胸腺素α1胸腺五肽融合肽的制备、体内外免疫调节与辅助抗肿瘤作用及与TLR2结合性质的研究（可编辑）

胸腺素α1胸腺五肽融合肽的制备、体内外免疫调节与辅助抗肿瘤作用及与TLR2结合性质的研究（可编辑） 分类号: 单位代码: 密级:公开 学 号: ?‖菇办耄 博士学位 论文题目:胸腺素卜胸腺五肽融合肽的制备、 体内外免疫调节与辅助抗肿瘤作用 及与结合性质研究 删加 ,刷”豫. .作者 姓 名 李娟 学院 名 称 药学院 业 专 名 微生物与生化药学 称 指导 王凤山教授 教 师 合作 导 师 年月日原创性声 明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论 文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 期: 论文作者签名: 趁: 蕉翻 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名:答娲导师签名:山东大学博士学位论文 目录 中文摘要??. 符号说明第一章前言? 胸腺五肽? .胸腺五肽的起源与发展? .胸腺五肽的结构与性质? 胸腺五肽的生物学功能? .胸腺五肽的临床应用.胸腺五肽的受体研究胸腺素??一 .胸腺素的起源与发展.. .胸腺素的结构与性质.. .胸腺素的生物学功能.. .胸腺素的临床应用?一 .胸腺素的表达.. .胸腺素的受体研究 胸腺五肽存在的问题及改进方法?. 本课题的设计思路及拟解决的问题??一 第二章内含肽介导的.表达及分离纯化? 实验材料.菌株及质粒. .试剂与材料. .仪器设备.培养基.溶液配制? 实验方法?.. .大肠杆菌表达质粒..的构建?. 山东大学博士学位论文 .目的基因的构建??. .目的基因的克隆? .表达.. ?的大肠杆菌菌株构建? . . .在大肠杆菌中的诱导表达?. .从细菌裂解上清中纯化 .融合肽 .从包涵体中纯化.融合肽??.. .纯化样品.的鉴定 实验结果?。 . 阳性转化子的筛选 .表达质粒..的测序验证. .阳性菌株的鉴定 .从细菌裂解上清中纯化.融合肽.从包涵体中纯化.融合肽. 脱盐纯化 .一 . .的.鉴定 讨 论?...?.......??........................................??. ?.........?.??............; 结论?. 第三章胸腺融合肽.体内外免疫调节活性的研究 实验材料.试剂与材料 .仪器设备?. .实验动物? .溶液配制? 实验方法?.. . .法测定.对小鼠脾淋巴细胞的作用.流式细胞术检测.对小鼠脾 淋巴细胞表达的作用. 检测.对小鼠脾淋巴细胞.表达的作用一 . .对诱导的免疫抑制的影响 实验结果山东大学博士学位论文 . 【.对小鼠脾淋巴细胞增殖影响?.. . .对脾淋巴细胞表面表达的作用.. . .对脾淋巴细胞吖表达的作用 . .抵抗诱导的免疫抑制的作用??.. 讨论?. 结论?. 第四章.辅助抗肿瘤作用研究. 实验材料 .试剂与材料. .仪器设备 .实验动物?一 .溶液配制?一 实验方法 . .体外对肿瘤细胞生长的抑制作用的研究??. . .体内联合抑制黑色素瘤生长的研究??. 实验结果. .体外对肿瘤细胞生长的抑制作用??. . .联合对肿瘤生长的抑制作用??. . .逆转诱导的白细胞数量减少的研究 . .联合对肿瘤组织 表达的影响??. . .联合对肿瘤组织中细胞浸润及表达的影响讨论?. 结论?. 第五章.与结合活性研究?一 实验材料.试剂与材料. .仪器设备?. .实验动物?. .溶液配制 山东大学博十学位论文 实验方法?.. . .、及的标记??. . 的分离及培养? .荧光显微镜观察多肽与的结合??。 .激光共聚焦显微镜观察多肽与的结合??一 . 分析多肽与的结合性质研究 实验结果.荧光显微镜观察.与的结合. .激光共聚焦显微镜观察.与的结合. . 检测.和的结合讨 论.....?.............................................?..... ....??..........?.??. 结论.. 总结与展望?. 全文总结?.. 创新点??. 展望。 参考文献??. ...?.......................?...??..?......?.??........?.....?.?.?.........?.?... ...?.............................??.?.......?.?..........?...............?.??.. ....................................?..??....?.??........?.........?..?....?...