抗核小体抗体的检测与临床应用进展

抗核小体抗体的与临床应用进展 ,摘  要, 核小体是染色体的功能亚单位～是DNA与组蛋白形成的复合体～存在于细胞核中。在系统性红斑狼疮(SLE)发生中～核小体是主要的自身抗原～抗核小体抗体是SLE的早期的指标之一。许多文献认为抗核小体抗体是诊断SLE很好的标志～它优于抗dsDNA～敏感度高～且有很高的特异度。抗核小体抗体主要应用ELISA法检测～由于核小体抗原纯化制备方法的不同～抗核小体抗体的检测方法也由第一代发展到第二代。随着抗原纯化技术的提高～极大提高了抗核小体抗体对SLE的特异性～已开始应用于临床常规检测。 ,关键词, 核小体,自身抗体,系统性红斑狼疮 核小体是染色体的功能亚单位～是DNA与组蛋白形成的复合体～存在于细胞核中。传统的观点认为～dsDNA、抗 dsDNA抗体复合物在狼疮肾炎发病机制中起主要作用～但是游离、裸露的DNA在血液循环中并不存在,1,。有人从系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中检测到核小体～证实DNA是以核小体的形式存在于外周循环中,2,～确定了外周血中游离的核小体是细胞凋亡所产生的寡聚核小体～并认为在SLE发生中～核小体是主要的自身抗原～并且这种核小体的 免疫原性很强～驱动辅助T细胞进行自身免疫应答～诱导产生抗核小体抗体(anti nucleosome antibodies, AnuA)。有实验明～AnuA仅对天然的核小体以及核小体亚结构(H2A H2B)DNA起作用～而并不与其中的DNA或组蛋白起反应～且AnuA的形成又先于抗dsDNA抗体和抗组蛋白抗体的产生～因而AnuA可能是SLE的比较早期的指标。近年来～虽然国内对AnuA研究尚少～但其对SLE的诊断价值在国际上已成为一个热门话题～认为AnuA是诊断SLE很好的标志～它优于抗dsDNA～敏感度高～且有很高的特异度,3,～AnuA主要应用ELISA法检测。近年由于抗原纯化技术的提高～极大提高了AnuA对SLE的特异性～已开始应用于临床常规检测。本文将针对核小体及其自身抗体的检测方法、分离纯化技术、临床特异性以及近期新的研究进展进行一综述和讨论。 1  核小体的结构 核小体(nucleosome)是真核细胞染色质基本重复结构的亚单位～对于细胞核中DNA的组成非常重要。在电子显微镜下～核小体呈“串珠”状～染色质原纤维就象一条串珠～由紧密排列的核小体组成。核小体的核心含有成对出现的四 种核心组蛋白(histone)H2A、H2B、H3和H4～8个带正电荷的组蛋白分子(H2A、H2B、H3和H4各2个分子)形成组蛋白八聚体～146个双螺旋DNA碱基对环绕其两周～呈扁圆形～分别由2个H3和H4分子组成的四聚体复合物～构成核小体核心颗粒的内部(如图1左)。H2A H2B二聚体位于核小体的表面～此结构H1占据核小体顶部位置～通过50 bp，60 bp的DNA链与相邻核小体连接～H1参与螺旋DNA的聚合和解离(如图1B)。 图1  核小体的基本结构(图1A为核小体核心颗粒),略, 近年研究表明～核小体是SLE的主要自身抗原～可能与SLE发病及病理变化直接相关。SLE患者细胞凋亡异常导致的核小体过度释放～可能是本病免疫异常的主要诱发环节之一。核小体及其特异性自身抗体除了在致病机制方面成为近年来SLE研究的最活跃的领域～抗核小体抗体在临床中对SLE诊断和治疗的作用也得到重视。临床研究提示～抗核小体抗体与SLE疾病活动性及狼疮性肾炎的发生明显相关～可能是SLE的特异性抗体之一。 2  AnuA(抗核小体抗体,以下简称AnuA)的临床意义 2.1  AnuA的定义与回顾  AnuA被定义为与组织蛋白暴露在染色质的部分发生反应的抗体～在染色质内找到的DNA结构～或者一个由天然组织蛋白 DNA复合物构成的表位～特别要排除的是抗体与非组织蛋白的反应和隐藏在染色质内的组织蛋白表位的反应～以及与DNA结构如A、C以及Z构型的反应。这些在染色质中均不存在～因此～并不是所有组织蛋白和DNA活性的抗体都具有抗 染色质活性。染色质作为ELISA中的抗原最有用的构型是脱 H1染色质和核小体核心粒子。在这两种情况下～天然染色质通过微球菌核酸酶消化溶解～H1和非组织蛋白被除去～再用0.5 M生理盐水在中性pH条件下而得染色质。