浓度分别为 1.2、1 及 10，于室温放置 30 分钟或更长时间，使胶凝固。 2在无菌离心管中混合下列液体。 RNA最多 30μg 4.5uL 10×MOPS 电泳缓冲液 1.0uL 甲醛 3.5uL 65?温育 15 分钟，水浴冷却、离心 3加入 2ul DEPC 处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm 电压，3 小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知 RNA 标本作分子量标准品，如 28srRNA 或 9S 兔β-球蛋白 mRNA。 4电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中终浓度 0.5g/L染色 30,45 分钟，紫外透射仪观察分子量大小。 第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交 一、DNA Southern Blot 及杂交 本技术可用于基因组 DNA 特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括:样品 DNA 内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移固定、特异性 DNA 片断的分子杂交及放射自显影。 一样品 DNA 内切酶水解 限制性内切酶RE可裂解双链 DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的 DNA 裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位URE活性是在 37? 1 小时内能将 1μg DNA 所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意 RE 的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行 DNA 切割。 1、配液:10×限制性酶消化缓冲液 10×buffer O— 无盐:100mmol/L Tris HCL pH7.4 1mg/mL BSA 100mmoL/L MgCL2 10mmol/L DTT 二硫苏糖醇 10×bnffer L—低盐:缓冲液 O 0.5mol/L Nacl 10×bnffer H—高盐:缓冲液 O 1.0mol/L Nacl 2、操作步骤: 1将 DNA0.2,1.0μg溶液加入 EP 管中并加入适量 H2O 总体积为 18μL，混匀。 2加入 2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。 3加 1,2U 限制性内切酶充分混合。 437?温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。 5加入 0.5mol/L EDTA pH8.0 使达到终浓度为 10mmol/L 终止反应。 6消化后的 DNA 直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或 Southern Blot。 二Southern Blot 及杂交。 将经电泳走在琼脂糖中的 DNA 变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的 DNA。 1、配液: 1变性溶液:1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH 2中和溶液:200mL 20×SSC 100mL 1mol/L HCL 100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0 加水至 500mL。 320×SSC: 在 800mlH2O 中溶解 175.3g Nacl 和 88.2g 柠檬酸 pH 至 7.0 加水至 1000ml，高压消毒灭菌。 4预钠，加入数滴 10mol/LNaoH 调 杂交液:12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4 125mL 20×SSC 25mL 100×DenhardtS 溶液 5mL 5mg/mL 鱼精 DNA 250mL 100去离子甲酰胺 82.5mL H2O总体积为 500mL 5100×DenhardtS 液:10g 聚蔗糖Ficoll400 10g 聚乙烯吡咯烷硐 10g 牛血清白蛋白组分 V 加 H2O 至 500ml 2、操作步骤如图 20-1: 图 20-1 Southern Blot 装置图 1 -24 琼脂糖内切酶消化的 DNA，总体积为 50uL，加入 10uL 加样缓冲液进行 12电泳。 2用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。 3将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动: 500mL 0.2mol/L HCL 10 分钟，水洗若干次 500mL 变性液中浸泡 15 分钟×2 500mL 中和溶液浸泡 30 分钟。 4剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶 3mm。 5剪 3,5 层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小 7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长 30,40cm，在一盘中加入数百毫升 20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。 6逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移 24,36 小时 7取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入 2×SSC 中 5 分钟，用滤纸吸干80?烘烤 2 小时。 8将该转移膜放在塑料袋中，加入 6,10mL 预杂交液，排出气泡，封口，42? 3 小时或过夜。 5 9将标记的 DNA 探针煮沸 5 分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为 5×10 CPM/ML。 10倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42? 6h 或过夜。 11取出转移膜，按以下条件洗膜 1×SSC，0.1SDS 室温 2×15 分钟 0.25SSC，0.1SDS42? 2×15 分钟，气中干燥。 12将杂交后的膜曝光于 X 光片，暗盒中放射自显影 2,7 天，-70?。 13X 片显影、定影，然后读片 结果分析:此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。 二、RNA Northern Blot 及杂交 此法是将 RNA 分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将 RNA 转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行 DNA-RNA 杂交，此法是研究 RNA特别是 mRNA的主要方法之一，可测量 RNA 的含量和大小。 1、配液:Northern 预杂交液:12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4 125mL 20×SSC 25mL 100×Danhardts 液 5mL 5mg/mL 鱼精 DNA 250mL 100去离子甲酰胺 加 H2O 至 500mL-20?贮存 Northern 杂交液:500mL 预杂交液加入标记探针及 10磷酸葡聚糖。 2、操作步骤: 1RNA 变性电泳 方法同前 2待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于 500mL 10×SSC 中浸泡 45 分钟，轻轻摇动。 3测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为?横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至 20×SSC 溶液;?胶;?硝酸纤维素滤膜;?亲和层吸纸;?吸水纸;?重物、转移 4,6 小时。 4取出滤膜 80?烘烤 2 小时。 5用 6,10mL Northern 预杂交液，42?预杂交过夜。 6将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入 6,10mL Northern 杂交液。 