致谢?. 博士期间发表的论文 山东人学博十学位论文 ........................??..........?........?.?.........?.??....??.:??.........??.......?.?.?...................??..........?..........?.?...........?...... ...?.??.....?.................?..........?.?......?..??...... ..?...................?..............?.........?.?.......?.?...... . .?.......?............?............?......?..??.....?.??.... .?.?..?..................?.............?............?..??.... . . .?...................??......................?.?.....?...?...... . ......?.??...?................?............?.........??......?...??... ......??.?...................??..........?.........??.......?..?...... .??. .?.?...................?..........?............??......?..??....?.....................??.........?........?.?.............?...... . .. ?.?..??..?.........?.............?......?..??.....?..??... .?.. .............?...........?...........?.?.....?..??...?.........?.?.?... ..?..?....................?..........?.........?.?..........??.... .... .?.. . 一??.. 山东人学博学位论文 . ?..?..??. ? 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.??...?.....?.?..........?............?......??.............?... 山东大学博士学位论文 胸腺素仅.胸腺五肽融合肽的制备、体内外免疫调节与辅助抗肿 瘤作用及与结合性质研究 中文摘要 恶性肿瘤致死率高,是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的 主要疾病 之一。目前,临床上主要采用的非手术治疗手段有化学治疗、放 射治疗等,但 这些手段在治疗肿瘤的同时也使患者的免疫功能受到严重破坏。因此,寻找能 够在肿瘤治疗中提高机体免疫功能的免疫调节剂具有重大的社会和经济意义。 胸腺五肽,和胸腺素,是从胸腺中获 得的两种多肽,二者具有相似的免疫调节活性,是重要的免疫调节剂,已成功 用于临床肿瘤辅助治疗,能提高化疗或放疗病人的免疫应答及耐受性,抑制或 降低病情的进展或复发,延长病人的生存期,提高病人的生活质量。但是, 的体内半衰期/很短,人体内药代学研究发现的/只有。需要频 繁的给药才能维持疗效。的体内,较长约为,但目前主要以化 学合成的方法生产,价格昂贵,难以被广大患者所接受。 为了提高的活性,延长其体内,/,本课题组已将具有相以生物活性与 临床用途的和借助基因工程方法连接在了一起,在毕赤酵母 中表达制备了融合肽.。研究证实.具有比更强的体 外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖及体内促进巨噬细胞吞噬的能力,.也具有比 及更长的体外血浆,。但是,.经 分泌表达的 量很少,无法满足进一步体内试验研究的需求,并且需要凝血酶切割去掉融合 标签,纯化成本高,纯化步骤繁琐。切割后,.的端带有个多余的 氨基酸残基,端带有多余的个氨基酸残基,可能存在免疫原性。 