利用高浓度乙二醇冷冻保存MMTV_Wnt_1转基因小鼠胚胎

利用高浓度乙二醇冷冻保存MMTV_Wnt_1转基因小鼠胚胎 第21卷第4期上海实验动物科学 V o l. 21, N o. 4 , 2001D ec 2001年12月 S h ang h a i L abora tory A n im a l S c ience 利用高浓度乙二醇冷冻保存 -- 1转基因小鼠胚胎MM TVW n t 孙 强, 王晓辉, 张 静, 李 莉, 薛整风, 李厚达 () 扬州大学比较医学中心, 扬州 225009 () 摘要: 本试验采用高浓度乙二醇 28作为胚胎冷冻保护剂, 以高浓度的半乳糖作为解 E G 冻稀释液, 对221 转基因小鼠的早期囊胚进行玻璃化冷冻保存。 结果在 22M M TV W n tE G 中平衡 4, 6 和解冻时间为 3, 5 时获得了最佳冷冻效果。 此条件下冷冻胚胎的 m in m in ( ) ( ) 总 回收率为 88. 61% 109ƒ123; 回收胚胎在体外发育率达 88. 99% 97ƒ109; 孵化率达 () ( ) 81. 65% 89109; 发育胚胎的移植出生率为 38. 36% 69181; 冷冻胚胎移植出生后经ƒƒ检测一半小鼠整合阳性。结果表明使用高浓度的乙二醇作为冷冻保护剂和以高浓度 PCR 的半乳糖作为解冻稀释液能有效地保存转基因小鼠胚胎。 关键词: 乙二醇; 转基因小鼠; 胚胎冷冻 () 中图分类号: 95233 文献标识码: 文章编号: 100428448 20010420205204 Q A 转基因技术自 1980 年问世以来, 作为一项鼠、大鼠、牛、羊、兔等十几种哺乳动物的胚胎冷 , 其中一些动物的胚胎冷冻技术已 冻获得成功改造遗传的现代生物技术, 经过十几年的发展, 经程序化, 并出现了商业化的胚胎冷冻试剂盒。 已被广泛地应用于遗传学、医学、药学和畜牧业 胚胎冷冻方法经历了缓慢冷冻法、常规快速冷等许多研究、生产领域, 而以转基因小鼠为技术 ( 冻法和超快速冷冻法 一步冷冻法和玻璃化冷 平台来研究人类的功能基因将是 21 世纪生命 ) 冻法三个阶段。 目前, 研究的焦点在于寻找效 科学的一个重要突破口。 但转基因模型又常常 1 果更佳的冷冻保护剂和简化冷冻程序上。 本室 会因为一些人为的或意外的原因丢失。 常规 曾报道成功地使用 30% 的乙二醇作为冷冻保 的种子保存方法由于要饲养大量动物而给保种 3 护剂对 转基因小鼠胚胎的冷冻保存。去HBV 工作带来很大压力, 因此为有效地保存基因资 年本实验室从美国引进了221 N IH M M TV W n t源, 建立一种快速、经济、可靠的转基因动物种 4 转 基 因 小 鼠, 该 小 鼠 使 用 的 是 近 交 品 FV B 质保存方法尤为重要。 2 系, 使用 30% 乙二醇作为抗冻保护剂, 效果不 1972 年, 等人利用二甲亚 W h it t in gh am 够理想, 本研究采用更高浓度的乙二醇, 并改蔗 () 砜 作为抗冻剂, 通过缓慢冷冻法对小DM SO 糖为半乳糖作解冻稀释液, 结果表明, 该体系可 鼠着床前胚胎进行冷冻获得成功。目前, 已有小 更加有效地对221 转基因小鼠胚胎 M M TV W n t 收稿日期: 2001205225 进行冷冻。 ( ) 作者简介: 孙 强 1973 - , 男, 硕士, 研究方向: 细胞 1 材料与方法 生物学和发育生物学. 联系作者: 李厚达1. 1 转基因小鼠胚胎的获得 选择整合为阳性的221 性成熟 冻。M M TV W n t () 雄鼠 , 由 李毅博士赠送与正常经超 1. 3. 3 解冻 将冷冻管从液氮中取出并迅速 FV B N IH ( 排处 理 间 隔 48 分 别 腹 腔 注 射 和置于 15, 20 ?水浴中, 使管内液体迅速解冻, h PM SG ) 各 5 的 雌鼠进行交配, 次日观察 H C G IU FV B 待液体呈流动态后, 以手指弹击冷冻管, 使半乳阴栓, 见栓者于 注射 84 后颈椎脱臼处 糖与 28 混和, 然后剪去两端将混和后的液 H C G h E G 死, 取出子宫, 用 冲洗并收集冲洗液于集体倒入予先放有约 200 半乳糖液的培养皿D PB S Λl 卵皿中, 在体视显微镜下收集子宫内形态正常中。 的囊胚, 移入新鲜的 中备用。1. 4 胚胎培养D PB S 1. 2 液体配制将经解冻稀释的胚胎吸出, 在中清洗 16 M 1. 2. 