蔗糖铁氧化应激反应和内皮细胞功能障碍

蔗糖铁氧化应激反应和内皮细胞功能障碍 蔗糖铁引起的体内氧化应激反应和内皮细胞功能障碍 European Journal of Clinical Investigation (2002), 32 (Suppl.1), 9-16 T. M. Rooyakkers*?, E. S. G. Stroes*, M. P. Kooistra†, E. E. van Faassen‡, R. C. Hider?, T. J. Rabelink* and J. J. M. Marx? *Department of Internal Medicine, University Medical Center, Utrecht, The Netherlands, †Dianet, Utrecht, The Netherlands, ‡Debye Institute, University Utrecht, The Netherlands, ?Department of Pharmacy, School of Health and Life Science, King’s College London, UK, ?Eijkman-Winkler Institute, University Medical Centre, Utrecht, The Netherlands 摘要 背景 静脉补充铁剂在血液透析病人中已得到广泛应用。但是，静脉补充蔗糖铁后增加的非转铁蛋白结合铁(NTBI)被认为在体外氧自由基产生中起催化剂作用，可在体内引起内皮损伤。和方法 在20名志愿者中注射100mg蔗糖铁。应用血管超声评价注射前、注射蔗糖铁后10min和240min三个时间点内皮依赖的血管扩张程度。收集全血检测NTBI，用电子自旋共振法评价体内氧自由基形成。对照组注射生理盐水。结果 注射蔗糖铁使NTBI升高超过基础值4倍。与注射生理盐水组相比，注射蔗糖铁10min后血流介导的血管扩张有暂时而明显的减弱。注射蔗糖铁10min,240min后全血超氧化物的产生分别增加了70%和53%。 结论 目前治疗量的静脉用铁剂导致氧化应激增强和急性内皮功能障碍。 关键词 内皮功能，蔗糖铁，血流介导的血管扩张，一氧化氮，氧自由基，超氧化物 重组人红细胞生成素(r-HuEPO)治疗终末期肾性贫血的疗效很大程度上取决于红细胞生成过程中铁的利用。血透和腹透时影响铁的吸收，鉴于已有的发现，补充铁剂可以大大提高病人对r,HuEPO的反应，因此许多透析病人均定期接受补铁治疗。最近我们发现，静脉注射100mg标准剂量铁剂后，这些病人的非转铁蛋白结合铁(NTBI)增加超过4倍。尽管这种NTBI池增加的临床意义尚不清楚，但已有体外研究显示，NTBI在毒性氧自由基形成过程中起到催化剂的作用。 以往的研究已经强调了内皮细胞和作为防止粥样硬化改变的一线防御机制的一氧化氮(NO)，特别是内皮来源的NO之间有关联。实际上，NO利用受损在心血管风险增高的病人中普遍存在。当多种心血管危险因子存在时，如脂质代谢紊乱，高半胱氨酸血症和糖尿病时，NO生物利用受损与超氧化物导致的NO降解增加有关。反应的结果产生强氧化剂，过(氧化)亚硝酸盐，这种物质被认为参与 了内皮下的脂蛋白氧化。NTBI也可以通过氧自由基的形成使内皮来源的NO失活。 本研究的目的是为了证实，在健康志愿者中静脉注射目前作为常规治疗剂量的蔗糖铁是否会损害NO的生物利用，也就是能否造成内皮功能障碍。我们还研究了NTBI、氧化应激和内皮功能变化之间的关系。调查的健康志愿者中包括吸烟和不吸烟者。 一、方法 (一) 受试对象 研究人群包括20名健康男性志愿者，平均年龄24岁(19-38)，均通过广告征集。每个受试者都通过询问简短病史包括吸烟史进行筛选。所有受试对象血压正常(收缩压,140mmHg，舒张压,90mmHg)，血脂正常(胆固醇,5.5mmol/L)，在受试期间不服用任何药物。所有受试者填写知情同意书。所有研究按照专业学会指南进行。受试群体的临床见表1。 