故为了提高产量并降低纯化成本,本课题换用大肠杆菌表达体系,采用内 含肽介导的纯化系统,加入二硫苏糖醇诱导内含肽自切割,分别从细菌 裂解上清及包涵体中纯化.。考察.是否具有比及更强 的体内免疫调节活性及辅助抗肿瘤作用,并进一步采用表面等离子共振技术山东大学博十学位论文 研究.与样受体毪的结合情况,为将.开 发成一种新型的免疫调节剂提供重要的基础与依据。 本课题的研究内容及取得的主要成果有以下几个方面。 在大肠杆菌中的表达及纯化 采用大肠杆菌表达系统对.进行了融合表达。选用作为表达 载体,将.基因插入至内含肽 基因的端, 基因 的端与几丁质结合域 ,相连,构建重组质粒 .,转入. 中诱导表达重组蛋白。超 。. 声裂解菌体后?考察重组蛋白的可溶表达情况。考察不同诱导温度及 诱导剂异丙基硫代一?一半乳糖苷浓度对重组蛋白可溶表达量的影响。 采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,加入?诱导柱上自切割,从而释 放.。为了提高.的产量,也从包涵体中纯化了.。摸索了 包涵体的沈涤条件,采用直接稀释法对包涵体蛋白.. ?进行 复性,并考察还原剂和氧化剂的比例、.精氨酸及最终尿素的浓度 对复性效率的影响。复性后的蛋白过亲和层析柱,加入诱导柱上自 纯化并脱盐后,. 切割,从而获得.。.进一步经 鉴定其分子量的正确性。?.鉴定.的纯度。 结果显示,.成功在. 中表达,融合蛋白部分以包涵体 的形式存在,诱导温度由?降低至?时可使可溶蛋白的表达量由原来的 .%增加至.%,而浓度由/降至./对可溶蛋白表达 量影响不大。复性体系中还原剂和氧化剂的比例为:.、尿素终浓度为 ./时复性效率最高。?的加入对复性效率影响不大。 .,从包涵体 进一步纯化和脱盐后,从菌体裂解上清中获得了约. ?。.分别鉴定分子量,发现与理论值相当 中获得了约. .,..检测.的纯度大于%。最终我们运 用此方法从每发酵液中得到了约..。 .体内外免疫调节活性研究 采用.法测定了.对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用,采用流 式细胞术考察了.对小鼠脾淋巴细胞表面分子表达的促进作用, 山东人学博十学位论文 采用技术检测.对小鼠脾淋巴细胞表达的的影响。结果表 明:从上清及包涵体中纯化的.均能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖, 且作 用呈浓度依赖性,浓度为时,增殖率分别为.%、.%,与阴性 组比较差异具有显著性意义.,.。.能促进的表达, 与阴性对照组比较差异具有显著性意义.%..%,.,. 促进淋巴细胞表面表达的能力也较.%和.%高。 结果显示.能在基因水平上促进丫的表达,且促进.丫表 达的能力高于及。说明我们纯化的.具有比及更强的 免疫调节活性。 连续天腹腔注射剂量为 /氢化可的松,建立小鼠体内免 疫抑制模型,皮下注射.连续治疗周,考察.对小鼠免疫抑制 的抵抗作用。结果发现,.能明显增强免疫抑制小鼠的胸腺指数, 与模型 组比较差异具有显著性意义.士. ..士.,.,与及 单独给药组比较差异也具有显著性意义.。但.对脾脏指数 的影响不大。染色分析.能改善导致的胸腺萎缩,增加胸腺组织 中胸腺细胞的数量。另外.能使胸腺细胞的比例恢复至正常水 平。与模型组比较,.显著增加外周血中吖的含量,抵抗造成的 吖水平降低。总之,.具有改善诱导的免疫抑制状态的能力,且 活性比及更强。 .辅助抗肿瘤作用研究 采用.法测定了.对乳腺癌细胞..、肝癌细胞 、肺癌细胞及黑色素瘤细胞四种肿瘤细胞增殖的抑制作用,结 果表明:.对四种肿瘤细胞生长的抑制作用呈时间依赖性,对 ..细胞的抑制作用最强,时细胞活力只占阴性组的.%,显著 高于组.%..%,.,但是与组比较没有显著性差异 .%..%,.。.对细胞和细胞的抑制作用 稍弱于对..细胞,时细胞活力分别占阴性组的.%及./, 抑制作用强于但与差别不大。.对细胞也有一定的抑制作 用,时细胞活力只占阴性组的.%,抑制作用与及相比没有显著 山东大学博十学位论文 性差异。 建立/小鼠荷黑色素瘤模型,考察.联合环磷酰胺对 肿瘤生长的抑制作用。结果表明:与单独给药相比,?联合明显 降低肿瘤体积及肿瘤重量,药物治疗周后肿瘤重量减少了将 近.%。. 也能逆转导致的外周血中自细胞数量减少,治疗周后外周血中自 细胞数量 的 增加至下常水平。流式细胞术检测肿瘤组织中组织相容性复合体 表达,发现组 的表达率只有.%,而.能显著增加肿瘤组 织中 的表达,与组比较差异具有显著性.%..%,.。 免疫组化结果显示?较及更能促进肿瘤组织中细胞的 浸润及的表达。可见.