双氯芬酸钠缓释片在健康人体的药代动力学与生物等效性的研究（可编辑）

双氯芬酸钠缓释片在健康人体的药代动力学与生物等效性的研究（可编辑） 双氯芬酸钠缓释片在健康人体的药代动力学与生物等 效性的研究 中国医科大学 硕士学位论文 双氯芬酸钠缓释片在健康人体的药代动力学与生物等效性研究 姓名:郭海杰 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:魏敏杰 20080501?英文缩略语? 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的,与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 论文作孝签名:三孚址日期:二塑业 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学,且导师 为通讯作者,通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外,以采用影印、缩 印或其他手段保存论文. 论文作者签名: 袭至也兰 指导教师签名:彳逸三二叁么二 日 期: 迦:』:三至?中文论著摘要? 双氯芬酸钠缓释片在健康人体的药代动力学 与生物等效性研究 刖 吾 多年来,药学工作者对市售的化学组分及含量都相同的片剂进行研究,结果 发现有些片剂的生物利用度存在显著的差异。在临床应用中也发现,相同剂 型 不同生产厂家生产的同类药品其生物利用度也不同,甚至有些同一厂家生产 的不 同批号的药品,在用法、用量相同的情况下,药物的吸收速度与吸收量也存在 差 别,即它们的生物利用度不同。药物吸收越多越快,血药浓度一时间曲线峰值越 高,出峰时间越早。有时仅因赋形剂的改变,也可引起生物利用度的改变,这说 明仅以生物利用度不能完全衡量药品的临床实际应用效果,因此我们有必要对药 品的生物等效性进行研究口。 生物等效性研究是药品质量的重要手段,它通过对两个药物或同一药物 不同剂型的药代动力学指标如血药浓度.时间曲线下面积,峰浓度和 达峰时间一进行等效性分析,来考察含同一药物活性成分的不同产品的质量 是否一致。因此生物等效性的试验设计、评估,是新药特别是同种等效药品申报 与评审的重要内容。药物制剂的生物利用度和生物等效性研究已成为药品研制、 开发管理方面的重要工作。 双氯芬酸钠?,为苯乙酸类衍生物,系非甾体抗炎镇痛药, 主要通过抑制环氧化酶途径而抑制花生四烯酸的代谢啼,有解热、镇痛和抗炎作 用,主要用于类风湿性关节炎、神经炎、红斑狼疮及癌症、手术后疼痛、各种原 因引起的发热的治疗。正是由于双氯芬酸钠有这些疗效,多个国家已经把双氯芬 酸钠制成缓释制剂并投放于市场?。 缓控释制剂因采用了新技术而改变了其体内释放吸收过程,所以有必要进行体内生物利用度研究,以证实其缓控释特征及其与参比制剂是否具有生物等效性 。对缓释制剂进行生物等效性研究时除了要进行单次给药试验外,还要进行多 次给药试验。多次给药比较符合临床给药情况,其目的是要确定缓释制剂达稳态 时的生物利用度和血药浓度的波动程度及维持时间。实际上,缓释制剂的临床用 药并非单一剂量,而是反复服用几天甚至几十天。因此考察其血药浓度达稳态时 的生物等效性更具有实际意义。 试验目的 、考察双氯芬酸钠缓释片受试制剂与参比制剂单次给药、多次给药达稳态后 的相关药代动力学参数及相对生物利用度。 、评价双氯芬酸钠缓释片受试制剂与参比制剂单次给药、多次给药达稳态后 是否具有生物等效性,为双氯芬酸钠缓释片受试制剂的临床应用提供理论依据。 试验方法 由于本制剂为特殊的口服缓释剂型,根据《化学药物制剂人体生物利用度和 生物等效性研究技术指导原则》年的相关规定,本试验在单次给药和多次 给药达稳态两种条件下进行: 、单次给药试验:采用双处理、双周期、双序列的试验设计将名健康受 试者随机分成两组,分别服用双氯芬酸钠缓释片受试制剂与参比制剂 后进 行生物等效性研究; 、多次给药达稳态试验:单次给药试验后,经过清洗期应为个半衰期 后,两组健康受试者分别服用双氯芬酸钠缓释片受试制剂与参比制剂 /次, 每天次,连续天大于个半衰期,确定健康受试者血药浓度已达稳态后进 行生物等效性研究。 试验结果 、单次给药试验 名健康受试者分别口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比制剂 后 血浆中双氯芬酸钠的城分别为.士.和..,舡分别为 .士 .和.士 ..?一,分别为士.和.