7去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42?，杂交过夜。 8按下列条件洗膜:1×SSC 0.1SDS 室温 2×15 分钟 0.25×SSC 0.1SDS 室温 2×15 分钟 9曝光于 X 光片暗盒中放射自显影 1 天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。 三、蛋白 Western Blot 及分析 此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序 Sonthern Blot 相似，故称为 Western Blot第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗同位素或非同位素的酶来检测，此方法可检测 1ng 抗原蛋白。 1、配液: 1转移电泳缓冲液:20mmol/L Tris HCL pH8.0 150mmol/L 甘氨酸 加 14.5g Tris 粉 67.08g 甘氨酸于 4L 水中，加入 1200mL 甲醇，加水至 6L 2丽春红 S 溶液:0.5丽春红 S 1乙酸 : 2、操作步骤(如图 20-2) 图 20-2 Western Blot 装置图 1用已制备好的 SDS-PAGE 分离的蛋白凝胶。 2用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在 Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。 3在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个 Scotch-Brit Pad。 4将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。 5接通电源:使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为 14V 4?转移 4 小时或过夜。 6将滤膜放入丽春红 S 溶液中 5 分钟，蛋白染色水中脱色 2 分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。 每 7将滤膜放在塑料袋中， 3 张加入 5mL 封闭缓冲液1 克速溶去脂奶粉溶于 100ml PBS中，封闭特异性抗体结合位点，室温 1h，摇动，倒出封闭缓冲液。 8在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置 1 小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS 洗四次，摇动。 9在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤 8。 10将滤膜放在 100mL 新配制的 DAB 底物溶液中，大约 2,3 分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。 结果分析:分析阳性显色条带的分子量大小，而且根据信号颜色强弱分析蛋白表达量。 第三节 细胞的原位杂交技术 组织切片以及分裂中期染色体带中检测 DNA 或 RNA 原位杂交ISH是一种可在细胞涂片、的技术，此方法原理是由 DNA 或 RNA 的序列与互补的标记单链 DNA/RNA 探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。 一、探针的制备原则和选择 探针为 RNA 或双链、单链 DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长 的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组 DNA 杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。 探针的获得常采用随机引物延伸法的 PCR 合成和扩增，可获大量的 DNA 探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成 RMA 探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷dUTP上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。 这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。 二、载玻片和盖玻片预处理 为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理: 1、用于检测 RNA 的载玻片的处理 1用 0.1mol/L HCL 洗载玻片 20 分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。 2 处理 2 小时 3×SSC 0.02FicoLL400 0.02聚乙稀吡咯烷酮PVP。 在下列溶液中，65? 3固定在乙醇/乙酸3:1 V/V20 分钟，180?烘烤 2 小时。 2、用于检测 DNA 的载玻片的处理 以 TESPAthree-amino-propyl-triethoxy-silane涂载玻片。 3、对于盖玻片:于 0.1mol/L HCL 中浸泡 20 分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180?烤 2 小时。 三、组织细胞固定 理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同 RNA 序列暴露。对于RNA-RNA 原位杂交有效的固定剂时确保目的基因 DNA 或 是 4多聚甲醛和 PLPD(磷酸缓冲液 PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐)。 1、涂片细胞原位杂交固定 1用含有 0.02EDTA 的 PBS 洗涤细胞，于 0.1胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。 2若检测 RNA，固定于 4多聚甲醛 pH7.0，在 4?下放 60 分钟，PBS 洗 5 分钟，系列乙醇脱水干燥，-20?保存。 3若检测 DNA，固定在 4多聚甲醛 16,24 小时，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4 洗 2×5分钟，浸泡在下述溶液中 2×5 分钟: 0.25v/vTritonx-100;0.25v/vNonidet P40;0.1mol/L Tris-HCL pH7.4;再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4 洗 2×5 分钟。 4在 100μg/ml 蛋白酶 K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA 溶液中，37?处理 10 分钟，再用含有甘氨酸的 0.1mol/L Tris-HCL PH7.4 洗 2×5 分钟。 5在 20v/v乙酸中 40?处理 15 分钟，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4 洗 2×5 分钟。 注意:对于 DNA-DNA 原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4多聚甲醛，固定至少 16 小时，而且用蛋白酶 K 处理，这样可明显减少背景染色。 四、原位杂交 原位杂交与盐浓度、温度、 pH DNA 甲酰胺浓度、 等有关， 复性的温度是 16,32?，DNA-RNA原位杂交，25?最佳，RNA-DNA 杂交，可用较高温度，在 pH5,9 范围内复性率基本上与 pH无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。 一同位素标记 DNA 探针的原位杂交 35 同位素标记的 DNA 探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如 S 标记探针在杂交前， 3 125用未经标记的 dUTP 预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用 H 或 I 3标记探针，但 H 放射线弱，自显影需 100 天曝光，不太理想，方法如下: 1取已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。 2将标本浸入甲醇固定 5 分钟，再过 3 次 4?预冷的 10.