FISH检测

FISH检测 FISH检测 HER-2的意义 乳腺癌有效的治疗取决于正确的选择治疗方案，肿瘤专家研究发现HER-2的水平是以阿霉素为基础药物化疗重要而独立的预后因子。HER-2水平的检测被认为是选择乳腺癌化疗的依据。 HER-2水平的检测对乳腺癌治疗具有指导性意义。不准确的结果会造成不正确的治疗方案。导致病人遭受不必要的化疗或者使病人丧失有效的治疗良机。 HER-2/neu也称作CerbB-2，在调节细胞的生长中起着重要的作用，是分子量为185kd的转膜细胞受体，属于酪氨酸酶家族的成员。HER-2被证实在乳腺癌、卵巢癌和其它肿瘤上扩增和过表达。其扩增和过表达被认为是乳腺癌最重要预后和化疗标记。大约有25%-30%乳腺癌有HER-2基因扩增。 化疗是乳腺癌术后最重要的治疗方法之一，患者肿瘤HER-2扩增对以阿霉素为基础化疗的敏感性好，研究表明，HER-2扩增的病人实施强化剂量的化疗后其生存率明显提高。而对无HER-2扩增的病人没有那么好的效果。所以对无HER-2扩增的病人没有必要执行这样的化疗。准确的HER-2水平检测为正确选择治疗方案提供重要依据。 目前用于治疗乳腺癌的单克隆抗体Herceptin理论上只对细胞膜上过多HER-2蛋白表达的细胞才有作用，所以Herceptin治疗需要筛选HER-2阳性的患者才有可能成功。目前检测HER-2基因扩增或HER-2蛋白过度表达的方法有许多种，有南方点墨法、西方点墨法、北方点墨法、免疫组织化学染色法(IHC)和荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization;FISH)等。目前DAKO Herceptin test，Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe 试剂盒和Oncor INFORM HER-2/neu已通过美国食品药物管理局(FDA)的认证，目前被认为是比较可靠的方法。 IHC和FISH均可以使用福尔马林固定的组织蜡块来检测，和一般病理组织标本处理相同，病理存档的组织块也能用于HER-2的检测，因此目前实验室多数使用IHC和FISH来检测HER-2。Herceptin test 和FISH相比Herceptin test操作时间比较短，大约4-6个小时即可完成，而FISH需要隔夜完成。使用的设备Herceptin test只需要一般光学显微镜，FISH则需要使用荧光显微镜。从分子生物学原理上讲FISH检测的是肿瘤细胞的DNA，而Herceptin test(免疫化学法)检测的是细胞膜表面的蛋白质。实际上真正执行基因功能的物质是蛋白质而不是DNA，这要看HER-2基因是否扩增，当然以观察细胞膜表面HER-2蛋白质的量是否增加最为直接。也最为可信。因为有时即使DNA有扩增其结果未必能在蛋白质曾面表现出来。因为由DAN有表现到蛋白质被制造出来必须经过很多程序，中间可能出现很多干扰因素。除此之外，免疫化学检测法比较便宜，省时，可以较普遍的筛选。 FISH的优点在于使用传统分子生物学方法检测肿瘤组织的DNA。FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的位置，以Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe来说，它会把HER-2基因部位橘色荧光亮点，还将第17对染色体的中心颗粒(centromere)呈现绿色亮点，我们只要对比橘色和绿色亮点的数目，若橘色点/绿色点大于2，就表示有HER-2扩增，正常细胞橘色点/绿色点数目比值小于2。 FISH同IHC HER-2水平检测方法相比，IHC检测的准确性不如原位杂交(CISH)和原位荧光杂交法(FISH)。就各种检测方法比较FISH为最好，FISH检测的结果可靠，被喻为HER-2水平检测的金标准。 HER-2 免疫组织化学+2的意思是肿瘤组织在免疫组织化学染色下着色强度为2价。多数认为HER-2 +3(3价)具有临床意义，可以作为使用Herceptin治疗的依据。her-2 IHC+2 则必须加作FISH检测是否真的有HER-2扩增。