士., 分别为.士.和..;用梯形法计算,.分别为 ..和..鹏??~,嘶分别为.. 和..??一;以.计算,与参比制剂相比,受试制剂的相对 生物利用度平均为..%。采用方差分析和双单侧检验法进行生物等效 性评价:结果表明受试制剂与参比制剂相比,受试制剂的%置信区间 为参比制剂相应参数的.%.%,受试制剂嘶的%置信区间为参 比制剂相应参数的.%~.%,受试制剂瓢的%置信区间为参比制剂 相应参数的. /..%,撒经非参数检验,两制剂间差异无统计学意义。 根据试验设定要求,以.。、舣为指标评价生物等效性。即:受试 制剂.的%可信限若为参比制剂的%%,瑚的%可信限若 为参比制剂的%%,参数口墩采用非参数法进行检验无统计学意义,则 认为受试制剂与参比制剂等效。本单次给药试验的试验结果符合上述等效性 判定 。 、多次给药达稳态试验 名健康受试者以 /天的剂量口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比 制剂,连续给药天,在给药的第天即可达到稳态血药浓度;给药第天健康 受试者的主要药代动力学参数分别为:撒为..和..,鹞。嗽 为..和...?一,鼹为..和 ...?~,站为..和..?~,为 ..和..,为..和..;用梯形法计算, 懿为 ..和. ~,为..和 .? ..;以站计算,与参比制剂相比,受试制剂的相对生物利用度平均 为..%。采用方差分析和双单侧检验法进行生物等效性评价,结果表明 受试制剂与参比制剂相比,受试制剂站的%置信区间为参比制剂相应参数 的.%.%,受试制剂一的%置信区间为参比制剂相应参数的. ‰.%,懈经非参数检验,两制剂间差异无统计学意义。 根据试验方案设定要求,以嚣、瞰为指标评价生物等效性。即:受试 制剂嚣的%可信限若为参比制剂的%%,联的%可信限若为 参比制剂的%%,参数撒采用非参数法进行检验无统计学意义,则认 为受试制剂与参比制剂等效。本多次给药达稳态试验的试验结果符合上述等 效性 判定标准。 结 论 依据上述试验结果,可以判定受试制剂双氯芬酸钠缓释片山西亚宝药业集团 股份有限公司研制,规格: /片,批号:与参比制剂双氯芬酸钠缓 释片加拿大奥贝泰克制药有限公司生产,商品名:奥贝,规格: /片,产 品批号:,进口商品注册证号:在健康人体具有生物等效性。 关键词 双氯芬酸钠缓释片;高效液相色谱法;药代动力学;生物等效性 ?英文论著摘要 ? ,,. .?. 【 . . . . 、 、. ... . ? . , . ,,.., ., . 、 . 、、. .《 .. , 、 . 、,. 、 , . , . :缸 取 .. . . . . .生.。一, .士... .士..士.;帆.士. 曲 .士.’‘~, .士. .士.? 一,. . %. :撒 .士 ?.士..士.缸.士..士.。~, 鲻 .士..士..‘~,豁盯.士. .士.。一, .士..士. .士..士.,;鹤.士. .士. .士.? ~, .:.,. .士.%. : :: /;: / :?;: / : ;:;. ;;; ?论文? 双氯芬酸钠缓释片在健康人体的生物等效性 与药代动力学研究 刖 罱 双氯芬酸钠 ,化学名为邻一,一二氯苯胺基一苯乙酸 钠,系非甾体类抗炎镇痛药,其主要作用为抑制环氧化酶的活性,从而阻 断 花生四烯酸转化为前列腺素口儿幻。同时,它也能促进花生四烯酸与甘油三脂三酰 甘油结合,降低细胞内游离花生四烯酸浓度,从而间接抑制白三烯的合成。双氯 芬酸钠具有使用剂量小、疗效高、不良反应少等特点。双氯芬酸钠缓释制剂除了 具有上述特点外还具有服药次数少、疗效持续时间长等优点,因此双氯芬酸钠缓 释制剂在医药市场上颇受欢迎,在临床应用方面具有广泛的应用前景口。本文采 用高效液相色谱一紫外检测法测定血浆中双氯芬酸钠的血药浓度,研究 双氯芬酸钠缓释片在体内的药代动力学过程,评价双氯芬酸钠缓释片受试制剂 与参比制剂是否具有生物等效性,为临床合理用药提供理论依据。 材料、对象与方法 一、试验材料、对象 、试验药品、试剂 受试双氯芬酸钠缓释片,规格: /片,批号:,山西亚宝 药业集团股份有限公司研制;参比制剂:双氯芬酸钠缓释片商品名:奥贝,规 格: /片,批号:,进口商品注册证号:,加拿大奥贝泰 克制药有限公司生产;双氯芬酸钠对照品,含量为.%,批号:., 由中国药品生物制品检定所提供;内标物:地西泮对照品,含量为.%,批号: .,由中国药品生物制品检定所提供;试验中所用甲醇、乙腈为色谱 纯,由山东禹王实业有限公司禹城化工厂生产;冰醋酸为优级分析纯,北京北化 精细化学品有限责任公司生产;醋酸钠为优级分析纯,沈阳试剂二厂生产;空白 血浆由中国医科大学附属第一临床医院提供;水为去离子水。 