新生大鼠缺血缺氧性脑损伤与bcl—2基因表达的关系

新生大鼠缺血缺氧性脑损伤与bcl—2基因达的关系 新生大鼠缺血缺氧性脑损伤与bcl—2基因 表达的关系 JournalofQiqiharMedicalCollege,2007,Vo1.28,No.1 新生大鼠缺血缺氧性脑损伤与bc1—2基因 表达的关系 王煜霞李光华黄青松常全忠 【摘要】目的通过研究新生大鼠脑缺血时bcl一2基因在海马区的表达特点,探讨bcl一2基因表 达与缺血缺氧性脑损伤的关系.方法54只7日龄新生SD大鼠随机分为1个对照组和8个实验组. 给动物吸入含有92氮气和8氧气混合气体建立新生大鼠HIBD动物模型,分别在脑损伤后不同时 间点(0.5,1,3,6,12,24,48,72h等)断头处死动物,取海马组织,用免疫组织化学方法检测海马脑神经 细胞凋亡及bcl一2基因表达情况.结果海马区bcl一2蛋白阳性细胞在HIBD后立即出现,6h达到 高峰,之后渐下降.结论bcl一2基因强表达于海马缺血区和缺血周边区的神经元,与神经元的存活 或死亡有一定联系. 【关键词】新生大鼠脑缺氧缺血bcl一2基因细胞凋亡 TheExpressionofbcl—— 2GeneinHippocampusofHypoxicIschemicBrainDamageWangYuxia,e1.a1. (SchoolofBasicMedicineofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003China) [Abstract]ObjectiveTostudytheeffectofbcl一2geneincellapoptosisbyobservingtheexpres— siouofbcl——2geneinhippocampusofhypoxicischemicbraindamage.MethodsFifty—fourneonatal ratswereusedinisham—— operatedgroupand8trialgroups.ThemodelsofHIBDwereestablishedin neonatalratsbyinhalingthemixedgasesof92%N2and8O2,andtheanimalswereSacrificedb ydislo— cationtheirheadsatdifferenttimemorphologicalanalysis.ResultsTheapoptoticcellsappear edatthe timepointof3h.andreachedthepeakat48h.thendecreased.thepositivecellofbcl一 2proteinincreased fromthetimepointof30minandreachedthepeakat6handthendecreasedgraduallyfollowing HIBD. ConclusionsTheexpressionofbcl一 2geneinhippocampusisstrongerthanotherareasofbrain,and thereisrelationshipbetweencellapoptosisandbcl一2gene. [Keywords]NeonatalratsHypoxicischemicbraindamagebcl——2geneCellapoptosis 新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxicischemie braindamage,HIBD)可导致的继发性神经元死亡, 丢失与细胞凋亡,是严重影响患儿生存与智力发展 的一种疾病.本研究用新生大鼠HIBD模型,采用 免疫组化法来研究Bcl一2基因在缺氧缺血(HI)后 脑海马区组织中表达的动态变化,探讨bcl一2基因 在缺氧缺血性脑损伤后神经元凋亡中的作用,为儿 科医生对缺氧缺血性脑损伤的新生儿临床康复治疗 提供理论依据. 1材料与方法 1.1实验动物与分组7日龄SD大鼠72只(由新 乡医学院实验动物中心提供),体质量(14_-4-1.8)g, 雌雄兼用,随机分为1个对照组和8个实验组,每组 8只.对照组只做颈部手术,不结扎血管,不做缺氧 缺血(hypoxiaischemia,HI)处理. 1.2试剂TUNEL细胞凋亡染色试剂盒和bcl一2 作者单位:河南新乡医学院病理生理学教研室(王煜霞);机能实验室 (李光华,常全忠);微生物教研室(黄青松) 邮编453003收稿日期2006—06—12 基因表达染色试剂盒均为Santacruaz产品.辅助试 剂有磷酸缓冲液(PBS),蛋白酶K,二氨基联苯胺 (DAB)等,均由北京中山生物技术有限公司提供. 1.3方法 1.3.1HIBD动物模型建立1)按照文献动物仰 卧于手术台上[】],固定其四肢,行颈部手术,用丝线 结扎右侧颈总动脉,消毒缝合切口,放回原饲养环境 中恢复2h.