核小体核心粒子由包裹在天然组织蛋白(H2A、H2B、H3、H4)八聚体DNA组成。多元核小体核心粒子～DNA链未被核酸酶切断时～叫做H1 修饰染色质。在过去的几年里已经开始重新关注AnuA。AnuA是首批被发现的自身抗体之一～因为它们是组成引起红斑狼疮的细胞排列构造的大多数抗体。许多研究资料,4～5,表 明了这种抗体辅助诊断系统性红斑狼疮和药物引起的狼疮(DIL)的临床应用～并且从某种意义上来说～AnuA的定量曾是在临床实验室所进行的最普遍的免疫学实验之一。AnuA在过去的10年里曾有过许多的名字:红斑狼疮因子、抗核小体、抗DNP以及抗 (H2A H2B DNA)～这些自身抗体可在近乎75%的系统性红斑狼疮患者身上找到～并且有达100%的患者是由药物引起的～它们也可在20%，50%的1型自身免疫型肝炎患者身上找到。 2.2  AnuA的临床意义  在80%的MRL/lprDIL小鼠中可产生核小体特异性抗体～该自身抗体产生早～先于其他抗核抗体～与肾小球肾炎有关。SLE患者多克隆核小体特异性自身抗体的抗原反应与鼠类SLE模型表现相似～核小体在SLE中作为主要自身抗原近年已得到证实。靶器官中免疫复合物的沉积和炎性介质(包括补体)的大量活化是引起SLE全身性组织炎症损伤的基本机制之一。核小体会成为多克隆B细胞活化剂～这可能与SLE疾病的起始阶段有关,但更重要的是～核小体是SLE中致病性T辅助细胞识别的自身抗原～不仅引起同源B细胞产生核小体特异性自身抗体～而且引起抗DNA抗体和抗组蛋白抗体的形成。文献报道～AnuA在抗ds DNA阴性的SLE患者中有很高的阳性 率(可达60%~65%),8～16,～因此AnuA对SLE患者更具有诊断价值。最近有证据表明～除了传统的致病性抗双链DNA抗体及其抗原抗体复合物外～核小体和组蛋白成分的自身抗体及其抗原抗体复合物～在SLE的发病机制中起关键作用～尤其是在DIL肾炎致病机制上意义重大,6,。核小体的组蛋白成分(氨基末端带强阳性电荷)可促进免疫复合物与肾小球基底膜阴离子位点的结合～包括既作为植入抗原使原位免疫复合物得以形成～也可使含有核小体 核小体特异性抗体的循环免疫复合物得以沉积。在以上两种情况下～均可使肾小球基底膜的通透性增加～且产生炎性免疫应答反应。钟清等,7,研究表明～LN组患者AnuA阳性率明显高于无肾炎组～AnuA对LN的诊断和监测具有重要意义。此外～苏茵等,8,也发现AnuA与患者的皮疹、脱发、ESR增快、CRP增高、补 1体降低呈显著相关性～其滴度高低也与SLE疾病活动指数评分呈明显正相关。 2.3  AnuA的临床特异性和敏感性  有两项关于AnuA重要评论表明这种抗体对SLE和DIL具有敏感性和特异性～并且AnuA的存在通常在SLE与肾小球肾炎患者中相联系。AnuA较抗DNA具有更高的敏感性。统计资料表明～如果阴阳性分割点升高～能使抗核小体对狼疮更加敏感。 近年来～由于核小体抗原纯化技术的改进～提高了AnuA对SLE患者的诊断特异性。研究结果表明～应用ELISA方法检测AnuA在SLE患者中具有很高的敏感性和特异性。国外报道,9～10,～对SLE患者进行AnuA检测～起敏感性和特异性分别为56.0%~64.2%和97.0%~98.8%～国内苏茵等,8,提出～AnuA可出现于SLE疾病进程的各个时期～对SLE的敏感性高(69.9%)、特异性强(97.9%)～可能是SLE的标记抗体之一～但许苛等,11,报道测定敏感性偏低(55.8%)、特异性偏低(95.3%)。考虑与AnuA的来源不同、检测人群和疾病活动度不同以及所用实际不同有关～但是与ds DNA抗体、抗Sm抗体比较～敏感性均有了较大的提高～且有良好的特异性～可用于SLE的诊断,6,～同时～多种商品化检测试剂盒的出现～使该自身抗体应用于临床SLE等结缔组织病的诊断和鉴别诊断成为可能。 2.4  AnuA的检测技术 2.4.1  检测AnuA的技术  许多不同的技术已被用于检测AnuA～除了LE细胞试验以外～还有染色质包被的串珠乳胶凝集试验,12,～以及免疫沉淀,13,(用天 然组织蛋白重组酸萃取的组织部分,14,)和ELISA法都已被使用。早期的研究用“脱氧核苷蛋白”作抗原,12～13,研制出一种孵育在1 M生理盐水中的染色质中的预备品～但未得到明确鉴定。后期报道已有更好的方法来鉴定该预备品～并能凝胶电泳后的蛋白质和DNA的组成,15,。