、试验仪器 高效液相色谱仪,包括:型液相色谱输液泵、型双波长紫外检测器, 美国公司产品;双通道色谱工作站,浙江大学智达信息工程有限公 司产品。电子分析天平,美国奥豪斯公司产品;.台式高速离心 机,长沙湘仪仪器有限公司产品;.型涡旋混合器,北京金北德工贸有限公 司产品;型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司产品;药物代 谢动力学统计软件,中国药理学会提供。 、受试对象 名男性健康受试者,年龄:岁,体重:.:.,身高:.. ,试验前经病史询问受试者无药物过敏史、无精神病史及其它慢性病史,试验 前天内未服用任何药物,在充分了解本试验的试验目的与方法以及可能出现的 药物不良反应后,受试者经临床体检和实验室检查符合试验要求,志愿接受试验 并签署知情同意书,经医学伦理委员会批准后进行的本次试验。 二、试验方法 、分组、给药与血样采集 名健康受试者随机分成两组一组,组,每组人。即一组先服用受 试制剂,后服用参比制剂;组先服用参比制剂,后服用受试制剂。两次给药间 ,试验当日晨空腹用 温开 隔时间清洗期为周。受试者试验前禁食 水送服药物。服药后 统一进低蛋白、低脂肪标准餐。试验期间,禁止任何剧 烈活动、吸烟、饮酒等。 单次给药:两组受试者分别服用受试或参比试剂 ,每组于给药前及给 药后.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.和. 采集上肢 , 静脉血 ,并立即移至经肝素处理的离心管中,混匀, ?,离心 分离血浆,于?保存待测。 多次给药:两组受试者分别服用受试或参比试剂每次 ,次/天,连续 天,分别在第、、天晨:服药前采血次,每次 ,供测谷浓度用, 以确证是否达到稳态。在多次给药达稳态试验的第天晨:服药后.,., ,处 .,.,.,.,.,.,.,.,.和. 采集上肢静脉血 理同上。 、溶液配制 容量 双氯芬酸钠标准储备液的配制:精密称取双氯芬酸钠 ,置 瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为双氯芬酸钠储备液 ?。, . ,置于 容量 冰箱。内保存备用。精密吸取双氯芬酸钠储备液 瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为储备液 ?,冰箱。保 存备用。 双氯芬酸钠标准溶液的配制:精密量取双氯芬酸钠标准储备液适量,用甲醇 稀释制成浓度分别为.、.、.、.、.、.、.和 . .?的双氯芬酸钠标准系列溶液,配制过程见表。 表,标准系列溶液的配制过程 容量瓶中,用甲 内标溶液的配制:精密称取地西泮对照品. ,置 醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为内标溶液 ?‘,冰箱?内保存备用。 、血药浓度测定的方法学考察与评价色谱条件 色谱柱: . ,岬,迪马公司产品;流动相:甲 醇:. ?.醋酸钠缓冲液:,~,冰醋酸调节 .;检测波长: 。 /;流速:. ?。;进样量:皿;柱温:室温;检测灵敏度:. 血浆样品处理 精密吸取血浆 ,加入内标地西泮溶液皿 ?,加入乙腈 , ?~,离心 ,涡旋振荡 ,取上清液皿进样。 专属性 在本试验分析方法条件下,测得空白人血浆、标准品血浆、受试者血浆的色 谱图,见图。试验结果表明,双氯芬酸钠和内标地西泮的保留时间分别为. 和. 。双氯芬酸钠分离基线良好,血浆中内源性组分对药物测定无干扰, 可确保分析方法的专一性。 ? ? ? ?一? ? ? 啪七? ? ??七 图,高效液相色谱图 舢空白血浆样品色谱图; 空白血浆中加双氯芬酸钠对照品嵋?。和内标物地西泮 ?。 色谱图; 单次给药组.受试者第小时点的色谱图。 标准曲线与最低检测限 精密吸取空白血浆皿,加入内标溶液 ,分别加入系列浓度的双 氯芬酸钠标准溶液止,制成相当于双氯芬酸钠浓度分别为.,., .,.,.,.,.,.嵋?以的标准系列血浆样品, 按血浆样品处理项下方法处理后进样,记录峰面积,以双氯芬酸钠浓度为横坐标, 双氯芬酸钠与内标物地西泮的峰面积比值为纵坐标,用最小二乘法进行线性回归, 所得的直线回归方程即为标准曲线。三天方法学确证的标准曲线回归方程结果见 表,标准曲线各浓度点测定值见表,典型标准曲线见图。双氯芬酸钠的线为 性范围为..鹏?~,定量下限 .