具有弱的直接杀伤细胞的功能,主要 通过激活免疫系统而发挥辅助抗肿瘤作用。 .与结合活性研究 采用激光共聚焦显微镜观察考察.与骨髓来源的巨噬细胞 的结合情况。将.、及分别用异硫氰酸荧光素标记, 并分别与分离的孵育,再用 及分别标记细胞核及 细胞膜,激光共聚焦显微镜观察药物结合情况。结果发现,.、及 均能结合在的细胞膜上。 采用技术检测.与存在于上的的结合。将 作为配体以氨基偶联的方式偶联到芯片上,.、及作为待 分析物流过芯片表面,考察三种多肽与的结合能力及亲和力大 小。结果显 示:技术能够准确反映三种多肽与的结合水平。.、及 /及 与的解离平衡常数硒分别为.击/、.。 .×击/。.与的结合能力显著强于,但与相比没 有显著性差异。到目前为止,三种多肽可能的受体首次被确定。 本研究取得的主要成果和结论如下: 首次构建了表达.的大肠杆菌表达系统,对重组蛋白质成功进 行了表达,并利用内含肽介导的纯化系统分别从细菌裂解上清及 包涵体中分离 进一步纯化得到了高纯度的目的多肽。获得的 纯化了., . 端只含有一个多余的甘氨酸残基。此研究提供了一种高效率、 山东大学博士学位论文 低成本的纯化策略,适合.的大规模生产。 纯化的.能明显促进小鼠脾淋巴细胞的增殖、及? 的表达,展示了较好的体外免疫调节活性。 首次进行了.的体内免疫调节活性研究。.能抵抗 诱导的免疫抑制,且效果较及强。 首次进行了.的辅助抗肿瘤作用研究。.联合展现 了很好的抗肿瘤活性,同时.激活了被抑制的免疫系统,增强对肿 瘤的杀伤。.的辅助抗肿瘤活性较及强。 首次研究了.的受体,.能与结合,提示? 介导免疫应答可能是通过信号通路。 关键词:.;内含肽;免疫调节;辅助抗肿瘤: 山东大学博士学位论文 / ,/ , 曲,., , . , .. , ., ,,’ , ., ,. , . . ?,/ , . .加.,. ? .,?, 山东火学博十学位论文. , ... , . ,. ??.,. , . : ?.? ..【. . 啪?.,?. ??.. . ,?. . ., ,, . , . ., 一 /山东大学博士学位论文? ??. . . , . , .% .% . / . /. :. : ./, . . ,. . . % .%??., .. . / 胁? 一 一 . . .丫. ?/, . % .%,., 矿. ,. .,. %..%,.. .% .%. , 丫 . 山东大学博士学位论文 . . .? , ,.. , ..,.. , .., .. , 【?. 吖 , . ,. , ?一 , ,. . .% , ,,.%..%,., , .%..%,.. 一 , .% .%, . ? , , .% . , 山东大学博士学位论文./ / . ? .谢 , .% ,.? , ..% , ,, ,%. .%,.. ... ?? .?,. 、析, , . . , ../. ., .×./,.×/ 山东大学博士学位论文 . . ./,. ,.蜥? , ., .: . . . ? . , . , . 吖. , . ?. , . . . . , .. , . : ;; ; ;山东大学博士学位论文 符号说明 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 氨苄青霉素 过硫酸铵 十二烷基磺酸钠 .精氨酸连接酶 二硫苏糖醇 生物反应调节剂 双蒸水 三蒸水 【 胸腺素【 胸腺五肽 . 胸腺素.胸腺五肽 内含肽 几丁质结合蛋白 ...跆 ? .. ?重组蛋白 几丁质结合域 . 十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳 超氧化物歧化酶 还原型谷胱甘肽 氧化型谷胱甘肽 聚合酶链反应 异丙基硫代.?一半乳糖苷 . 细胞增殖检测试剂盒 氢化可的松 酶联免疫吸附剂测定试剂盒 糖皮质激素山东大学博士学位论文 抗原递呈细胞 环磷酰胺 . .氟尿嘧啶 细胞毒细胞组织相容性复合体 细胞受体 树突状细胞 自然杀伤细胞 血管活性肠肽 骨髓来源的巨噬细胞 样受体 表面等离子共振 异硫氰酸荧光素 ..二甲氨基丙基乙基碳二亚胺 ?.羟基琥珀酰亚胺 . 小鼠巨噬细胞集落刺激因子 解离平衡常数 蜘 结合速率常数 ‰ 解离速率常数 细菌脂蛋白 调节性细胞 胸腺生成素 . 肿瘤坏死因子 获得性免疫缺陷综合症山东大学博十学位论文 第一章前言 恶性肿瘤致死率高,是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病 之一。目前治疗肿瘤的非手术治疗手段为化疗和放疗,但在采取这些手段治疗 肿瘤的同时,患者的免疫功能也受到了严重的破坏,细胞免疫功能严重降低, 造成化疗和放疗无法继续进行。