脑缺血后神经元程序性死亡与迟发性神经元坏死及相关基因的研究进展-临床医学论文

脑缺血后神经元程序性死亡与迟发性神经元坏死及相关基因的研究进展-临床医学 作者:王红艳李巍孙博谦姜立刚李海平 【关键词】脑缺血 近年来研究发现神经元程序性死亡(PCD)是脑缺血损伤过程中神经元死亡的一种形式，特别是在迟发性神经元死亡(DND)中起十分重要的作用。本文综述了脑缺血后神经元程序性死亡与迟发性神经元死亡发生的过程及可能的影响因素以及相关基因达的改变。 1程序性细胞死亡 程序性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)是细胞接受某种信号后或受到某种因素刺激后的一种主动的、以细胞DNA早期降解为特征的自杀过程，于1951年在研究动物发育时被发现。它与1972年kerr等提出的细胞凋亡(apoptosis)并不是一个概念，细胞凋亡是指有特征性形态行为及生化表现的一种细胞死亡方式，包括细胞皱缩、染色质浓集、核酸内切酶活化等特点。严格地说，PCD是功能性概念，而凋亡为形态学概念;PCD说明基因调控细胞死亡过程，而凋亡则是对多种途径引起的一系列特征性生化变化的概括。但研究发现，主动性细胞死亡同时符合PCD和细胞凋亡的定义，因此常将二者视为同一概念,1,。 1(1细胞凋亡的基本特征细胞凋亡或PCD与坏死的本质区别在于前者是一个主动的死亡过程，伴随基因转录和蛋白质合成。特殊性的变化是DNA的寡核小体间裂解，在凝胶电泳时呈现特征的“DNA梯”。细胞凋亡的形态学特点是:(1)在大多数情况下影响的是分散的个体细胞。(2)凋亡的细胞表面皱缩，失去细胞间连接，体积缩小; 细胞膜起胞或芽变，胞质浓缩;染色质收缩，浓集于核膜附近，形成新月样结构。(3)在凋亡发生后的相当一段时间内核膜保持完整，细胞器不受影响。(4)凋亡一旦开始便迅速进展，细胞裂解成小碎片，由膜结构包裹内含碎裂的染色质、完好的细胞器，此为凋亡小体。凋亡小体很快被巨噬细胞或组织细胞所吞噬，并被进一步降解、利用。(5)整个过程不伴炎性反应，不伴细胞内容物的释放，溶酶体似乎不参与凋亡过程,2,。目前大多者都结合以下3个条件做出凋亡的判断:(1)具备凋亡的形态学特点;(2)3′―OH末端标记法阳性;(3)电泳时呈现“DNA梯"样模式。细胞坏死是在理化或生物等外界因素的作用下发生的病理细胞死亡，显示被动杀死的特点，常是组织中成群细胞同步发生的。其形态学特征是内质网扩张，线粒体肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂和细胞质外溢。其DNA是被溶酶体中的DNA酶随机切割，所以在琼脂糖凝胶电泳上表现为弥散拖尾的方式。而且，坏死的细胞成分在邻近组织中可引起炎症反应。虽然凋亡与坏死是两种不同的细胞死亡方式，但有时两者却存在着诱导剂量的相关性,3,。说明两者有一定程序的统一性。 1(2PCD与迟发性神经元坏死的关系神经系统的细胞死亡可通过多种机制发生并已被描述为凋亡或坏死两种不同方式，分别涉及主动和被动细胞机制,4,。脑组织长时间缺血后发生梗死时出现神经元和胶质细胞的快速死亡(数分钟至数小时);而缺血中心区周围则为一缺血性半暗区，呈现为选择性神经元缺失，且需时较长,5,。更迟发生的迟发性神经元缺失在中度缺血数天才发生，因此称为迟发性神 经元死亡(delayedneuronaldeath，DND)，虽然早在20世纪80年代初就已明确提出脑缺血再灌注(cerebralischemiareperfusion)损伤中存在迟发性神经元死亡,6,。