染色质的类型分析以及阴、阳性判断对于辅助诊断SLE患者而获取高敏感性和特异性是非常重要的。第一种研究用于以变性的H2A和H2B作为抗原进行DNA再造～由血清结合上组织蛋白的变性区域～即天然染色质非暴露部分,13,,第二种研究用于整条染色质作为抗原～剩余的Scl 70蛋白引起抗Scl 70～血清在此情况下产生弱阳性,17,,第三种研究用于一个阴、阳性的弱的(低的)判断(硬皮患者血清呈现弱阳性),18,。 2.4.2  第一代与第二代核小体检测技术的比较  通过对SLE组(96例)、患者对照组(73例)、正常对照组(47例)进行AnuA和抗dsDNA抗体的检测～采用由德国EUROIMMUN公司生产的试剂盒和美国Coda公司生产的全自动酶标分析仪检测,19,。结果表明～EUROIMMUN推出的第二代抗核小体抗体ELISA检测试剂与第一代比较敏感度差异不大～但特异性却有了明显提高。早期因核小体抗原纯化制 备方法存在技术上的问题～纯化的核小体抗原常含有H1、Scl 70(DNA拓扑异构酶I～一种DNA结合蛋白)、残留的染色质DNA和其他非组蛋白等蛋白成分～导致多种结缔组织病患者血清与核小体抗原交叉反应～尤其是在10%，68%的硬皮病患者中也可检测出AnuA～使得该抗体作为SLE特异性抗体的临床应用价值得到了很大的限制,而第二代AnuA ELISA试剂在抗原的制备上有了很大的改进～抗原分离纯化技术提高～纯化的核小体抗原制品只含核小体单体～不含以上提到的DNA和组蛋白等杂质成分～可排除硬皮病患者血清假阳性反应～这样就使得AnuA对SLE的诊断价值得到了充分的发挥～极大提高了AnuA对SLE的特异性～目前已开始应用于临床常规检测。 3  AnuA的研究新进展以及注意 目前～国内已有少数医院开展了AnuA的检测～也已发表了数篇相关报道。有文献报道～以核小体多肽特异性抗原治疗鼠狼疮模型的研究发现～核小体多肽特异性抗原可以抑制TH细胞和B细胞的激活～从而为研究SLE的发病机制治疗带来了新的曙光,20,。但需要指出的是:AnuA的检测 对SLE的诊断有重要意义～不同的核小体来源、不同的检测人群和疾病活动度、以及检测试剂、方法等均会带来结果差异。该抗体与抗Sm抗体不同～并非是SLE标记抗体。虽然已发现AnuA对诊断SLE的敏感性和特异性比抗dsDNA抗体高～但仍有不完全一致的结果。我国的情况如何还应进行大样本、多中心检测从而得到更合理、更准确的结论。SLE的诊断不能仅凭某一种抗体阳性与否加以肯定或否定～在建立该抗体检测前首先要明确其临床意义～其次～要避免假阳性或假阴性结果～如同其他自身抗体的检测一样～临床医师在诊治工作中必须密切结合患者的临床资料～正确看待检测结果～切勿以实验室检查代替一切。 参考文献: ,1,  Van Bruggen MC,Kramers C,Berden JH.Autoimmunity against and lupus nephritis,J,.Annal Med Internem～1996,147(7):485. ,2,  Berden JH.Immunology in medical practice.,1,.Disseminated lupus erythematosus: disturbed apoptosis,J,.Ned Tijdschr Genesskd,1997,141(39):1848. ,3,  Suer W,Dahnrich C,Schlumberger W,Stocker W.Artoantibodies in SLE but not in scleroderma react with protein stripped nucleosomes,J,. J Artoantibodies～2004～22:325 334. ,4,   Cervera R,Vinas O,Ramos Casals M,Font J,Garcia Carrasco M,Siso A,Ramirez F,Machuca Y,Vives J,Ingelmo M,Burlingame RW.Antichromatin antibodies in systemic lupus erythematosus:a useful marker for lupus nephropathy,J, . Ann Rheum Dis～2003～62:431 434. ,5,  Min DJ,Kim SJ,Park SH,Seo YI,Kang HJ,Kim WU,Kim HY.Anti nucleosome antibody:significance in lupus patients lacking anti double stranded DNA antibody,J,. Clin Exp Rheumatol～2002～20:13 18. ,6,  龚宝琪～齐文成.