据报道】,化疗和放疗能导致外周血中白细胞 数量急剧下降,进而引起高几率的感染甚至死亡。因此,寻找合适的免疫调节 剂作为肿瘤治疗的辅助药物以提高肿瘤患者的免疫功能是临床肿瘤治疗所必需 的。众所周知,免疫系统在机体自身抵抗肿瘤细胞方面发挥了重 要作用。免疫 系统识别并杀灭肿瘤细胞的假说早在世纪年代就已提出,目前已被大多 数学者所接受【。胸腺是中枢免疫器官,是骨髓来源的淋巴细胞『体成熟分化 的场所。胸腺上皮细胞除了能够提供胸腺细胞活动所需的合适的微环境外,能 分泌多种具有激素样活性的多肽,这些多肽在治疗原发性的免疫缺陷等疾病中 展示了良好的活性【。胸腺五肽,和胸腺素, 即是从胸腺中获得的两种多肽,二者具有相似的免疫调节活性,在临床肿 瘤辅助治疗中能提高化疗或放疗病人的免疫应答及耐受性,抑制或降低病情的 进展或复发,延长病人的生存期,提高病人的生活质量扣。但是的半衰期,, 很短,人体内药代动力学研究发现的,/只有 。的体内,/较长约 为,但目前主要以合成的方法生产,价格昂贵,难以被广大患者所接受 。这些缺点限制了二者的广泛应用。获得半衰期更长、活性更好且价格更便宜 的免疫调节剂已成为科研工作者关注的焦点。 胸腺五肽 .胸腺五肽的起源与发展 胸腺是细胞免疫的中枢器官,它能产生多种激素样多肽,其中胸腺生成素 是从胸腺组织中分离出的一种由个氨基酸残基组成的多 肽,具有促进胸腺细胞和外周细胞及细胞分化发育、调节机体免疫功能等 促进和调节免疫活性的核心是一个 生物活性。等【】发现 “五肽”片段,它位于个氨基酸残基序列的第.位。用内切酶将这一片 山东大学博十学位论文 段段分离出来后,与个氨基酸残基组成的胸腺生成素具有相同的双向免疫 调节功能和同样的胸腺生理功能,这五个氨基酸残基序列便被化学合成出来并 被称为胸腺五肽。目前,由于具有结构简单、易于合成且活性高 等特点已被作为一种重要的免疫调节剂【成功用于临床,近几年来受到了广泛 的关注。 .胸腺五肽的结构与性质 ,氨基酸残基序列为 的分子式为,分子量为. ......。文献报道【】第一位的心和第三位的是 的活性中心。为碱性多肽,等电点预测软件://../?/ 八 旷 \图 的结构式 . .胸腺五肽的生物学功能 ..免疫调节 保留了胸腺生成素的生物活性,具有双向调节免疫系统的功能,能 使过强或受到抑制的免疫反应趋向于正常,同时其对机体免疫功能氐下、自身 免疫病具有很好的调节作用。能诱导祖细胞体外分化、成熟,促进人胸 腺细胞和表面标志的表达【】。体内外实验,能明显促进老 年鼠产生白介素..、丫.干扰素和肿瘤坏死因子.., 同时降低.水平,从而增强了老年鼠对利什曼原虫感染的抵抗力。能抵 ,同时显著 抗放射治疗引起免疫力低下等副作用,增加病人体内白细胞数量【 。还对手术创伤、手术感染等应激情况引 提高肿瘤患者机体的免疫参数【 起的机体免疫功能下降具有明显的保护作用】。 预测其等电点为.。的结构式见图.。./山东人学博十学位论文 通过丝裂原激活的蛋白激酶/途径实现信号转导。等 【】发现在和细胞相互作用之前能与人组织相容性复合体的分子 .形成复合物,并且与.的结合非常迅速,结合前不需 要递呈,且不受代谢抑制剂的影响‘,为进一步探讨诱导的免疫调节机制 提供了新的思路。 胸腺素 .胸腺素的起源与发展 胸腺素【是由个氨基酸残基组成的具有生物活性的多肽,是最 早由分离纯化得到【】。对的研究始于胸腺,年, 等【】首次从小牛胸腺中分离并描述了一种胸腺因子,命名为“胸腺素。胸腺素 对免疫、内分泌及中枢神经系统均有一定的调节作用】。进一步对胸腺素进行 分离得到了一种热稳定且不溶于丙酮的组分,称之为胸腺素组分。 能促进细胞分化、增强机体的免疫功能冈、诱导神经内分泌肿瘤细胞凋亡【 等。优良的活性鼓舞着科学家们进一步分离并确证其中的活性物 质,最终 在年被纯化出来,并且具有比高.倍的活性【引。 .胸腺素的结构与性质 是高度保守的酸性多肽,主要存在于胸腺中,但也存在于淋巴组织例如 脾和淋巴结中及非淋巴组织例如肺、肾和脑中【。有趣的是,的分泌并不 受其它激素或释放因子的调节【。由个氨基酸残基组成,相对分子质量 胁为,等电点为.,无二硫键与糖基化修饰,体内?.术端乙酰化, ,条件下较稳定。其一级结构如图.。 弓 肛石甜瓮佤甜希而冰罱每 ? 暑? 人 盟竺 ,捧、 执一 一触 一亘雒一翩 强、? 厂上洲 图. 的一级结构.山东人学博士学位论文 .胸腺素伍的生物学功能 ..免疫调节 体内外许多研究已证实具有免疫调节作用。能增加细胞成熟的 效率【,刺激祖干细胞分化成/细胞【以及平衡外周血单核细胞 中//细胞的比例。