表1 受试人群的临床资料 全组 非吸烟者 吸烟者 数量 20 10 10 年龄(岁) 25?8 23?5 25?10 血红蛋白(mmol/L) 9.3?0.7 9.2?0.7 9.4?0.6 平均红细胞容积(fL) 88?5 88?4 89?7 总胆固醇(mmol/L) 4.5?0.6 4.4?0.7 4.6?0.9 血清铁(umol/L) 23.4?10.1 25.1?13.1 21.7?5.9 血清转铁蛋白(g/L) 2.4?0.3 2.5?0.4 2.3?0.2 转铁蛋白饱和度 0.40?0.18 0.43?0.23 0.37?0.11 铁蛋白(ug/L) 79.2?42.6 74.5?45.8 63.9?41.0 吸烟量(支/天) 0 11?7、 (二) 药物注射 100mg蔗糖铁(Venofer,Vifos,St Galleu,Switzerland)加入100ml0.9%Nacl在20min内输完。在第二阶段采用相同的方法输注100ml0.9%Nacl。 (三) 实验方案 受试者在独立安静的房间内接受测试。研究开始前12h禁酒精、咖啡因、巧克力和香烟，并从午夜开始禁食。为避免与注射蔗糖铁10min后的血流介导的血管扩张(FMD)相互干扰，在初筛时就测定硝酸甘油反应的基线水平。每一个项 目进行前，均于左前臂血管内置一20号的聚乙烯导管，血液标本由此导管抽取。每一个受试对象都进行以下实验:?FMD基线水平测定;?静脉注射蔗糖铁;?静脉注射后等待10min，再次测定FMD水平及对舌下含服硝酸甘油(NTG)的反应;?注射蔗糖铁4h后第三次测定FMD及NTG。运用同样的，18名志愿者在注射蔗糖铁至少1周后注射了100mlNaCl。研究中，两名志愿者因故未能参加进一步测试。所有资料均在研究完成后由“被盲”员进行分析。 (四) 管壁追踪系统测定血流介导的血管扩张 肱动脉的舒张反应按照既往描述的方法由超声波测定。简单地说，所有的测定均通过一种管壁追踪系统WTS(Pie Medical Maastricht,The Netherlands)完成。志愿者取仰卧位，连接三个心电图导联，血压计袖带置于右臂肘下。通过一个7.5MHz的传感器显示右前臂肱动脉。血压计袖带充气后，超声探头探及前臂远端缺血，既而出现的血管直径增大依赖于内皮细胞NO释放。超声描计5min，每隔20s测定一次血管内径。FMD定义为:(缺血后血管内径,基线水平内径)/基线水平内径。组内和组间的变异系数分别为3.6%和3.8%。然后舌下含服0.4mg硝酸甘油测定不依赖于内皮细胞的血管扩张。 (五)实验参数 分析全血测定血红蛋白、平均红细胞体积、血清铁、转铁蛋白和NTBI。注射蔗糖铁结束10min、240min后收集标本测定血清铁和NTBI。随机化亚组中，在相同的三个时间点用电子自旋共振(ESR)测定全血自由基的产生容量。 1(铁结合力和铁饱和度 血浆铁结合力由血清转铁蛋白浓度计算。1mol的转铁蛋白代表2mol铁结合点。因此，转铁蛋白结合力可以通过下面的公式计算:转铁蛋白结合力(umol/L),血清转铁蛋白(g/L)×25.14。当血浆中所有铁结合点都定位在转铁蛋白分子上时，总的血浆铁结合力等于转铁蛋白结合力。转铁蛋白饱和度的计算:转铁蛋白饱和度,血清铁(umol/L)/转铁蛋白结合力(umol/L)。 2(NTBI的定量 NTBI按照以往的方法测量。简要过程:标本收集后,20?冻存至检测。加入可以和血清蛋白、柠檬酸和其他的配体非特异结合的氨基三乙酸(NTA)鳌合，去除所有NTBI，为防止此过程中铁从NTA置换到未饱和的转铁蛋白中，标本中 加入三碳酸钴预处理。得到的溶液注入无金属的HPLC系统。每个项目都进行重复测试。 3(电子自旋共振 Phenyl-tert-butylnitrone(PBN)购自Molecular Probes Europe(leiden，The Netherlands)。全血标本在PBN液(浓度20mM)中孵育15min，离心(300g,5min)，弃血清，0.9%NaCl洗红细胞层。用含氯仿、甲醇和部分水的溶液抽取洗涤过的红细胞层(Folch extraction)。氯仿层速冻保存于,80?。测定前，蒸发氯仿，干标本用250uL氯仿重溶。用氯仿无水硫酸钠脱水，用氮气脱氧ESR实验在改良的装备有一个工作于TE102模式下的Bruker方形槽的300X分光光度计上进行。200uL标本用注射器吸入石英毛细管中。操作均在室温下进行，使用10mW、频率为9.44GHz的微波能源。在扫描宽度为50高斯的3358高斯的磁场下描计PBN 5的光谱。