抗核小体抗体与系统性红斑狼疮相关性的研究进展,J,.国外医学内科学分册～2006～4(4):154 156. ,7,  钟清～甘华～陈瀑～等.抗核小体抗体与系统性红斑狼疮相关研究,J,.中华风湿病学杂志～2003～7(2):111 113. ,8,  苏茵～韩蕾～粟战国～等.抗核小体抗体测定在系统性红斑狼疮诊断中的意义,J,.中华风湿病学杂志～2003～7(8):474 477. ,9,  Bruns A, Blass S, Hausdorf G, et al.Arthritis Rheum,J,, 2000,43:2307 2315. ,10,  Chairns AP, Mc Millan SA, Crockard AD,et al.Ann Rheum Dis,2003,62(3):272 273. ,11,  许珂～李小锋～胡学芳～等.系统性红 斑狼疮血清抗核小体抗体水平及意义的探讨,J,. 中华风 湿病学杂志～2005,9(2):72 76. ,12,  Dupods EL,drexler E,Arterberry JD.A latex nucleoprotein test for the diagnosis of systemic lupus erythematosus,J,. JAMA～1961～177:131 133. ,13,  Dubitaille P,Tan EM,Relationship between deoxyribonucleoprotein and deoxyribonucleic acid antibodies in system lupus erythematosus,J,. J Clin Invest～1973～52:316 323. ,14,  Frizler MJ,Tan EM.Antibodies to histones in druginduced lupus and idiopathic lupus erythematosus,J,. Jclin envest～1978～62:560 7. ,15,  Burlingame RW,Rubin RL,Subnucleosome structures as substrates in enzyme linked immunosorbent assays,J,. J Immunol Methods～1990～ 134:187 99. ,16,  Min DJ, Kim SJ, Pank SH, et al.Clin Exp Rheumatol,J,,2002,20(1):13 18. ,17,  Schlumberger W,DaehnrichC,Frahm S,et al.Diagnostic relevance of autoantibodies against nucleosomes,J,. Autoimmun Rev 2002～1:32. ,18,  Amoura Z,Koutouzov A,Chabre H,et al.Presence of antinucleosome autoantibodies in a restricted set of connective tissue disease,J,. Arthritis Rheum～2000～43:76 84. ,19,  Rufus,W.Burlingame,Ricard,Cervera,J,. Anti chromatin(anti nucleosome )antibodies ,2002 ,25(7),321 328. ,20,  Kaliyperumal A, Michael MA, Datta SK. J Immunol, 1999,162(10):5775 5783.