是固有免疫应答的刺激剂,能短时间 内快速刺激树突状细胞,促进吞噬病原体‘删。通过刺激自然杀伤 细胞及细胞毒细胞,增强机体杀死病毒感染的细胞的能力,还能 显著促进慢性丙型肝炎病毒患者体内.浓度增加,降低型细胞因子 .、一的浓度‘。此外,能降低急性胰腺炎病人血清中.和 .的含量,从而减轻患者的病情恶化【。能上调特殊的细胞因子受体例 如.受体的表达【。不仅能激活免疫效应细胞,调节细胞因子的表达, 还对靶细胞有直接的作用。例如,增加肿瘤细胞上组织相容性复合体 【】和肿瘤抗原【的表达,使肿瘤细胞不易逃脱免疫监测。 ..抗肿瘤 体内外研究显示能抑制多种肿瘤细胞的生长。体外能抑制肝癌细 胞及肺癌细胞.的增殖【。等‘将皮下注射于荷 淋巴瘤及.肉瘤/小鼠体内,结果发现能显著降低肿瘤的肝 转移和肺转移,并能抑制移植瘤的生长。等‘研究了对荷乳腺癌 的 大鼠的作用,发现能够降低乳腺癌的发生率,延长大鼠的生存期。 对肺癌的抑制作用也做了研究,当肺肿瘤组织很小的时候给予时,的 抗肿瘤效果是最强的劲。 联合其它生物反应调节剂或化疗药对降低肿瘤负荷也展示了 很好的效果。将包裹有人和 的脂质体注射至小鼠体内, 单独基因更强 含有和 基因的脂质体复合物展现了比和 的抑制肿瘤生长的效果【。将与.及一联合治疗?结肠癌, 实验大鼠的生存率显著增加,肿瘤的转移得以很好的控制。和卡莫斯汀 单独给药比,联合治疗恶性胶质瘤更能降低肿瘤负荷,增 加治愈纠。 可见可直接抑制肿瘤细胞的增殖,也可以通过激活免疫系统杀伤肿瘤山东大学博十学位论文 细胞。与其它化疗药物或联合应用比单独给药抗肿瘤效果更好。 ..氧化损伤保护作用 许多研究证明对氧化损伤具有保护作用。能增强肝脏及谷胱 甘肽过氧化物酶.的活性,减少氧自由基对肝组织的损伤【】。同样, 能降低丙二醛的浓度,增加还原型谷胱甘肽的水平,增 强及过氧化物酶的活性,增强胰腺组织的整体抗氧化能力,从而 改善链唑霉素诱导的胰腺损伤及糖尿病【】。 ..其它功能 具有影响中枢神经系统的能力【】。对培养的海马神经元的兴奋性突触 传递功能,展示了很好的调节作用。在与化疗药物合用治疗肿瘤时, 能保护病人免受化疗药物引起的神经毒性的折磨【?。此外,在促进内皮细 胞迁移、血管发生及伤口愈合方面展示了良好的作用【】。 .胸腺素的临床应用 ..胸腺素伍在肿瘤治疗方面的应用 肿瘤患者常伴有严重的细胞免疫缺陷,常规的肿瘤治疗方法通常会诱导机 体免疫应答低下。在期临床随机试验中,不同剂量的和氮烯咪胺 化疗药联合应用用于治疗患有晚期黑色素瘤的患者,结果显示和联合 治疗比联合.【总体应答率提高三倍,总体生存期延长了接近个月 【】。最近报道,联合经动脉化疗栓塞治疗无法切除的肝癌,相比 于单独治疗患者的生存期延长,并且增强对肿瘤的应答。当然,作 为免疫调节剂用于晚期肝癌的治疗应该进行更大样本的评估硎。 可见,当与其它治疗联合应用治疗人类肿瘤时能够明显抑制肿瘤 的生长,延长病人的生存期。在联合治疗中,作为重要的免疫调节者激活了 免疫系统,是肿瘤治疗策略中关键的部分,在将来肿瘤的治疗中将会成为关 注的焦点。 ..胸腺素伍在乙肝治疗方面的应用 慢性乙型肝炎病毒感染是世界性的传染病,具有潜在的后遗症, 例如肝硬化和肝细胞癌,是一种危害性极大的临床疾病】。已在世界许多 山东大学博十学位论文 国家用于治疗慢性感染,治疗后病人的病毒学应答显著增加【删。许多研究 已证明在治疗阳性及阴性的慢性感染有效。例如, 等吲发现给予.或. 与位阳性的日本慢性患者, 治疗周后,患者体内的血清转换率分别为.%和.%。给予. 次/周于阴性的中国慢性患者也展示了良好的治疗效果, 治疗个月后,患者体内的谷氨酸丙氨酸转移酶趋于常,结果 显示.% /的患者体内未检测到的】。联合拉米夫定 治疗感染比拉米夫定单独给药显示了更好的正常率、病毒应答率及 血清转化率‘。但是等四报道称在与修饰的干扰素 ..联合治疗阳性的慢性乙型肝炎患者时,只在前周增 加.,次/周并不比?.单独治疗效果好,可见,短时间 的给予其作用抗病毒效果并不明显。 ..胸腺素在丙肝治疗方面的应用 在一随机、双盲临床试验中,单独给药治疗丙型肝炎病毒感 染并没有显著的效果【?。然而,联合..能有效抑制难治愈 患者体内的病毒复制。的..和利巴韦林联合治疗只能使% 的患者产生持续的病毒应答【,但是采用..利巴韦林三 联疗法能够治疗传统治疗难以治愈的,具有安全且有效的优点【。 ..胸腺素在治疗方面的应用 人类免疫缺陷病毒专门攻击表达分子的靶细胞,例如巨噬细 胞、及细胞。机体被病毒感染后,细胞也不能有效地被激活, 病毒很容易逃脱免疫系统的监测,导致整个免疫系统的崩溃。