而HER-2 IHC 0或+1则表示没有没有HER-2 过表达，不必再作FISH，也不适合使用Herceptin治疗。 FISH检测方法 试剂和仪器 Vysis提供的 根据订货该盒内含有大约足够检测20，50和100人份试剂。限定一份检测22 x 22mm靶区。 1) LSI HER2/neu黄色光谱(low copy number E. coli vector)/CEP 17 绿光谱DNA探针 (E.coli plasmid) Vysis P.N ( product number): 30-17060/35-171060 Quantity: 200uL/500uL/500uLx2 for the 100 assay kit Storage: -20? in the dark Composition (成分): SpetrumGreen fluorophore-labeled alpha satellite DNA probe for chromosome 17, SpectrumOrange fluophore-labeled DNA probe for the HER-2/neu gen locus, and blocking DNA, pre-denatured in hybridization buffer. 2) DAPI Conuterstain Vysis P.N: 30-804840/30-804860/30-804960 Quantity: 300uL/600uL/1000Ul Storage: -20? in the dark Composition: 1000ng/mL DAPI (4,6-diamino-2phenylindole) in phenylenediamine dihydrochloride, glycerol, and buffer. 3) N P-40 Vysis P.N: 30-804820 Quantity: 4mL (2 vials) Storage: -20 to 25? Composition: N P-40 4) 20 XSSC salts Vysis P.N: 30-805850 Quantity: 66g for up to 250mLof 20 X SSC solution Storage: -20 to 25? Composition: sodium chloride and sodium citrate Note: Material Safety Data Sheets (MSDS 材料安全数据表) for all reagents provided in the kits are available upon request from the Vysis Technical Department. Storage and handling 贮存和处理 未开封的Path Vysis 试剂盒-20?贮存并避光和潮湿。20 X SSC 盐和NP-40可以单独贮存 于室温。每一种成分包装上面都标明了有效期。同时也标明了打开和未开包装的贮存条件。 试剂盒中的某些成分接触光、热或潮湿会影响试剂的有效期，应该避免。不按包装的条 件保存可能会影响检测结果。 需要的材料但Vysis公司不提供 实验室试剂 ? HER-2/ nue探针检测正常对照(正常信号率)order No.30-805093 ? 福尔马林固定，石蜡包埋，培养好的人细胞株(normal LSI HER-2/nue;CEP 17 ratio) 应用型显微镜载玻片数量:5片，对照片在15-30?干燥剂防潮密封在容器中贮存。 ? HER-2/ nue探针界限对照片(弱扩增信号率)order No.30-805042;福尔马林固定， 石蜡包埋。培养好的人细胞株(低水平HER-2/ nue扩增)应用型显微镜载玻片数量:5 片，对照片在15-30?干燥剂防潮密封在容器中贮存。 ? 石蜡预处理试剂盒(Vysis cat.,32-801200)盒内包括: ? 预处理液(NaSCN)数量:5 X 50mL ? 蛋白酶(胃蛋白酶2500-3000单位/mg)数量:5 X 25mg ? 蛋白酶缓冲液(NaCl solution, pH 2)数量:5 X 50Ml ? 