昭?.,定量下限精密度和准确度考查见表。 表,法测定血浆样品中双氯芬酸钠的标准曲线参数表,法测定血浆样品中双氯芬酸钠标准曲线各浓度点的实测数据 图,法测定血浆样品中双氯芬酸钠的标准曲线 表,法测定血浆样品中双氯芬酸钠浓度定量下限. ?以准确度 和精密度考查结果 . . . . . . . . % .. % 精密度与回收率 按标准曲线与最低检测限项下的方法制成低、中、高三个浓度双氯芬酸钠浓 度分别为.,.和. ?的质量控制砌畸,样品,每 一浓度日内平行测定次,连续测定天,根据当日的标准曲线,计算样品 中双氯芬酸钠的实测浓度,从而计算日内、日间精密度和相对回收率。低、 中、 高三个浓度的双氯芬酸钠血浆样品日内、日间精密度均%,相对回收率为 .%.%。另用流动相配制相应浓度的双氯芬酸钠溶液,不经萃取直接 进样,记录双氯芬酸钠的峰面积,比较血浆样品和流动相样品的峰面积,计算 双 氯芬酸钠在血浆中的绝对回收率。低、中、高三个浓度的双氯芬酸钠血浆样 品绝 对回收率为.%.%。结果见表。 表,血浆中双氯芬酸钠的精密度和回收率结果 样品稳定性按上述方法配制低、中、高三个浓度双氯芬酸钠浓度分别为 .,. 和. ?。的样品,分别对室温放置稳定性室温放置,,, 、 长期冷冻稳定性?条件下放置,, 、冻融稳定性反复冻融次 进行考察。结果表明双氯芬酸钠标准血浆样品在室温条件下放置 稳定,在一 ?条件下放置天稳定,经过次冻融循环后稳定。结果见表、表、表。 表,标准血浆样品处理后室温放置小时稳定性考察结果 表,标准血浆样品一?条件下放置天稳定性考察结果 表,标准血浆样品经过三次冷冻.解冻循环后稳定性考察结果 血浆样品测定与质量控制 在血浆样品分析时,每一未知样品测定次,并在每一分析批内随行测定低、 中、高三浓度双样本的样品,样品数不低于未知样品总数的%,并均 匀分布于未知样品测定顺序中。根据标准曲线,求算样品和未知样品的浓度。 当样品高、中浓度点偏差%、区%,低浓度点偏差%、 ;%时至多允许有/的样品测定结果超过上述限度,但不得出现在 同一浓度的样品中,当批的未知样品测试数据方可接受。 统计学处理 将名健康受试者服药后各时间点的血浆药物浓度数据输入计算机,用 程序分别进行各项药代动力学参数的计算并对生物等效性进行评价。 结 果 一、血浆样品测定结果 、单次给药试验 名健康受试者单次给药后的平均血药浓度一时间曲线见图。 、多次给药达稳态试验 名健康受试者多次给药达稳态后的平均血药浓度一时间曲线见图。 ? ? ? 们 加 ,.凹\口。州?口。 / 图,名健康受试者单次给药后的平均血药浓度一时间曲线 ? ? ? 如 加 .,.?\州时。。。 / 图,名健康受试者多次给药达稳态后的平均血药浓度一时间曲线 二、药代动力学参数 名健康受试者单次、多次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂与参比制剂后的 主要药代动力学参数,见表、。 表,名健康受试者单次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂与参比制剂 后的主要药代动力学参数,士 表,名健康受试者多次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂与参比制剂每 天,连续天后的主要药代动力学参数, 三、生物等效性评价 、单次给药 、拥?妪经对数转换后进行方差分析和双单侧检验,结果见 表、。搬经检验,结果表明均无显著性差异,见表。.、 嘶和瓤的%置信区间分别为..%,..%, ..%。根据计算相对生物利用度,其计算公式为: 受试捌剂以~,比翻荆×%,所得结果为.:.%,该结果表明单次给药受试 制剂与参比制剂具有生物等效性。 、多次给药 鼢辎毅经对数转换后进行方差分析和双单侧检验,结果见表、。 缸经检验,结果表明均无显著性差异,见表。鹞、鹤缸的% 置信区间分别为.~.%,.~.%。。。曲采用实测值,站盯 %计算, 由公式豁吖。计算,由公式。。一一。。‖ 根据鹞计算为..%,该结果表明多次给药受试制剂与参比制剂具 有生物等效性。表,名健康受试者单次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参 比制剂的主 要药动学参数方差分析结果 .,.;.,. 表,名健康受试者单次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比制剂的主 要药动学参数双单侧检验和.