由 于免疫应答在 预防病毒的感染方面发挥着重要作用,故诱导强有力的免疫应答 尤其是 应答来抵抗的进攻能很好的阻止的发展。联合齐多夫定及 .能显著增加细胞的数量及功能,降低滴度【”。掣 研究了联合高活性的抗逆转录病毒疗法在刺激免疫重建方面的 安全性及有效性,结果证明具有很好的耐受性,能显著增加患者 体内 信号结合细胞受体删除环的水平。但是,需要更长时间的研究 在增强免疫重建中的作用。山东大学博十学位论文 .胸腺素的表达 目前可从三种途径中获得:第一种是从小牛胸腺中获得,此方法成本 较低,但是具有步骤繁琐、产量低以及引入外源性的抗原的缺点:第二种是利 用化学合成的方法得到,此方法具有简单、高效、纯度高等优点,临床上应用 的即是此种方法获得的,但是此方法生产的成本高,普通患者难以承 受;第三种是用基因工程的手段表达,此方法成本低、效率高,但是获得的 的纯度还达不到临床应用的要求。由于的分子量小,易被细胞中的蛋白酶 降解,故通常和融合标签融合表达。等【将的基因插入到质粒 中,然后导入大肠杆菌中,和融合标签硫氧还蛋白重组 表达,最终用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割去掉标签,每升发酵液获得了 。等【】将与标签融合表达,镍柱亲和层析纯化融合蛋 白后,采用肠激酶切掉尾,切割后,采用反相高效液相色谱法纯 。此 化,最终获得了高纯度的%,每升发酵液获得了. 两种方法都需要引入蛋白酶将融合标签去掉,增加了纯化成本。等将 的基因设计在内含肽基因的端,将标签的基因设计在的 端,表达的重组基因同时和一种原核胪.乙酰基转移酶共同表达, 利用尾纯化重组蛋白,加入诱导端自切割释放。切割混合疏水层析、分 物先后经历了硫酸铵沉淀、苯基 离子交换等纯化策略,最终升发酵液纯化得到了 子筛及 ,.检测纯度高达%,但纯化步骤较复杂。 . .胸腺素的受体研究 到目前为止,激活免疫细胞的机制尚不清楚,的受体也未见报道。 早在年, ?】便发现外源性的能结合在胸腺细胞的表面。 随后,等报道称能与大鼠及小鼠腹膜巨噬细胞上的血管活性肠肽 受体结合,但和受体结合的能力远不及,作者猜测可 能是家族弱的激动剂。进一步研究发现,介导的刺激细胞内信号转导 通路包括丝裂原活化的蛋白激酶转导通路【和肿瘤坏死因子受体相 关因子信号转导通路【阳】图.。能激活小鼠发挥 抗病毒活性主要是激活了样受体信号途径,并且明显增强小 鼠 的表达畔’。等盯发现激活免疫细胞并促进免疫细胞分泌 一、及等细胞冈了主要是通过,//“//? 及//.信号途径,而这些信号途径恰好是信号通路的游。 :是我们猜测可能是作的一个受体。 卧 、 啬躲:’,墨翟‖【磊?蕃掣茹黼: 匿匿 图的作用机制 :肿瘤坏死因子受体相关因了::样受体::噬细 胞;:蝗裂原激活的蛋门激酶::激酶:: 骨髓分化冈了 . : ;: :; : ? ;: ;: 胸腺五肚存在的问题及改进方法 足小分了多肚,易受蚩白酶例如氧肽酶等降解,体内“垃,故不能 服.只能静脉注射或肌内汴射,是静脉注射存在安全问题,肌内注 射存在吸 收问题而边小到『效的治疗浓度.对于需要长期治疗的忠者,频繁的注射往 给患者带来许多痛苦和不便。针对以卜情兑,研究者采取了再种打法延长山东人学博学位论文 的,忍,并研究出了能够提高生物利用度、提高病人应性的新剂型,使 更好地发挥药效。 针对体内忍短、生物利用度低的特点,一些研究者在原有的线性结 构基础上,增加其肽链长度以延长,/。我们课题组禾用基因工程的手段将 和与活性相似的融合表达,表达的新型融合肽.具有比及 更强的体外促进脾淋巴细胞增殖的活性及更长的体/。但该法得至. 量少且端带有个多余的氨基酸残基,端带有个多余的氨基酸残基,具有潜 在的免疫原性。谢文林等采用固相合成法,利用具有细胞膜穿透功能的 . 蛋白对多肽对进行修饰,即在其.端连接上穿膜肽序列,从而得到 新的衍生物:??????? .。.既延长了肽链长度,又保持了的免疫调节活性。 将多肽环化,能提高其稳定性、大大降低其对氨肽酶和羧肽酶的敏感性、 提高生物利用度。已知皂抑制结核分枝杆菌入侵自细胞,在的端和端 各加上一个,两端的形成二硫键,构成了新的环状七肽,其抑制结核分 枝杆菌入侵白细胞的能力并不降低【。余榕捷等【利用基因工程技术成功构建 并表达了重组环状胸腺五肽结构类似物【一??, 。免疫活性检测结果显示,环肽较线性更能显著地促进巨噬细胞吞 噬能力及促进细胞抗体的生成。等将的第一个氨基酸残基和最后一个 氨基酸残基用连接,形成环状六肽????,?/ 检测环状六肽在猕猴体内的半衰期为..,明显长于,并且体外活性 检测发现形成环状六肽后仍具有免疫调节活性。