缓冲洗液(2 X SSC，pH 7)数量:2 X 250mL ? 中性缓冲福尔马林液(4%多聚甲醛PBS配制) ? Hemo-De ( 血液德)透明剂(Fisher product No.15-182-507A) ? 苏木精和伊红(H&E) ? 适当的荧光显微镜浸泡油。室温贮存 ? 超纯甲酰胺。从发货计算4?保存1个月(查看生产商推荐的详细信息) ? 100%乙醇。室温贮存 ? 浓缩的(12N)盐酸 ? 1N氢氧化钠 ? 纯净水(蒸馏水或去离子水或Milli-Q)。室温贮存 ? 橡胶水泥胶 ? Drierite德里拉特[干燥用无水硫酸,商品名]和液氮 实验室设备 ? 预清洁硅化或正电荷显微镜载玻片 ? 载玻片加热器(要求有准确的温度数字显示)45-50? ? 22 mm X 22 mm玻璃盖玻片 ? 可调容积吸管(1-10 uL)和无菌微量移液管头 ? 聚丙烯微量离心管(0.5-1.5mL ) ? 计时器 ? 切片机 ? 磁力搅拌器 ? 漩涡混合器 ? 微量离心机 ? 刻度量筒 ? 水浴锅(37?1?，72?1?和80?1?) ? 水浴(40?)无蛋白质 ? 干燥箱(37?-56?) ? 钻石笔 ? 杂交湿盒 ? 镊子 ? 一次性注射器(5 mL) ? 染色缸(6)建议型号:Wheaton Product No.900620竖式染色缸 ? 荧光显微镜设备和推荐的滤光片(见第二部分) ? pH计和pH试纸 ? 温度计 ? 带盖载玻片盒 ? 0.45细孔过滤设备 显微镜设备和附属品 显微镜:观察原位杂交结果需要一种磊照明荧光显微镜，如果有合适的荧光显微镜。应该检查荧光显微镜是否能较好的观察原位杂交样品。用老式显微镜一般DNA染色例如DAPI，碘化丙啶和奎纳克林不具备足够的功能进行FISH检测。显微镜常规清洁和定期调试应该由生产商家的技术人员完成。 注释:Often a presumed failure of reagents in an in situ assay may actually indicate that a malfunctioning or sub-optimal fluoroscope or incorrect filter set is being used to view a successful hybridization assay. 激发光源:100W 汞灯它的大约寿命200小时是推荐的激发光源。汞灯用后应该记录使用小时数。超过规定的时间之前应该更换。确保汞灯适当的应用。 接物镜:显微镜汞灯100W使用的荧光接物镜浸泡油数值孔径?0.75。一个40X 接物镜用10X目镜连接适合扫描。对FISH用63X或100X油浸消色差透镜型接物镜就可以获得满意的结果。 浸泡油:油浸接物镜使用的浸油，是一种低自发荧光和专用荧光显微镜的配方。 滤光片:多带通荧光显微镜滤片装置最适合用于CEP和LSI DAN 探针试剂盒可以从Vysis 获得一些显微镜滤片型号。Path Vysion 试剂盒推荐滤片装置是DAPI/9-Orange 双带通，DAPI/Green双带通和DAPI/Green/Orange三重带通。LSI HER-2/nue原位杂交和CEP17探针对它们的靶区分别标记橙色和绿色荧光。其它所有DNA DAPI染色为绿色荧光。 工作液的准备 20X SSC(3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠，pH 5.3) 配制20X SSC pH 5.3 加入的顺序: 66g 20X SSC 200mL 纯化水 250mL 最终量 彻底混合，用pH计室温下测pH，用浓盐酸调pH到5.3。加纯水至总量250没mL。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。室温贮存6个月。 变性液(70%甲酰胺/2X SSC，pH 7.0-8.0) 配制甲酰胺的顺序: 49mL 甲酰胺 7mL 20X SSC, pH5.3 14mL 纯化水 70mL 最终量 彻底混合，用pH计室温下测pH，用玻璃电极(glass electrode 利用薄玻璃膜将两种溶液隔离而产生电势差的电极，常用于测量溶液的pH)调pH至7.0-8.0之间。