1 冷冻液的配制以 为母液分别数次后, 置于上覆石蜡油的 培养皿中, 在16 D PB S M (( ) ) 配制 2 乙二醇 22作为冷冻平衡液、 5% CO 2 , 37?下进行微滴培养 每滴约 20 Λl,ƒm o lL E G (() 8 乙二醇液 28作为冷冻保护剂。每滴胚胎数 10, 20 枚。 观察的发育和孵化 发 ƒm o lL E G ) 1. 2. 2 解冻液的配制以 为母液配制育至脱透明带数。 D PB S 1. 5 胚胎移植1. 7 m o lƒL 的半乳糖液作为解冻稀释液。 1. 2. 3 培养液 以 16 作为解冻后胚胎的体 1. 5. 1 假孕鼠 将正常 母鼠与结扎 M ICR ICR ()外培养液。 16 购至 公司公鼠 1?1 合笼, 第 2 天早晨检查阴栓, 见栓者 M S igm a 为假孕第 1 天鼠。 1. 3 胚胎冷冻和解冻程序 1. 3. 1 装管 如下图 1 所示, 装管操作为如 1. 5. 2 子宫角移植 选择假孕第 3 天的小鼠下: 用带有 16 号针头的 0. 5 注射器从冷冻作为受体, 进行子宫角移植, 每侧移植 6, 10 枚 m l ( 经培养 4, 10 后形态正常的解冻胚胎。16 M h 管 有 图 1 冷 冻 装 管 示 意 图 棉 塞 的 一 头 图 中 ( ) ) 0 , 先吸入一段 7 的半乳糖 图中 1; 接着 1. 6 统计分析cm 2 吸一段气泡后, 吸入约 0. 5 的 28, 以清洗用 系统对数据进行 独立性检验。cm E G SA S ς ( ) 管壁上粘附的半乳糖 图中 2; 然后再吸入一结果 2 段气泡, 接着再吸入约 0. 5 的 28, 移入胚 cm E G - 2 平衡对冷冻效果的影响EG () 胎 图中 3; 最后吸一段气泡, 并再一次吸入约 2. 1 (() ) 0. 5 的 28 图中 4后热封口 图中 5。 cm E G 本 实 验 比 较 了 胚 胎 经 22 平 衡 后 进 入E G 1. 3. 2 冷冻 速将装入胚胎并封口的冷冻管28 与不经 22 平衡直接进入 28 对冷冻 E GE G E G 2、3、4 段投入液氮中, 使胚胎在最短的时间冷效果的影响, 结果见表 1。 经 EG- 2 平衡与直接加入 EG- 8 冷冻效果比较 表 1 组别冷冻胚胎数回收胚胎数培养发育数孵化数 ()()()96 85. 71 27 28. 12 11 11. 46 不经 22 平衡 112 E G3 33 3 ()97 86 88. 66 () () 经 22 平衡71 82. 56 49 56. 98 E G 3 3 注: 括号内为相应百分数; < 0. 01, 与不经 22 平衡组相比。 P E G 从表 1 中可以看出, 虽然平衡与不平衡对果要优于不平衡。 ( ) 冷冻胚胎的回收率 88. 66% 85. 71% 没有显 2. 2 - 2 中不同平衡时间对胚胎冷冻效果的 v sEG 著差异, 但胚胎在进入 28 前先经 22 平衡影响 E GE G 的培养发育率和孵化率显著高于不平衡组, 分 在不固定解冻稀释时间的情况, 实验中先 ( ) ( 别 为 82. 56% 28. 12% 和 56. 98% 11.比较了在 22 中不同平衡时间对胚胎冷冻效 v sv sE G ) 果的影响, 结果见表 2。 46% , 这一结果表明, 经 22 平衡的冷冻效E G 图 1 冷冻装管示意图 表 2 不同平衡时间对胚胎发育影响 冷冻胚胎数回收胚胎数培养发育数孵化数平衡时间ƒm in ()()()1,98 87 88. 78 57 65. 52 49 56. 32 3 33 3()() () 95 84 88. 42 76 90. 47 65 77. 38 4, ( ) ( ) ( ) 6, 10 89 76 85. 3948 63. 1636 47. 37 3 3 注: 括号内为相应百分数; < 0. 01, 不同平衡时间之间比较 P 表 3 不同解冻时间对冷冻胚胎发育的影响 冷冻胚胎数回收胚胎数培养发育数孵化数解冻时间ƒm in ()()(),95 87. 96 61 64. 21 0108 53 55. 79 3 33 3()() () 109 88. 61 97 88. 99 123 89 81. 653, ()()()89 86. 41 52 58. 43 27 30. 34 103 5, 8 3 3 注: 括号内为相应百分数; < 0. 01, 不同解冻时间之间比较。 P 从 表 2 中 可 以 看 出, 22 中 平 衡 4, 6 E G 3 讨论 效果最好, 胚胎的发育率和孵化率分别达m in 51985 年 等R a ll 开发了胚胎玻璃化冷冻 90. 