但将DND与PCD相结合却是在20世纪90年代才开始。近年来，许多学者利用在体脑缺血动物模型进行大量研究，从形态、生化和基因等多种角度证明，PCD存在于脑缺血再灌注损伤中，特别在迟发性神经元死亡中起十分重要的作用,7，8,。 2缺血神经元的细胞凋亡 无论是在全脑缺血还是局灶性脑缺血模型都有不少报道论及抑制蛋白质合成能减少脑缺血后迟发性神经元损伤，提示缺血性神经细胞死亡涉及大分子的合成，不完全是一种被动的坏死过程。 2.1全脑(或不完全性)缺血Macmanus,9,发现短暂性脑缺血的DNA裂解者呈现“DNA梯”。缺血后极短时间内高倍镜下可见濒死神经元核周染色质浓缩形成环状、斑片状或新月状，并有许多凋亡小体附于胞核,10，11,。沙士鼠双侧颈总动脉夹闭与5min再灌注、细胞凋亡主要见于CA1区。从再灌注48h至缺血后7天，能见到典型的“DNA梯”、3-OH标记法阳性细胞和特征性的形态学变化,12,14,，沙士鼠的10min短暂性前脑缺血再灌注，细胞凋亡也是见于海马CA1区，但于缺血12h即出现，48h达高峰，96h也可测出。细胞凋亡于CA1区的出现提示它可能与该区迟发性神经元丢失有关。核小体间DNA裂解表现早于大体组织学改变，提示DNA裂解可能是大体组织学改变的原因,15,。 2.2局灶性脑缺血Linnik,16,等在大鼠局灶性脑缺血模型的缺血区检测到了凋亡特征性的“DNA梯”样染色质改变，同时通过蛋白质合成抑制环己酰胺的脑室灌注能明显减少梗死面积。Li等人,17，18,利用原位缺口终端标记的方法显示了局灶性脑缺血时的神经元凋亡，5μm厚的鼠脑冠状切片上，对照组有0,3个凋亡细胞;大脑中动脉缺血不同时间后，再灌注48h取脑观察，10,20min的缺血能见到10,20个凋亡细胞，分布在选择性坏死区、视前区和纹状体，30,60min缺血时有30,60个凋亡神经元，亦分布在皮质的选择性坏死区，缺血90,120min可见70,200个凋亡细胞分布在梗死边缘带的内缘皮质、纹状体、海马和嗅结节。笔者在另一篇文章里报道了局灶性脑缺血，再灌注损伤的细胞凋亡与再灌注持续时间的关系。利用同样的动物模型，缺血2h再灌注0.5h,28天，发现再灌注0.5h即可出现凋亡细胞的增多，再灌注24,48h达高峰，持续再灌注28天，成群的凋亡细胞在梗死周边的内缘。缺血组织DNA凝胶电泳能见到特征性的“DNA梯”。结合免疫细胞化学方法证实凋亡的细胞大部分为神经元(占90%,95%)，部分为星形胶质细胞，提示脑缺血时细胞凋亡是一个不断发生的动态过程。这说明在局灶性脑缺血时有凋亡性神经元死亡伴随着神经元坏死，并且这种凋亡性神经元死亡主要分布在中度至重度缺血区域的半暗带附近，如能阻止这一过程可能阻止梗死范围的扩大。 3缺血神经元发生PCD的可能机制 脑缺血时与凋亡关系比较密切的几个重要方面是自由基、一氧化 氮(NO)、兴奋性毒性和钙超载因素。 3.1自由基和NO因素很多化学和物理既能诱导凋亡，也能引起氧化应激。低剂量H2O2的直接暴露能诱导多种形式的细胞凋亡。RothstEin,19,的离体实验发现对超氧化物歧化酶(SOD)的慢性抑制可造成持续数周的脊髓神经元凋亡性变性，包括运动神经元。Greenland,20,发现交感神经元除神经营养因子后发现的凋亡能被SOD或SODcDNA阻止。NO有一个未配对电子，也是自由基，也能与O2反应生成O2-和H2O2。NO也能与O-2反应生成过氧亚硝酸盐(ONO-2)，后者在降解成OH-自由基和NO2之前能扩散数微米。NO能引起巨噬细胞和单核细胞的凋亡。