置信区间法检验结果 .. 表,名健康受试者单次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比制剂的 一非参检验配对法结果 表,名健康受试者连续多次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比制剂 的主要药动学参数方差分析结果 .,.;.,. 表,名健康受试者连续多次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比制剂 的主要药动学参数双单侧检验和.置信区间法检验结果 . 表,名健康受试者连续多次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比制 剂的晦非参检验配对法结果 四、安全性评价 试验期间,名健康受试者均未发生药物不良反应,各项检查指标均正常。 讨论 目前进行生物等效性研究主要采用高效液相色谱法。高效液相色谱法具有灵 敏度高、分析速度快、分离效能好、重现性好、应用范围广等诸多优点阳。近年 来,随着高效液相色谱仪的改进,高效液相色谱法也日趋完善,现已成为药物分 析领域中最重要的、发展最快、应用最广的分析方法之一。此外,由于液相色谱 溶剂系统的优化,使得采用高效液相色谱法进行药物分析更为简便。本实验采用 高效液相色谱一紫外检测法砸对双氯芬酸钠缓释片的生物等效性进行评价。 在方法学考察过程中曾考虑用甲醇一水作为流动相,但双氯芬酸钠和内标的分 离度差,且两者的保留时间均较长,改用甲醇:. ?以醋酸钠缓冲液: .作为流动相,获得了较好的分离度和较短的保留时间。 ,~,冰醋酸调节 在血浆样品处理过程中,曾采用萃取法,但杂峰较多,干扰待测物质检测,故改用乙腈蛋白沉淀法处理血浆样品【,该方法操作简单、快速、准确,灵敏度好, 适用于临床药代动力学和生物等效性研究陋。考虑到该方法有可能会稀释血浆样 品,所以采用较小的蛋白沉淀剂用量乙腈:血浆:嘲。 双氯芬酸钠的多种剂型均有研究报道,但是目前研究的热点是对双氯芬酸钠 缓控释制剂的研究。缓控释制剂由于采用了新技术改变了其体内释放吸收过 程,因此有必要进行体内生物利用度比较研究,以证实其缓控释特征,并证实 其与参比制剂是否具有生物等效性。因此,在对缓释制剂进行生物等效性研究时 除要进行单次给药试验外,还要进行多次给药试验。多次给药比较符合临床给药 情况,其目的是要确定缓释制剂达稳态时的生物利用度和血药浓度的波动程度及 维持时间。实际上,缓释制剂的临床用药绝非单一剂量,而是反复服用几天甚至 几十天。因此考察其血药浓度达稳态时的生物等效性更具有实际意义们。 缓释制剂与普通制剂相比有许多优点,它能够控制药物释放速度,减少或避 免血药浓度的“峰谷’’波动,不仅能够使药物平稳、持续发挥疗效,还能够降低 药物的毒副作用。另外缓释制剂还具有提高患者用药顺应性,方便患者服药,增 加药物治疗稳定性的优点。当缓释制剂与其它药物联合应用时能够减少耐药性的 产生。 结论 依据上述试验结果,可以判定试验所用的受试制剂双氯芬酸钠缓释片山西亚 宝药业集团股份有限公司研制,规格: /片,批号:与参比制剂双 氯芬酸钠缓释片加拿大奥贝泰克制药有限公司生产,商品名:奥贝,规格: /,产品批号:,进口商品注册证号:在健康人体具有生物 等效性。?本研究创新性自我评价? 、本试验的受试制剂是尚未上市的一种新药。 、本试验除了进行单次给药试验外还进行了多次给药稳态试验。 ?参考文献? .& , ,伍? . .;:./. ? 【】.. .;: .. 吴敏,熊凤英.高效液相色谱法测定双氯芬酸钠缓释制剂的含量.中国医院药 学杂 志.;:?. 郭涛,郑春丽,李慧颖.双氯芬酸钠微丸人体内药动学.中国临床药学杂志.: . , . . .;:?.一 胡爱萍,胡国新,邱相君.反相高效液相色谱法测定人血浆中双氯芬酸钠的浓 度.温 州医学院学报.;:?. /.. . .;: ? .. 谢娟,周颖,刘玉旺,等.高效液相色谱一紫外检测法测定健康人血浆和尿中 法罗培南浓 度.中国临床药理学杂志.; :?. 杜迎翔,陈玉英,李康乐,等.双氯灭痛血药浓度的高效液相色谱分析.中国药 科大学 学报.;:?. 郭涛.新编药物动力学第版.北京:中国科学技术出版社.:.?综述? 乳腺癌耐药蛋白的研究进展 摘要:年研究发现了一种与肿瘤多药耐药相关的新的半转运体蛋白即乳腺癌 耐药蛋白,它是转运体超家族的成员,主要位于细胞的质膜。 在体内分布广泛,除了肿瘤组织外许多正常组织也有的表达。