47% 和 77. 38% , 显 著 高 于 平 衡 1, 4 m in 保存技术, 最初主要以二甲基亚砜, 乙酰胺等为 和 6, 10 组。 m in 细胞内液抗冻保护剂, 由于其化学毒性较大, 在 2. 3 不同解冻稀释时间对胚胎冷冻效果的影 投入液氮前需阶段降温约 30 , 且浓度由低响 m in 到高, 从而使操作过程变得复杂, 不利于推广。在固定了平衡时间为 4, 6 的条件下,m in 本试验采用分子量小, 而渗透压强, 化学毒性较 实验中又比较了解冻时, 在半乳糖稀释液中停 ()低的乙二醇为细胞内液抗冻保护剂, 急速冷却 留不同时间对冷冻胚胎发育的影响, 表 3。 后溶液的粘度增加, 迅速形成玻璃化状态, 抑制 从表 3 中可以看出, 解冻时间在 3, 5 m in 了冰晶的形成, 可以达到胚胎的超快速冷冻, 整 胚胎培养发育率和孵化率显著高于解冻时间为 个冷冻过程仅持续数分钟, 且实验所需设备简 0, 3 和 5, 8 , 说明解冻时, 在半乳糖 m in m in 单, 有利于大规模推广应用。 稀释液中停留时间在 3, 5 有利于胚胎解m in 胚胎的毒性试验证明, 乙二醇对胚胎的化冻后的发育。 学毒性较低, 当胚胎在 10% 溶液中平衡 20 2. 4 解冻后胚胎移植效果E G 6 ( ) 实验中将经最佳程序冷冻解冻后回收的形 , 其 囊 胚 发 育 率 不 变 100% 。 但 是, 在m in 中随着平衡时间的延长, 对胚胎的化学毒 态正常的 181 胚胎移植给 12 只假孕母鼠, 其中 E G 7 10 只怀孕, 共产仔 69 只, 产仔率为 38. 36% 。害作用增大。 为此本试验摸索了胚胎在低浓 ( ) 3 移植出生小鼠的 整合检测度乙二醇 22溶液中的最佳平衡时间, 结果 PCR E G 表明 4, 6 可使乙二醇缓和并充分地渗透对冷冻移植出生的小鼠, 在 21 日龄剪尾, 抽 m in ( 提组织, 检测。结果表明 66 只 其中有到细胞内部, 达到最佳发育效果。为减少高浓度DN A PCR ) () 的乙二醇 28对胚胎的毒性作用, 我们采用 3 只在断奶前死亡被检小鼠中有 31 只阳性。E G 2 W h it t ingh an D C , L e ibo SP , M azu r P. Su rv iva l o f ( ) 短 时间 20, 30 平衡后, 即迅速投入到液氮 s - ?269196? and - m o u se em b ryo s f ro zen to 中。这有效地提高了冷冻胚胎的解冻发育率。解 [J . Sc ience, 1972, 178: 411- 414. 冻也是胚胎能否正常发育的一个非常关键的因 3 李劲松, 孙 强, 巢琴美, 等 . 2转基因小鼠快HBV C 素, 因此本试验也摸索了胚胎在解冻稀释液中 中 国 实 验 学 杂 志,速 胚 胎 冷 冻 方 法 的 建 立 [J . 停留的不同时间对胚胎发育效果的影响。 结果 () 2001, 11 1: 44- 46. 表明, 3, 5 的稀释停留时间不但能够比较 m in 4 , , . 2L i Y H ive ly W P V a rm u s H EU se o f M M TV 彻底地解除细胞内的抗冻保护剂乙二醇的毒 21 W n tt ran sgen ic m ice fo r study ing th e gene t ic ba2 害, 且也使自身对胚胎的毒害作用达最小。() 19 8: sis o f b rea st cance r [J . O nco gene , 2000 , 1002- 1009. 结论 5 2, . R a ll W F F ah y GM Icef ree c ryop re se rva t io n o f - 196? . [ ,m o u se a t by v it r if ica t io nN au re J 胚胎在 2 ƒm o lL 乙二醇中平衡 4, 6 ,m in 1985, 313: 573- 575. 加入 8 乙二醇后平衡 20, 30 即迅速ƒm o lL s 朱士恩, 曾申明, 张忠诚, 等. 小鼠胚胎玻璃化冷 6 投入液氮中, 并以 1.半乳糖液解冻稀 7 m o lƒL 冻 保存及保存时间对其体内外发育率的影响 [. J () 中国畜牧杂志, 1998, 6: 5- 8. 