置动物于2000ml密闭容器中,以2l/ min通人含有92氮气和8氧气混合气体,持续2 h.2)标本与切片的制作:对实验组动物分别在 HIBD后0.5,3,6,12,24,48,72h时间点断头处死 动物,迅速取出大脑,分离HIBD侧海马,置4甲醛 溶液中固定12h,石蜡包埋,6m切片,脱蜡至水,贴 片,干燥后置4?冰箱保存备用. 1.3.2免疫组织化学染色取各时间点连续切片 各两张,分别按照试剂盒说明,一张进行TUNEI染 色,另一张进行bcl一2的ABC试剂染色.在4O× 光学显微镜下观察,拍照. 1.3.3阳性细胞判断计数根据显色的强弱,将免 疫组织化学染色的结果分4级一一0:阴性;+微弱; 齐齐哈尔医学院2007年第28卷第1期 (++)中等阳性;(+++)强阳性.在4O×放大倍 数下进行,用计数器计6个视野,计数平均阳性细胞 数/mm. 1.4统计学处理各组间凋亡细胞数和bcl一2阳 性细胞数用单因素方差分析,组问用q检验分析. 凋亡细胞变化与bc1—2关系用直线回归分析,P< 0.05为有显着差异. 2结果 新生大鼠HIBD后12h小时在海马脑区处见到 阳性细胞;HI后48,72h达高峰,即有凋亡特征(胞 体缩小,核固缩,核碎裂,凋亡小体形成)的阳性细胞, ? 15? 又有坏死特征(胞体较大,核膜及核仁不清或浅染的 无凋亡小体)的阳性细胞.bcl一2阳性细胞出现较 多时,TUNEI染色阳性细胞出现较少;反之,bcl一2 阳性细胞出现较少时,TUNEI染色的阳性细胞出 现较多(见图1,2).TUNEL染色的阳性细胞数与 bc1—2蛋白阳性的细胞数在HIBD后的不同时间点 出现分别有显着差异,FTUNEL一334.0,PTUNEI <O.01;Fbc1—2—42.7,Pbcl一2<0.01.凋亡阳 性细胞出现与bcl一2蛋白表达在l2h呈负相关 (y一一0.79,P<0.05).HIBD后0.5,12h. bcl,2蛋白表达越多,阳性凋亡细胞越少(见 表1). 表1各组海马脑区阳性凋亡细胞的E较(?,个/ram) 图16hbcl一2和TUNEL染色 图212hbcl一2和TUNEL染色 3讨论 已知凋亡是一种在形态及生化特征上与坏死完 全不同的形式,是由一系列基因控制的主动死亡过 程,动物实验显示,HIBD后各脑区均有细胞坏死与 凋亡产生,以海马CA1区最严重[.一.正常情况下, 中枢神经系统内有不同程度bcl一2基因表达,表达 产物为bcl一2,是目前被公认的一种抗凋亡基因引 本研究也表明,全脑缺血后,在易受损的海马CAl区 神经元bcl,2的表达非常微弱,而存活的CA3区 神经元全表达bcI一2蛋白,表明bcl一2抑制细胞凋 亡,故诱导表达于存活的细胞中,上述研究结果一 致.而且本研究利用新生大鼠HIBD动物模型,系 统地观察分析了bc1,2基因表达产物的动态变化与 细胞凋亡之间的关系.结果HIBD后1h之内未见 阳性凋亡细胞出现,3h后开始增多,48h达高峰. 而bc1—2蛋白阳性细胞的出现则在HIBD后即出 现,12h后开始下降,72h时下降至低水平.HIBD 后24h内各时间点阳性凋亡细胞出现与bcl一2蛋 白出现呈负相关.bcl一2基因表达主要出现在 HIBD后早期,12脑神经细胞具有保护作用.故我 们认为外界干预可使细胞bcl,2基因表达增强,抑制 缺氧缺h后bcl一2基因表达减弱,凋亡细胞大量出现, 进,步提示bcl一2基因表达对HIBD损伤的血性脑损 伤后迟发性神经元死亡,这为临床上对缺氧缺血性脑损 伤的新生儿临床康复治疗干预提供了新的思路. 激活bcl一2基因激活的机制目前尚不清楚.有 研究认为bcl一2基因的羧基端附近有疏水的氨基酸 组成的跨膜结构域,为整合膜蛋白,其疏水层端可插 入膜而发挥其调节凋亡的作用.最新研究提示诱导 核基因转录的核因子(NF)中NFKB对bcl一2基因 的激活可能起重要作用3]. ? 16? 丹参 JournalofQiqiharMedicalCollege,2007,Vo1.28,No.1 注射液对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用 王睿徐长庆王伟 【摘要】目的观察丹参注射液(SalviaeMihiorrhizaeinjectionsSMI)对阿霉素 (Adriamycin, ADR)诱导大鼠心肌细胞损伤的保护作用并探讨其作用机制.方法将培养72h以后 的新生Wister乳 鼠心肌细胞随机分为正常对照组,ADR损伤组和SMI小低,中,高剂量保护组,继续 培养24h后,测定 培养基中乳酸脱氢酶(IDH)释放量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含 量及心肌细胞超微 结构.结果ADR(终浓度为1mg/L)可致培养基中LDH释放量增加(P<0.01),MDA 含量升高(P <0.05)而SOD活性下降(P<0.01).SMI中剂量(50umol/L)即可降低培养基中 IDH释放量(P< 0.01),降低MDA含量(P<0.01)而增加sOD活力(P<0.01),心肌细胞超微结构基 本恢复正常.结 论SM能够保护ADR引起的心肌细胞损伤,其机制可能与其减少氧自由基生成有 关. 