在多 药耐药,干细胞的表型,药物在体内的吸收、分布、代谢及预防内外源性毒素 对机体的影响等方面均发挥重要作用。为了更好地了解的功能,目前的研 究热点主要集中在对突变体的研究。另外,寻找安全有效的抑制剂 也越来越多的引起众多研究者的关注。 关键词:;突变体;耐药 年美国的三个研究小组分别从耐阿霉素的人乳腺癌细胞株./ 中发现了一种与耐药相关的半转运蛋白,因其首先是从人乳腺癌细胞中发现 的,故将其命名为乳腺癌耐药蛋白。随后的几年中又有几个实验小组将其 命名为耐盐酸米托葸醌蛋白唧、胎盘特异性蛋刍。由于基因结构 和基因序列的高度同源性,与糖蛋白和多药耐药相关蛋 属转运蛋白超家族,又因为它是转运蛋白超家族亚科的第二个成员, 故又将其命名为。 的基因定位及其结构 人类的基因位于,基因全长跨越,包含个外显子,个内含 子,外显子的长度.不等编码蛋白的外显子含有.个密码子, 内含子的长度.不等,甚至有的内含子的长度超过。所有的剪接点 符合左拼接剪接和受体位点的/原则.大多数位于一号外显子乜, 翻译起始位点位于二号外显子, 基序位于三号外显子,六号外显子除了 含 基序外还含有核苷酸结合域标记基序,、、、和号外 显子编码的跨膜结构域乜。位于转录起始位点上游 的序列具有启 动子的基本活性,基因的启动子无盒,具有、、位点,在 岛的下游有一个盒。截断突变报告基因活性测定证实,基因启 动子的’上游有正负调控元件存在乜】。最近的一项研究发现了一个新的元 件即雌激 素反应元件,在雌激素受体阳性的细胞,雌激素能够增加即的表 达。启动子的荧光分析显示,的突变或缺失能够削弱雌激素对其的作用。 电泳迁移率变动分析显示, 通过识别也能够特异性结合到脚,基因启动子 上。此外,有研究表明缺氧涉及.能够上调的表达。基因的启动 子没有血清效应元件,因此不是脂质转运体。对过度表达的药物选择 细胞进行研究,结果发现己基因具有多个转录起始位点,而且具有更有效地 翻 译对碘氧基苯甲醚的优势,一号外显子的变异提示基因存在选择性启动 子 结构和功能 特异抗体免疫印迹分析显示,是一个分子量为的膜蛋白, 其主要位于过度表达该转运体的耐药细胞的质膜?‘,细胞内也检测到有 的表达‘仲。序列分析显示是由个氨基酸残基组成的。与糖 蛋白口.和多药耐药相关蛋不同的是其独特的结构域组成。是由 一个.末端胞质核苷酸结合域四和一个.末端跨膜结构域组 成的半转运蛋白。其跨膜结构域含有个跨膜环,细胞外环上有.个.糖基 化位点,或。核苷酸结合域参与水解,个跨膜片段 参与药物结合和外排。目前认为位于第五跨膜片段的三个氨基酸残基.的 保守区域有可能参与二聚体的形成,果蝇属蛋白相应残基的突变能够破坏异 二聚 体的形成。通过转染技术研究了突变体、,结果发现位甘氨酸 对蛋白质运输是非常重要的,但是它是否参与同株异核生殖目前尚未得到证 明阴。 在不同的多重耐药细胞系中,具有不同的底物特异性。例如, 过度表达的. 和.?两株细胞能够有效的外排玫瑰精 和葸环类抗生素,而其他的过度表达的细胞系则不能。早期的大量研究证 实,底物识别的重要决定子是位氨基酸‘‘ ‘‘。例如,在 位点为精氨酸的野生型不能转运柔红霉素、玫瑰精和. 。相反,这些化合物能够被的突变体位精氨酸被苏氨酸和甘氨 酸所代替所转运凹。另一方面,一些底物例如盐酸米托葸醌、哌唑嗪、 盐酸己可碱既是野生型的底物也是两个突变体的底物凹?。最近的 一项研究证实?,野生型比突变体精氨酸被苏氨酸所代替更加 ,这项研究提供了直接的生物化学证据,的 位氨基酸对于底物识别是至关重要的。最新研究表明,的位氨基酸对 识别蛋白酶抑制因子有重要作用朝。推测位氨基酸位于接近胞质面的第 三个跨膜片段的羧基端,因此位的精氨酸是结合药物的可能结合位点。 既然精氨酸是一个带有正电荷的残基,那么药物结合域的一个荷电残基的缺 失可 能通过改变与底物之间的盐桥而改变底物识别。因此位于的荷电氨 基酸对的底物识别是非常重要的。但是最近的一项研究表明,位氨基 酸在底物转运和水解方面发挥重要作用,而在底物识别和结合方面作用不大 。另有一项研究结果表明,的药物转运和抑制效率不受药物结合的影响。因 此,位氨基酸究竟有何作用还有待进一步的研究。最近盯 利用基因工程技术研制了多种跨膜片段的突变体,并且检测了氨基酸置换对 所呈现的药物耐受的影响。他们的研究发现位于第二个跨膜片段的位 谷氨酸的置换可以导致对.和盐酸米托葸醌耐受的完全丧失。用突变体 转染细胞,使得位的置换成,与野生型蛋白相比,其表现出 同等的盐酸米托葸醌耐受能力,但是对.的耐受能力却大大下降。第位 氨基酸估计位于第五个跨膜片段内或附近。