液体可以保存一周。每次用前检查pH。贮存于2-8?，不用的时候盖紧容器的盖子。 乙醇液 用100%乙醇和纯化水v/v稀释70%，80%。避免蒸发或稀释过量，不用的时候盖紧容器的盖子。配制后可以使用一周。 后杂交缓冲洗液(20X SSC/0.3% NP-40) 配制顺序: 100mL 20X SSC, pH 5.3 847mL 纯化水 3mL NP-40 1000mL 最终量 彻底混合，用pH计室温下测pH，用1 N氢氧化钠调pH至7.0-7.5。加纯化水到总量1000mL。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。使用过的液体当日丢弃，未使用过的液体室温贮存6个月。 注意事项和预防措施 1( Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe kit用于体外诊断使用。 2( The PathVysion Kit 仅用于福尔马林固定石蜡包埋乳腺癌组织;不作为新鲜组织或非 乳腺癌组织使用。 3( 所有生物学标本经过防止传染病传递的药剂处理。盒子里提供的是人细胞株经过10% 福尔马林固定的对照细胞涂片。因为常常不清楚是否会引起传染，所有人标本和对照 片是经普遍预防处理。标本处理指南从美国疾病控制中心获得。 4( 标本应该避免酸，强碱或过热，这样的条件会破坏DNA引起FISH检测失败。 5( 下面所有步骤对标本变性，杂交和检测可以引起不可接受失败或错误的结果。 6( 相同组织块的第10张切片应该进行H.E染色对靶区进行辨认。 7( 使用其它试剂代替Vysis公司提供的试剂可能对杂交条件产生不利的影响。 8( 确保标记的有效期以盒子上正确贮存说明为基础，不按贮存说明要求存放可能对检测 结果不利。 9( 如果贮存在低温，20X SSC可以出现结晶，如果结晶在室温下不能再溶解，该液应该丢 弃。 10( 如果其它工作液沉淀或浑浊应该丢弃，从新配制新工作液。 11( 该DAPI对比染色含有DAPI( 4,6-二氨基-2-苯基吲哚)和1,4苯二胺。 DAPI是一种可能的诱变剂明确建立在遗传毒性影响的基础上。1,4苯二胺被认为是一种 皮肤致敏剂和一种可能的呼吸致敏剂，避免吸入，摄取或皮肤接触。参考MSDS详细警 告。 12( 荧光暴露在光线下容易被光漂白，限制这种降级。操作所有含荧光的液体时要减少光 线暴露。所有步骤牵涉到处理杂交的切片。所有(孵育、洗等)步骤不要在光线下应 该在暗处操作。 13( LSI HER-2/neu CEP17 DNA 探针混合物含有甲酰胺，一种致畸因子。避免接触皮肤和 黏膜。 14( 校准温度需要测量液体、水浴锅和恒温箱的温度。 15( 总要核实预处理液，变性液和洗液的温度，使用前用标准温度计对科普林缸内液体进 行测量核对温度。 16( 所有有危险的物质应该按当地和国家指导方针进行无害化处理。 标本处理和载玻片准备 标本收集和处理 Path Vysion 试剂是为福尔马林固定石蜡包埋的组织样品检测而设计的，组织收集应该按照实验室标准程序执行。Path Vysion 检测对组织的选择应该由病理学家完成。标本避免接触酸，强碱或非常高的温度。这种情况会破坏DNA导致FISH检测失败。 切片厚度4-6微米，福尔马林固定，石蜡包埋的组织可以按照实验室常规步骤处理和贮存。确保Path Vysion 试剂盒检测的最佳结果，对所有标本分析这些方法应该一致。用于FISH检测分析组织块的第10张作H.E染色，以便对靶区进行辨认。 组织切片应该贴在胶包被载玻片的正面，以便在FISH检测中脱片。Path Vysion 试剂盒有足够检测大约20人份的试剂;每份限定22mm X 22mm区域。较大的组织切片超过22mm X 22mm区域每份加探针应该大于10uL。 福尔马林固定石蜡包埋组织切片准备 使用下列方法进行准备 1. 切片4-6微米。 2. 切片飘在无蛋白质40?水中。 3. 贴在有机硅烷胶包被载玻片的正面。 4. 让切片在空气中干燥。(Start processing ProbeChek control slides here) 5. 烤切片56?过夜。 