【关键词】丹参注射液阿霉素心肌细胞氧自由基 ProtectionEffectofSaiviaeMiitiorrhizaeInjectionontheMyocardiumCellInjuryInducedb yAdriamycin WangRui,a1.(HarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150086China) [Abstract]0bjectiveToobservetheprotectioneffectanditsmechanismsofSalviaeMihiorrhi zae Injection(SMT)onmyocardiurncellinjuryinducedbyadriamycin(ADR).MethodsTheneo natalWistar ratscardiom'yocytesculturedfor72hoursweredividedintothreegroups:normalcontrolgro up,ADR damnifiedgroupsandgroupsofSalviaeMiltiorrhizaeInjectionforlittle,middleandhigherdoses.After 24hours'furthercultivation,thereleasecontentofcellculturemediumlactatedehydrogenase(IDH), malondialdehyde(MDA)content,theactivityofsuperoxidedismutase(SOD)anduhrastructureofmyo— cardiumeellweredetermined.ResultsADRincreasedthereleasecontentofIDH(P<0.01),in— creasedthecontentofMDA(P<0.05)andtheactivityofSOD(P<0.01)intheculturemedium.The middlequantityofSMI(50umol/I)decreasedthereleasecontentofIDH(P<0.01),decreasedthecon— tentofMDA(P<0.05)andincreasedactivityofSOD(P<0.01)intheculturingmedium,theultra— structureofmyocardiumrecoveredtothenormal1evelgenerally.ConclusionsSMIcanprotecttheMyo— cardiumCellfrominjuryinducedbyADR,themechanismha8relationshipwiththereductionofoxygen freeradica1. [Keywords]SalviaeMihiorrhizaeInjectionAdriamycinMyocardiumcellOxygenfreeradical 阿霉素(Adriamycin,ADR)属葸环类抗癌药,临 床上广泛用于白血病,淋巴瘤,硬癌等肿瘤的治疗, 效果显着?.但由于ADR具有心肌毒性,使其临床 基金项目:齐齐哈尔市科技攻关计划项目(SFG06一O4),黑龙江省卫 生厅指导项目(2006419) 作者单位:哈尔滨医科大学硕士研究生,现在齐齐哈尔医学院病理生 理教研室(王睿) 牡丹江医学院(王伟) 通讯作者:徐长庆哈尔滨医科大学 邮编150086收稿日期2006—11—05 应用受到限制.以往的研究表明:ADR心肌毒性作 用与自由基生成有关J.对ADR所制的心肌毒性 的研究,目前尚缺少理想的防治药物.丹参(Salvia mihiorrhizaBge)为唇形科多年生草本植物丹参的 根及根茎.具有淤血止痛,活血通经,清心除烦,养 神定志之功效.丹参注射液(SalviaeMihiorrhizae injectionsSMI)为其经提取制成的灭菌水溶液,具有 保护心肌,清除自由基,抗脂质过氧化等作用,被广 泛应用于冠心病,心肌梗塞,心绞痛等心血管疾病的 我们将在以后的研究中进一步探讨和明确bcl 一 2在HIBD后神经细胞的死亡中的作用,在分子水 平上揭示其发病机制,以期对临床新生儿缺氧缺血 性脑损伤的临床康复治疗提供有效的理论依据. 参考文献 [1]付雪梅,李炜如,姚裕家,等.缺氧缺血性脑损伤新生猪:马皮层 细胞色素c素化酶活性变化[J].实用儿科临床杂志,2004,19 (2).98一】OO [2] [3] [4] 赵仕福,蔡文琴.脑缺血过程中淋巴细胞瘤一2基因家族的表达 及与细胞死亡的关系[J].解剖,1998,29(2):191—202 董艳臣,常全忠,张淑玲.新生鼠缺氧缺血性脑损伤脑细胞凋亡 的研究[J].新乡医学院,2000,17(2):87—89 Albetlor(G.(:haraterizationofthemoleculareventsfollowing impairmentofNFKBdriventranscriptioninneurons[J_].Mol BrainRes,2002,lO9:179—188