这些资料也有力地说明了药物结 合域 很有可能位于,因此跨膜片段内或附近的氨基酸对的底物识别是非常 重要的。有研究表明位氨基酸可能是一糖基化位点,糖基化位点对的 功能是否有影响目前还没有定论。 对不同种族来源的样品进行分析,以研究基因的自然变异,口钉胁 乜蛋白的和位发生改变,在亚洲人群中的发生频率可以达到 %.%,而在高加索和美非地区的发生频率相对较低。例如,对日本人群进行 研究,%.%是变异体杂合子,%是纯合子引。对中国人群进行研 究,%是杂合子啪,而其他的几个变异体例如、、 发生等位基因的频率不到%,钉妇除此之外,现在已经发现第四外显子的核苷酸多态性能够导致终止密码子位谷氨酰胺的置换啪 突变体、的体外功能鉴定得出两种矛盾的结论。一项研究表明, 在转染细胞低表达,与野生型细胞相比呈现低药物耐受啪,而突变体 的基因表达水平和药物耐受特性与野生型相似咖。另一项研究表明,、 的基因表达水平与野生型相比相差无几,但是与野生型相比两种突变体均表现极 低水平的药物耐受,与野生型相比能够增加药物蓄积,减少药物外流嘧。转运障 碍机制研究表明,的膜定位被破坏,的活性降低瞄一项 最新的临床研究表明,的多态现象与的一种底物的药 代动力学特性的改变有关。目前已经有种突变体的功能特性被研究,而 关于其他突变体的功能特性还没有报道。 通过转染实验,已经有越来越多的证据表明,或通过同型二聚体或通 过异二聚体发挥作用汹】枷。最近发现,可能通过二硫化物桥接的四聚体发 挥作用。一些资料表明,但目前尚未得到证实,作为单体发挥作用而不需 要二硫键的形成。因此,二硫键似乎在的功能和寡聚化中并不起着决定性 作用。汹最新报道,对的第一个跨膜片段中的序列进行突 变分析,认为序列参与一些蛋白的二聚化如糖蛋白、人类碳酸酐酶。 突变体、、/尤其是双重突变株失去了转运玫瑰精 的活性,转运盐酸米托葸醌、脱镁叶绿甲酯酸、的能力下降。 而且表达突变体的细胞用盐酸米托葸醌处理,使得蛋白表达增强。因此 序列对于跨膜序列的正确填塞/折叠和二聚化是非常重要的。 从过度表达的昆虫细胞、细菌、酵母细胞中分离得到的膜标本具有高 水平的活性‘拍九嗍。作为能量依赖性的药物流出泵,通过水解 来获得能量。对于糖蛋白来说,普遍认为底物激活与实际的转运过程相 关九。然而,来自不同实验室的最新研究表明,九的几个底物或者抑制 的活性或者对的活性没有影响。这几个底物没有一个能够增加 的活性。然而,它们却能够增加的突变体和的 的活性哺】。除此之外,底物能够增加在细菌中表达的的活性田。 因此,的水解和实际的转运过程是如何耦连的目前还不了解。值得注意的是, 通过研究哪些物质能够增加的活性,我们可以知道哪些是的底物, 哪些是的抑制剂。尽管的结构功能研究仍处于起步阶段,但是对于 的功能特性研究已经取得了实质性的进展。例如底物特异性、结合和 水解、突变分析。进一步的研究就是要清楚地了解转运药物的机制。 的单核酸多态性 对种不同种族的人群的进行系统扫描,以检测该基因的单核苷酸多 态性,到目前为止,从启动子、外显子、内含子的序列中已经发现多种非同义 和同义单核苷酸多态性其中,、发生的频率比较高,若发 生,转运体的功能和对抗癌药的敏感性也发生相应的改变,而且会出现断裂 蛋白表达口?。一项研究表明,的突变体对底物的处理存在个体差异, 这可能是由的基因型决定的嘞。事实上,的突变体的底物特 异性不同于野生型蛋白,正是基于此,有望被应用于基因治疗。啪 的最新研究,他将突变体作为选择标记,把其与一个治疗基因成功地 共转染入人类造血祖细胞,治疗基因能够矫正由于突变所引起的肉芽肿病。 突变 的蛋白选择性的保护转导细胞不受临床上所应用的细胞毒药物的影响。 组织分布,生理学和药理学功能 对哺乳动物组织中的进行和蛋白水平的定位研究,在免疫组织化 学检测和免疫印迹中应用单克隆抗体结果发现,许多正常组织中也存在着, 例如胎盘合胞体滋养层的顶膜、胆小管膜、小肠绒毛上皮的腔膜、结肠上皮 的腔 膜、心肌细胞膜、胰腺的内分泌细胞、静脉和毛细血管的上皮细胞嘲】。和 其他的药物转运体蛋白在组织分布和底物特异性方面均存在着重叠,因此可 以说 这些转运体存在着相似的生理学和药理学特性。实际上,与糖蛋白在若 干药理学领域的特性非常相似,它能够将一些细胞毒药物转运到细胞外,从 而使 这些细胞对化疗药物产生耐药。通过相同的转运机制,能够对底物的药代 动力学参数产生影响,例如肠吸收/生物利用度、肝/肾消除、血浆清除率。 能够保护一些敏感的组织、器官和细胞免受一些有害的外源性化学物质的损 害。 近年来关于的功能鉴定表明,能够转运大量的物质,从化疗药 物到有机阴离子共轭化合物。