若要使获得的环状多肽活性不 丧失或不减弱,需要在用计算机模拟技术设计时,保证肽链在环合前后构象变 化最小。总之,形成环状多肽是提高稳定性的可靠的方法。 近几年来,研制的新剂型也成为大家关注的焦点。将制成多泡脂 质体缓释剂型,能使免受蛋白酶的降解,且能缓慢持续释放,减少给药频 率,是一种非常有应用前景的新剂型?。等嗍将制成可口服的.氰 基丙烯酸酯纳米粒..,.能明显增强对胰蛋白酶 的耐受,并且能减少在胃中的释放,使其只在小肠中释放,增加口服利用 度。鼻部给药也是一种较为有前景的方式。等将制成鼻部给药制剂山东大学博士学位论文 并考查了该制剂的药代动力学特征。通过对鼻纤毛的损伤研究筛选了最佳的吸 收促进剂。凌振宏等舛研制了鼻喷雾剂,增加了亚硫酸氢钠、二水磷酸氢 二钠等辅料以增加制剂的稳定性,用一水柠檬酸作渗透压调节剂促进鼻黏膜对 的吸收,稳定性较好,且对鼻腔无刺激作用。肺部具有吸收表面积大、血流 速度快、扩散路程短、药物代谢程度低及避免首过效应等特点,是一个良好的 给药部位。将制成干粉喷雾剂使其从肺部吸入,能大大提高的生物利 用度‘。等研制了一种新的干粉喷雾剂,发现、乳糖及亮氨酸 的比例为::时是最佳组合,稳定剂聚羟亚烃能显著提高粉剂的流 动性。可见,将制成新的剂型也是一种提高的利用度的有效手段。 本课题的设计思路及拟解决的问题 针对体内半衰期短的问题,我们课题组已用基因工程的手段将与 的基因串联,构成融合肽.,并在毕赤酵母 中表达了 .,前期工作己证明.体外具有比更强的促进小鼠脾淋巴细胞 增殖的能力,并且.具有比及更强的促进小鼠体内巨噬细胞的 吞噬能力及分泌.的能力。但 分泌表达.的量很少, 为了得到更多的.,本课题改用为宿主菌,引入内含肽切 割系统,将?和内含肽.及几丁质结合蛋白融合表 达,利用和几丁质填料的亲和性进行分离纯化,利用的自切割功 能 进行切割从而释放.,避免了蛋白酶的引入,减少了纯化步骤,降 低了纯 化成本,提高了工作效率。内含肽纯化系统的示意图如图所示。 由于.的作用受体目前还尚不清楚,故本课题在考察纯化的 ?的体内外免疫调节活性及辅助抗肿瘤活性的基础上,还采用表 面等离子 共振技术 ,考察?与样受体 的结合能力及亲和力大小,以更好地阐明其发挥药效的作用机 理。 本课题拟解决的关键问题: 采用大肠杆菌表达体系对.进行表达,选用内含肽介导的切割体 系分别从菌体裂解上清及包涵体中分离纯化?,并鉴定纯化产物 的正确 性。 对纯化的.进行体内外免疫调节活性测定,包括对脾淋巴细胞增? 尔人学弹。学付论文 贿的促进作用,及?表达的促进作用及氢化可的松诱导的免疫 抑制的抵抗作用。 考察体外对肿瘤细胞的抑制作用及体内辅助环磷酰胺 的抗肿瘤作用。 考察能否和结合及亲和力的强弱。 人 、一 ‘州口 、?”“?引 “ 一 ?? ?七”引 一.。~ ?”儿。 图.内含肽介导的纯化流程图 .山东大学博士学位论文 第二章内含肽介导的.表达及分离纯化 大肠杆菌是应用最早、最广泛用于表达外源蛋白的宿主菌之一阳。它具有 遗传背景清楚,培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、 可以大规模的生产目的蛋白等优点。但是大肠杆菌不适合表达二硫键丰富及需 嘤翻译后修饰的蛋白质【引。由于多肽分子量小,易受细胞内蛋白酶的降解,故 常和麦芽糖结合蛋白】、谷胱甘肽硫转移酶】及 标签融合表达.】。但亲和层析纯化后需利用蛋白酶将标签去掉,成本高且后 续的纯化过程复杂。内含肽是存在于前体蛋白中的一段序列,在蛋白质 翻译后加工过程中,依靠自我剪切作用从前体蛋白中释放出来,同时将两端的 蛋白质外显肽连接在一起,这一过程被称为“蛋白质剪接”。内 含肽的自切割功能在蛋白质纯化方面有着广泛的应用,将内含肽与亲和纯化技 术联合应用,利用亲和层析技术分离纯化目的蛋白,利用内含肽的自切割功能 代替蛋白酶去除亲和标签,既能保证纯化效率,又能避免传统工艺中因外加蛋 白酶而带来的诸多麻烦,减少了纯化步骤,降低了纯化成本。 我们课题组已经在毕赤酵母中成功表达并分离纯化胸腺融合肽.,但 .的分泌表达量较低,故我们本章中构建.的原核表达系统,采 . 用为载体,构建能够表达.的重组质粒... 几丁质结合蛋白,并转入大肠杆菌中进行表达。随后,利用 对几丁质填料的亲和性采用一步纯化法分别从细胞裂解上清及包涵体中纯化融 合蛋白。加入/ 进 诱导内含肽自切割释放., 一步对.脱盐,从而获得有活性的目的肽。此方法具有简便快捷、成本 低的特点,适合.的大规模生产。 实验材料 .菌株及质粒 实验中所用的菌株与质粒见表.。山东人学博士学位论文 表实验所用菌株及质粒 . 菌株及质粒 来源 , . 感受态细胞 本