切片预处理 在进行Path Vysion 试剂盒检测前标本需要经过固定，切片必须脱蜡。Path Vysion预处理试剂盒插在包装中，(Product No. 32-801200)含有详细的说明。下面是简要的步骤说明。 切片脱蜡 切片浸在Hemo-De 10min，室温。 用新Hemo-De重复两次。 切片在100%乙醇5min，室温，重复。 空气干燥切片或把切片放在45-50?载玻片加热器上。 预处理切片 切片浸在0.2N HCI 20 minutes 切片浸在纯化水中3 minutes 切片浸在缓冲洗液中3 minutes 切片浸在预处理液中80? 30 minutes 切片浸在纯化水中1 minutes 切片浸在缓冲洗液中5 minutes，重复 蛋白酶处理 在载玻片边缘用纸巾吸干载玻片上过多的缓冲液 切片浸在蛋白酶液中37?，10 minutes 切片浸在缓冲洗液中5 minutes， 重复 干燥切片在45-50?载玻片加热器上2-5 minutes。 标本固定 切片浸在中性缓冲福尔马林液中，室温，10 minutes。 切片浸在缓冲洗液中5 minutes， 重复 干燥切片在45-50?载玻片加热器上2-5 minutes。 继续the Path Vysion 检测拟订计划 FISH测试步骤 Fluorescence In Situ Hybridization Procedure Summary 样品DNA变性 探针液DNA变性和杂交步骤准备工作应该同步进行。 1( 将杂交用的湿盒在37?中预热(湿盒内放有湿纸巾)。 2( 使用前在室温下将变性液pH调到7.0-8.0，把变性液加入玻片染色缸内(Coplin jar) 而后在72?1?水浴至少30min或变性液达到72?1?，使用前测量温度。 3( 使用钻石笔尖划刻标记杂交区域。 4( 将准备好的切片放入到达到72?1?的变性液中(,6片/缸)5min。Note: Verify the solution temperature before each use. 5( 用镊子从变性液中取出切片并立即放入室温70%酒精洗液中。摇动切片去除甲酰胺，让 切片在酒精中维持1min。 6( 从70%酒精取出栽玻片，放入80%酒精，再入100%酒精。 7( 载玻片的底部接触到一个小瓶子排掉载玻片上过多的酒精，用实验室纸巾擦干载玻片的 底面。 8( 放在45-50?载玻片加热器上2-5min。 探针准备 1( 室温下让探针复温，降低探针的黏度，以便探针充分准确吸取。 2( 涡流混合。把物装入试管底部，每个试管用台式离心机离心2-3秒，然后再次轻轻 涡流混合。 杂交 1( 加10uL混合后的探针到载玻片的靶区，立刻在探针上加盖22mm X 22mm盖玻片，让探 针均匀的在盖玻片下扩散。气泡会干扰杂交应该避免。探针使用后需要及时再冷冻保存。 2( 按下列方法用橡胶水泥密封盖玻片:用5mL注射器抽橡胶水泥，在盖玻片的周围注射少 量的橡胶水泥于盖玻片和载玻片交界处重叠，因此在盖玻片和载玻片周围形成密封圈。 3( 把载玻片放入预热的杂交湿盒中，盖紧湿盒的盖子37?过夜(14-18小时) 杂交后洗涤 1( 加杂交后缓冲洗液(2X SSC/0.3%NP-40)到玻片染色缸内。放进72?1?水浴中预热杂 交后缓冲洗液至少30min或液体温度已经达到72?1?。注:在每次洗浴之前洗液的温 度必须回到72?1?。 2( 室温下加杂交后缓冲洗液到第二个玻片染色缸。洗液使用1天后都要丢弃。 3( 首先用镊子轻轻拉掉密封剂，去除载玻片上密封的橡胶水泥。 4( 在室温下将载玻片浸入杂交后缓冲洗液中漂洗掉盖玻片。 5( 盖玻片小心被去掉后，吸干载玻片边缘过多液体，把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中72 ?1?2min(,6片/缸)。 6( 从杂交后缓冲液中移出每张载玻片，把载玻片放在暗处竖立空气中干燥。(关闭抽屉或 关闭贵出门足可以) 7( 加1010uLDAPI复染载玻片靶区并加盖盖玻片。在信号计算前载玻片贮存于暗处。 载玻片贮存 在暗处杂交载玻片(带有盖玻片)贮存于-20?。使用荧光显微镜时，先从-20?移出来让载玻片达到室温。