脑缺血及再灌注后缺血脑组织NO含量明显升高，可达基线水平的100倍,21,。Bonfoco,22,的实验发现，皮质神经元暴露于短时间或低盐浓度的过氧亚硝酸环境，能诱导以凋亡特征为主的迟发性神经毒性反应。提前用SOD和触酶(catalase)治疗能部分地阻止凋亡过程。相反暴露于长时间或高浓度的过氧亚硝酸盐环境，则诱发坏死性细胞损伤，并不能被SOD缓解。 3.2兴奋性毒性和钙超载因素Sakhi,23,将谷氨酸的类似物kainicacid静脉使用数小时后p35mRNA在kainate易损伤区表达升高，与用原位末端标记(ISEL)法显示的DNA损伤模式类似。细胞液钙浓度的升高被认为是凋亡的始动因素,24,，它可导致一连串的相应变化，主要是各种与凋亡改变有关的各种酶的激活。蛋白酶的激活使细胞结构蛋白溶解，细胞塌陷、变形、突出小泡及芽变形成;谷氨酰胺转移酶的激活使细胞质和细胞膜蛋白绞链受损。Ca2+或其他阳离子 浓度的升高还导致,300kb的DNA片断的形成，而这也需要2价阳离子Ca2+和Mg2+的参与。Ca2+和Mg2+敏感的核酸内切酶当Ca2+浓度升高时被激活，引起DNA裂解,25,，实验观察到Ca2+螯合剂和NMDA―Ca2+通道阻止50kbDNA片断的形成，并能阻止糖皮质激素处理的胸腺细胞和谷氨酰胺处理的神经元的死亡。能阻止50kbDNA片段形成的措施，也能阻止“DNA梯”的形成和凋亡。 4相关基因表达的研究 4.1即早基因(immmediatelyearlygenes,IEGS)表达的改变IEGS包括c-fos、fos-B、fra-1、c-jun、junA、junB、junD等。在正常情况下，IEGS在绝大多数细胞包括神经元中呈极低水平表达，参与细胞生长、繁殖、分化、信息传递、学习和记忆等过程。其中c-fos、c-jun在神经元PCD中的作用受到重视。许多外界刺激，如脑缺血都可诱导中枢神经元中c-fos基因表达。在培养的神经细胞中，神经生长因子、神经递质、去极化状态和钙离子内流等因素也能引起c-fos基因的一过性表达,26,。由于c-fos基因是刺激激活神经元的第二信使与目的基因表达间信息传递中介物，因此它又被认为是神经元的一种第三信使。 c-fos基因是FBJ和FBR小鼠成骨肉瘤病毒中致癌基因v-fos的细胞同源序列，其核酸顺序已经明确。人类与鼠c-fos基因具有同源性，人类该基因定位于染色体14q,21,23,。 c-fos基因转录产生一2.2kD的成熟mRNA。由于在3′端非翻译区存在AT丰富的不稳定顺序，故其半衰期短，常于刺激后5min内 出现，逐渐累积，在30,50min达峰值，之后以约12min的半衰期下降,27,，可利用基因探针通过分子杂交，特别是原位杂交组织化学方法显示。 c-fos基因的蛋白产物FOS是核内磷酸化蛋白，由380个氨基酸组成，分子量为55kD，其半衰期短(约2h)。FOS可利用FOS抗体通过免疫组织化学方法显示。FOS含一亮氨酸控链(leucinezipper,LZ)结构，能与DNA特异顺序结合。FOS与c-jun基因的蛋白产物JUN在细胞核内通过LZ结构形成异源二聚体复合物――转录因子AP-1(activationprotEIn1)，以高亲合力结合在靶基因的AP-1位点，进一步激活靶基因的表达而最终对刺激做出反应,27,。Abe等研究表明鼠脑缺血5min后可诱导海马区原癌基因c-fos和c-jun迅速而短暂的合成，对缺血耐受好的齿状回和CA3区明显而缺血敏感的CA1区最少,28,。