即使选择药物不是盐酸米托葸醌,许多过表达 的药物选择细胞系表达强的对盐酸米托葸醌的耐受性。而且过度表达的耐 药细胞或者转染了 的敏感细胞与亲本细胞或者转染了空载体的药物 敏感细胞相比,细胞内的药物浓度大大降低九九九。这些资料表明盐酸米托 葸醌是的高亲和力底物。氮杂蒽吡唑做为盐酸米托葸醌的类似物在 过表达的细胞系中,的表达与氮杂葸吡唑的浓度和耐受性存在明显的相关 性。 鼠类的各类造血干细胞表达是其的一个保守特性。在原始造血干细胞 高表达,随着分化其表达水平明显下调九。随后的研究证实汹,在 人类造血细胞有相似的分布。几项研究已经证实,区细胞上的能够将染 料烟酸己可碱泵出细胞外。迄今为止证实干细胞区只有表达而没 有其他转运体蛋白的表达。转运体能够使细胞具有表型,并且与 正常原始.造血干细胞的增殖活性有关。干细胞上的的生理功能目前尚 未充分阐明。目前的研究表明可能在干细胞分化和防御外源性化学物质方 面发挥作用。最近的一项研究发现了一个有趣的现象,用/和 一/一细胞做实验结果发现,分子卟啉对处于低氧状态下的一/一祖细 胞是有害的。特异性的结合,缺乏的细胞蓄积卟啉。有趣的是, 发现低氧能够上调的表达,似乎细胞能够利用而减少的聚集。 因此,使处于低氧状态下的细胞具有更强的生存优势。这些研究结果为我 们进行下一步的研究提供了启示,低氧也能够上调实体肿瘤的的表达。 的功能调节和临床意义 目前所知的抑制剂被分为四类:特异性抑制剂、既能抑制糖 蛋白又能抑制的化合物、黄酮类及其衍生物和其它靶点的抑制剂或是 的调节因子或是的底物。目前提出了几个有趣的的抑制剂, 一些特异性和抑制能力都很高,例如,它不但能够抑制药物转运也能够抑 制的活性,其它的可以被认为是多特异性抑制剂,例如,,它 抑制糖蛋白的能力更强一些。黄酮类,例如,白杨素的疏水衍生物。是高 亲和力的配基,它既可以作为抑制剂也可以作为被转运的底物,认为在使用 临床抗癌治疗中比糖蛋白的作用更强一些。然而,这些抑制剂相互作用的机 制目前还不是非常清楚。 除了机制和功能研究之外,另一个研究焦点就是要寻找抑制剂。由于 转运体在体内分布广泛,功能多样。抑制剂主要用于分子阻断 转运体的活性。的抑制剂能够通过改善吸收差的化疗药物的药物代谢动力 学参数而增加耐药细胞对该药物的敏感性。特异性的抑制剂用于的功能分 析,非特异性抑制剂抑制其它的转运体和生物转化酶可以作为克服肿瘤细胞 多 药耐药的工具,提高口服药的生物利用度?】。非特异性的抑制剂有一个优点, 就 是一个抑制剂能够同时阻滞两个组织分布和底物特异性重叠的药物转运体。 例如, 是一个高效的糖蛋白抑制剂同时也能够抑制。 新型细胞周期抑制剂一种烟曲病的真菌毒素非常适合于基础药理学研 究但却不适合用于临床研究,它能够有效的提高细胞内药物浓度,逆转过 表达细胞的耐药?。无毒剂量的能够影响糖蛋白和。由于具 有神经毒性作用而限制了它的体内应用,目前已经合成了许多类似物并进行 了体外实验。 是目前最有效的抑制剂,给小鼠口服或者腹腔注射大 剂量的 并未出现毒性反应?。香豆霉素、新生霉素和几个其它的化合物 能够部分逆转介导的多药耐药。然而,由于在体内分布广泛功能多 样,抑制剂全身给药能够产生广泛的作用并且可能产生意想不到的结果。 可能通过改变其它底物的药代动力学参数或者致敏受保护的细胞而产生细 胞毒性。因此,寻找非底物可能是合理化疗的一个安全有效的途径。 检测功能调节的方法有锤头核酶,干涉或者抗单克 隆抗体识别蛋白的外部抗原决定簇。 前景 由于在哺乳动物体内分布广泛,功能多样,因此已经引起从事 生命科学研究的各个领域研究者的关注。在化学治疗和药物代谢动力学方 面具有重要的临床意义。最新发现,在于细胞调节和预防缺氧方面发挥重 要作用,把的突变体应用于干细胞基因治疗,以期进一步了解该转运体的 功能和在优化治疗中所发挥的作用。 参考文献. .;:. , ., . .;:.., , : , . .;:?. /. , . // :. .; . , ,..;:?. .,. .;:.. . , .. .;: , . : , ..;:. , // , .. . // ; :.., , , , . , :. .;:. , ., . .;:. , . / . .;:?., . , 醇. .: :..廿 , . . . .;:., , , .; /. :.. ,, . ...;:. . /,? ,甜口. .;:. 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