磁场以100kHz的频率调整。探测器增益为6.3×10，时间常数655ms，模,数转换(ADC)转换时间82ms。累积4次扫描以增强信噪比(S/N ratio)，比较信噪比进行信号的定量分析。 (六)统计分析 所有结果以均数?标准差表示，实验数据进行成对资料的t检验。正态性检验失败则用Wilcoxon’s符号等级检验。同一个注射组内结果用单向 ANOVA法进行分析，不符合正态分布则用单向重复ANOVA检验。运用Student-Newman-Keul’s检验检出与其他组有差异的一组或几组。蔗糖铁组和生理盐水组间差异用双向重复ANOVA检验。P,0.05认为有统计学意义。FMD，NTBI，和氧自由基产物之间的关系进行线性回归分析。 二 结果 (一)实验室结果 表1显示受试人群实验室指标的基线值。注射100mg蔗糖铁后使血清铁和NTBI持续升高直至注射后4h(表2)。血清中铁的参数均在蔗糖铁存在时评价。正如后面对此的讨论，尚不清楚蔗糖铁存在时，总结合铁和/或转铁蛋白饱和度标准检测是否可靠。 铁剂引起的实验指标的变化 注射前 注射后10分钟 注射后4小时 * * 血清铁(umol/L) 23.4?10.1 130.3?12.860.1?14.6 * * 转铁蛋白饱和度 0.40?0.18 2.26?0.461.09?0.15 * * NTBI(umol/L) ,0.2?2.3 2.1?2.53.3?2.2 * * 自由基活性 , 70?6053?36(上升百分比) *与注射前相比P,0.05 (二)血管舒缩 注射蔗糖铁10min后，与非吸烟者相比，吸烟者FMD损伤有加重倾向。但这种差异没有达到统计学上显著性。图2显示注射蔗糖铁与154mMNaCl 10min、240min后的比较。与注射生理盐水的基线水平相比，注射蔗糖铁10min后FMD的下降有统计学意义。240min后，FMD与基线水平不再有明显差异。另外，注射蔗糖铁和时间对照之间的FMD基楚值没有明显差异，因而排除了注射顺序对血管扩张反应的影响。注射蔗糖铁和NaCl后不依赖内皮的血管扩张是相似的。 图1 吸烟者与非吸烟者在注射蔗糖铁前及注射后10、240分钟血流介导的血管舒张(FMD)变化。黑色代表非吸烟组，白色代表吸烟组。两组在注射蔗糖铁10分钟后FMD均有明显下降，且吸烟组较非吸烟组下降更显著。在注射后的240分钟，两组FMD与注射前相比无明显差异。 图2 注射蔗糖铁或生理盐水前及注射后10、240分钟血流介导的血管舒张(FMD)及对硝酸甘油反应的变化。实心圆代表注射蔗糖铁后的FMD，空心圆代表注射生理盐水后的FMD。上图代表注射前和注射后10分钟、240分钟的内皮依赖的血管舒张变化。下图代表与上图相同时间点并含服硝酸甘油后非内皮依赖性的血管舒张。 (三)氧自由基形成 图3显示了典型的基础及注射蔗糖铁后氧自由基活性。X轴代表磁场强度，单位高斯(G)。Y轴，信号的幅度，是反应槽中旋转内收数量的测定结果。通过比较注射蔗糖铁前后的信噪比衡量信号的强度。采用这种方法，我们发现，全 血中的超氧化物产生在注射10min、240min后分别增加了70%和53%。(图4)FMD也随之下降。线性回归分析显示FMD、NTBI和氧自由基之间没有明显的相关。 图3 注射蔗糖铁前(上)和注射后(下)电子自旋共振(ESR)频谱。X轴代表高斯为单位的磁场强度;Y轴代表信号强度。上图:注射蔗糖铁前全血中的PBN标准ESR频谱;下图:相同个体注射蔗糖铁10分钟后PBN的ESR频谱。本图中的较高的峰值提示注射蔗糖铁后全血PBN的升高。 图4 注射蔗糖铁前及注射后10分钟、240分钟非转铁蛋白结合铁(NTBI)、氧自由基活性和血流介导的血管舒张(FMD)变化。左侧代表与注射前相比，注射蔗糖铁后10分钟、240分钟NTBI稳定性增高。中间表示注射蔗糖铁10分、240分钟后氧自由基形成明显增加。右侧显示注射后10分钟、240分钟FMD下降的百分比，10分钟时FMD下降显著。* 与注射前相比，P〈0。05。 三 讨论 本实验中，我们证实血透病人在静脉注射常规剂量的蔗糖铁后，体内的NTBI增加了4倍，FMD也有暂时的下降。与之相伴的是全血氧自由基在注射后增加。 以往的研究结果提示铁可能是动脉粥样硬化过程中一个重要的因子，铁储存的增加与心血管风险的增加相关。