Dragunow,29,比较两种缺血条件下IEGS的表达，发现迟发性神经元死亡在组织损伤区神经元和非损伤区神经元有IEGS蛋白产生，而坏死组仅在非损伤区神经元有即早蛋白产生，并且c-jun在迟发性而不是坏死的神经元内延期表达。刘亢丁等,30,用逆转录-多聚酶链反应检测局灶性脑缺血及再灌注后c-fos和c-jun基因表达发现缺血中心c-fos和c-jun仅呈低水平表达或根本不表达，而且这种现象随缺血时间的延长而更加明显。缺血30min后再灌注的可诱导缺血中心的c-fos和c-jun表达，而缺血90min后再灌注则不能诱导。缺血区外周组织c-fos和c-jun大量表达，非致死性局灶缺血(15min)的缺血中心的有c-fos和c-jun大量表达。这些都说明在缺血区内能幸免 于缺血损害的细胞存在c-fos和c-jun诱导表达，而一定量的局部脑血流是产生表达的保证。早有报道Ca2+的内流可诱导c-fos和c-jun的表达，细胞内Ca2+增加可通过激活蛋白激酶，特别是Ca2+/CaM激酶，对转录因子进行磷酸化修饰等途径诱导神经细胞c-fos表达,31,34,。 4.2bc1-2基因家族bcl-2是从小鼠B细胞淋巴瘤中分离得到的原癌基因，编码26kD的胞浆膜蛋白。bcl-2家族是目前研究得较为深入的与PCD密切相关的基因，包括bcl-2,bcl-Xl,bcl-Xs和bax。现发现bcl-Xl和bcl-2具有相同功能，抑制PCD发生，bcl-Xs和bax拮抗bcl-2和bcl-Xl的功能，促进细胞发生PCD。Chen,35,等利用免疫组化和Westernblot技术，观察大鼠局灶性缺血60min和120min再灌注24h后bcl-2表达情况，发现缺血60min组可诱导非梗死区额顶皮质神经元产生bcl-2蛋白，在缺血120min组梗死区边缘亦存在bcl-2蛋白，Westernbolt证明仅缺血组存在26kD的特征性蛋白带，结果提示:脑缺血再灌注时在亚致死性损伤中有bcl-2蛋白产生，bcl-2参与并影响缺血后神经元存活。Martinou等,36,研究表明，转基因小鼠bcl-2的过度表达既可防止缺血性神经细胞死亡，也可防止自然发生的神经细胞死亡。另有研究,37,表明脑缺血10min在一些敏感区如CA1和小脑Purkinje细胞bcl-2呈低表达，而bax大量出现。缺血后0.5,3h内，许多脑区bax大量增多，形态上出现神经元退化。在短暂缺血早期，bcl-2、bcl-X蛋白在神经元亚群中有稳定表达，但从3h后，形态上发生退化的神经元均出现bcl-2下降，特别是bcl-Xl减少，说 明bcl-2基因及其他一些成员在神经元缺血敏感性上起十分重要的作用。缺血后bax、bcl-2、bcl-Xl的表达改变参与了迟发性神经元死亡。 5其他基因的表达 Fas抗原是一种细胞表面蛋白，属TNF受体家庭成员，也参与了神经元PCD，在小鼠短暂性全脑缺血后，FasmRNA显著增加,38,。p53是最常见的促PCD基因，具有降低bcl―2，升高bax蛋白的作用。Crumrine,39,利用转基因小鼠证明，缺失p53基因对缺血有保护作用，降低p53表达则效果更好。 6展望 目前可以肯定缺血性损伤中有PCD成分，但其具体分子机制，在缺血损伤中的地位与迟发性神经元死亡、坏死的关系等人们知之甚少。真正的PCD基因实际上仍未发现，但是，随着研究的不断深入，人们对缺血性脑损伤的机制相关基因的认识将有新的突破，通过药物、基因调控手段及其他方法阻止神经元PCD将成为可能。 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