释液, 胚胎在解冻液中稀释停留 3, 5 m in 液, , , , . Ka sa iM Kom i jH T ak ak am o A e t a lA sim p le 这样的操作程序对冷冻保存221 转 M M TV W n t7 m e tho d fo r m o u se em b ryo c ryop re se rva t io n in a 基因小鼠胚胎取得了最佳操作效果。 low to x ic ity v it r if ica t io n so lu t io n, w itho u t app re2 参考文献: 1990, c iab le lo ss o f v iab ility [ J . J R ep ro d F e r t, 1 李劲松, 成国祥, 李厚达, 等. 胚胎冷冻技术在转基 89: 91- 97. 生物技术, 1996, 6: 1- 4.因动物中的应用 [J . -- 1 Cryopre serva t ion of MM TVW n tTran sgen ic M ice Em bryo by U s in g H igh Con cen tra t ion E thy len e Glyco l 222, , , , , SU N Q ian gW A N G X iao h u iZhA N G J in gL I L iXU E Zh en gfen gL I H o u da(), 225009, T h e C om p a ra t iv e ly M ed ic in e C en te r of Y a n g z h ou U n iv e rs ity Y a n g z h ou C h in a () ( : 28, 8 ƒ1. 7 A bstra c tT h e h igh co n cen t ra t io n e th y len e g lyco l E Gm o lL an d ga lac to se ) ƒm o lL w e re u sed a s a c ryop ro tec tan t an d th aw in g d ilu en t s fo r em b ryo c ryop re se rva t io n 221 . b y v it r if ica t io n in M M TV W n tt ran sgen ic m iceT h e b e st re su lt s o f c ryop re se rva t io n ( ) 22 2ƒ, 6 4w e re o b ta in ed if tho se em b ryo s k ep t b a lan ce in E Gm o lm in u te b efo re L fo r 3, 5 . f reeze an d th aw in g m in u te in ga lac to seT h e p e rcen tage o f em b ryo s c ryop re se rved ( ) ( ) 61% 109123; ƒ88. 99% 97ƒ109 an d re t r ieve is 88. th e re is o f th e se em b ryo s deve lop ( ) 81. 65% 89ƒ109 . an d deve lop in gto h a tch b la sto cy st sA f te r th e se deve lopm en t em 2 ( ) , 38. 36% 69ƒ181, b ryo s w e re t ran sfe r to p seu do cye sis m o u sedeve lop ed to live yo u n g . an d a h a lf o f th e se is po sit ive m o u se o n th e PCR te stIt fo llow s th a t h igh co n cen t ra t io n e th y len e g lyco l an d ga lac to se a s a c ryop ro tec tan t fo r c ryop re seve ra t io n b y v it r if ica t io n is .effec t ive Key word s: E th y len e g lyco l; T ran sgen ic m ice; Em b ryo c ryop re se rva t io n