NTBI可能作为氧自由基形成的催化剂，其水平的升高，可能是动脉粥样硬化过程中最主要的因素。有意思的是，心血管风险增高的组几乎都有NTBI升高的特征。血透病人有明显的NTBI的升高，而且在注射蔗糖铁治疗后引起NTBI水平升高了5倍，提示心血管风险增加。遗传性血色素沉着症病人的心血管风险增加，杂合子的血色素沉着症患者心血管风险及死亡率尤高。 在本研究中，我们观察到注射蔗糖铁后10min内FMD的明显降低，但4h后又恢复到基线水平。相反，NTBI则在4h内稳定升高。FMD(经过4h恢复正常)和NTBI(持续升高至4h)之间的这种差异提示NTBI与FMD的损伤无直接关系。 我们以前的研究证明，与非杂合子携带者相比，在遗传性血色素沉着症杂合 子个体中，吸烟与心血管风险增加相关，提示吸烟与铁水平的协同作用。在本研究中，我们在吸烟者和非吸烟者的比较中未能证实注射蔗糖铁对吸烟者有更坏的影响。但由于我们为检测蔗糖铁直接的血管效应，测定的是不吸烟12h后注射蔗糖铁的结果，所以不能排除吸烟和铁水平的协同作用。以前已经证实在年轻的吸烟者中，吸烟对内皮细胞的不良作用10min内达到高峰，这种不良作用可在90min内恢复。 NTBI和氧急性应激:在一个随机化亚组中，通过全血电子常磁性共振法评价注射蔗糖铁后对氧自由基形成的影响，显示注射后全血超氧化产物显著增加。这与血透病人注射蔗糖铁后超氧化物歧化酶活性下降及相应的血浆脂质超氧化物增加的观察结果一致。NTBI水平持续升高直至注射后4h。相反，在氧自由基形成方面，与注射10min相比，注射蔗糖铁后4h氧自由基的生成已经下降。因此，结合4h时已经正常的FMD反应，NTBI看来不是氧自由基生成和FMD损伤的原因。 本研究中的NTBI是尚未与转铁蛋白的两个特异结合位点中的任何一个结合的血清铁。NTBI的化学形式尚未确定，可能由多种分子组成。由于NTBI的化学活性，临床上检测这些含铁分子的种类是有意义的。接受静脉注射蔗糖铁的个体中，最初的NTBI为大分子铁(III)和蔗糖。大部分的铁被安全地屏蔽在分子的核心，但部分表面的Fe(III)释放并与转铁蛋白结合，通过我们的实验发现，也可能与NTA结合。铁从蔗糖铁复合物中释放非常缓慢，凝胶电泳定量检测各种转铁蛋白分子(脱水转铁蛋白，单价和二价转铁蛋白)几乎没有发现向二价铁的转移，可以作为对前者的解释。本文显示血浆中的铁原子以一种催化活性形式从蔗糖铁复合物上脱离或暴露于表面。我们没有观察到氧自由基产生和内皮细胞功能之间有明确的关系，相对于NTBI，实验中采用的NTBI检测方法只能检测到一部分活性的铁原子，而循环的蔗糖铁大分子显然带有HPLC方法不能检测到的另外的铁原子。后者可能与氧自由基活性增高及注射蔗糖铁10min后对血管的不利影响有关。 铁剂导致的内皮细胞功能障碍:蔗糖铁是全世界广泛使用的治疗终末期肾衰的静脉用铁剂，曾被认为没有毒性，而这些ESRD病人已有并发动脉粥样硬化的危险。最近，越来越多的证据表明内皮细胞功能有预测远期心血管事件的价值。 相应地，各种致动脉粥样硬化危险因子如脂肪、糖、蛋氨酸负荷的急性调节也已 经与FMD反应的产生相关连。然而，这些内皮细胞急性波动的病理生理关联性尚 未明确，如何预防这些短期不良的血管舒缩反应已经引起了关注。本研究发现， 健康志愿者注射一个目前治疗剂量的蔗糖铁会导致可逆性的血流介导的血管扩 张的损害。 在健康的年轻志愿者中的这些发现与那些常规接受静脉补充铁剂的血透病 人可能有什么样的相关性,首先，必须注意到，活性铁水平在血透病人中已经升 高，并在这些个体接受静脉补充蔗糖铁后长时间居高不下。这种蔗糖铁对血管舒 缩的不良反应在血透病人是否可以恢复尚未明确。其次，血透病人已有内皮细胞 功能障碍。在这些病人中有促使这些功能性改变的几种危险因素，包括高血压、 脂质代谢紊乱、高半胱氨酸血症和不对称性二甲基L,精氨酸水平升高。应记住 的是血管功能障碍多因素的特点会干扰对单一因素效应的准确评价，例如，会影 响注射蔗糖铁对血透病人内皮功能影响的评价。 References 1 Kooistra MP, van Es A, Struyvenberg A, Marx JJ. 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