氯钾离子共体诱导后黄瓜叶片中细胞壁降解酶活性分析

氯钾离子共体诱导后黄瓜叶片中细胞壁降解酶活性 氯钾离子共体诱导后黄瓜叶片中细胞壁降 解酶活性分析 第25卷第3期 2004年9月 内蒙古农业大学学报 JournalofInnerMongoliaAgri~turalUniversity V01.25No.3 Sep.2004 文章编号:1009—3575(2004)03—0052—05 氯钾离子共体诱导后黄瓜叶片中 细胞壁降解酶活性分析 贾俊英.云兴福.马立国.刘杰才.霍秀文.杨文秀 (内蒙古农业大学农学院呼和浩特010019) 摘要:分别用浓度为0.2%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%的氯钾离子共体液,在黄瓜幼苗子叶期(子叶充分展开) 和第1真叶期(第1真叶横宽5cm)进行两次诱导,以蒸馏水为对照,然后对其第1真叶的羧甲基纤维素酶(Cx)和B 一 葡萄糖苷酶活性进行测定.结果明:不同浓度氯钾离子共体液处理后,羧甲基纤维素酶(Cx)和B一葡萄糖苷酶 活性均有不同程度的变化,变化趋势均为随时间的增加先降低后升高,到诱导后lOd左右达最低值,且极显着低于 对照.本次实验还筛选出导致活性变化最大的氯钾离子共体液的浓度范围为0.5%,1.5%. 关键词:氯钾离子共体;诱导;黄瓜叶片;细胞壁降解酶 中图分类号:$432文献标识码:A ANALYSIS0FCELLWALL—DEGRADING ENZYMEACTIVITIESINDUCEDWITHCoPoLYMER oFCHLoRINEANDPOTASSIUMIoNSINCUCUMBERLEAF jIAJun—ying,YUN:King—fu,MALi—Guo,LIUJie—cai,HUOXiu—wen,YANGWen—xiu (CollegeofAgror~3my,InnerMongoliaAgfi~turalUniversity,Huhhot,010019,China) Abstract:Thecucumberseedlingwereinducedbycopolymerofchlorineandpotassiumionswith0.2%.0. 5%,1.0%,1.5%and2.0%concentrationatstageofcotyledonandthefirsttrueleaf,thenCarboxymethyl cellalaseand8一glucc~idaseactivitiesofthefirsttruelearweremeasured.Theresultsshowedthattheaetivities ofCarboxymethylcellalaseand口一 gluc~idasewerechangedaftertheplantswereinducedbydifferentconcentra— tioncopolymerofchlorineandpotassiumions.Theydecreasedfirstly,andthenincreased.Afterinduced 10 days,theywereatthepeakbase,andlowerthanthatofcontrolobviously.Meanwhile,theoptimumconcen tra— tionswere0.5%and1.5%bythetreatmentofcopolymerofchlorineandpotassiumions. Keywords:Copolymerofchlorineandpotassiumions;induction;leavesincucumber;cellwall—de.grad— ingenzyme 引言 诱导抗病性是指经外界因子诱导后,植物体产生的对有害病原菌的抗性现?.随着现代社会对环境 收甍日期:2004一o4—07 基金项目:内蒙古自治区自然科学基金资助项目,批准号(200308020312) 作者简介:贾俊英(1973一),女(蒙古族),在读硕士研究生,从事分子生物学与生物技术研究 第3期贾俊英等:氯钾离子共体诱导后黄瓜叶片中细胞壁降解酶活性分析53 保护的日益重视以及对”绿色农业”的推崇,传统的病害防治已受到了很大程度的限制,利用植物的诱导 抗病性被认为是植物保护的新途径和新技术. 在黄瓜霜霉病的诱导抗性上,近几年也开始有了研究,云兴福等人发现用氯钾离子共体液诱导黄瓜,可 使其对霜霉病产生抗性[2;骆桂芬也研究了诱导抗病性与黄瓜叶片中糖和木质素的关系b;与抗病有关的多 酚氧化酶(Ppo),过氧化物酶(POD),苯丙氨酸解氨酶(PAL)等的活性最近也有了相关的报道】[】[引.但对 黄瓜霜霉病的诱导抗性与细胞壁降解酶活性的关系尚未见报道.本实验的目的是在前人做过的氯钾离子共 体液可以诱导黄瓜产生对霜霉病抗性的基础上,探讨用不同浓度的氯钾离子共体液诱导黄瓜幼苗后,其叶片 内羧甲基纤维素酶(Cx)和口一葡萄糖苷酶的变化情况,选出最佳诱导物浓度,从而探讨氯钾离子共体液作为 诱导物对黄瓜霜霉病产生诱导抗性的酶机理. 1与方法 1.1供试材料准备 试验品种为易感霜霉病的黄瓜品种山东密刺,种子在实验室浸种,催芽后,播种于内蒙古农业大学试验 基地的日光温室中育苗.待幼苗长到子叶期(子叶充分展开)和第1真叶期(第1真叶横宽5cm)进行两次氯 钾离子共体液诱导处理,以蒸馏水处理为对照. 诱导方法是在下午6:00进行,用喉头喷雾器把配好的诱导物均匀的喷施在整个植株上,特别是叶片的 正面和背面,以叶片布匀药液为度.喷后扣小棚过夜以防液体蒸发,同时利于药液渗透到叶内,第2天上午 揭开小棚. 1.2诱导物 氯钾离子共体液一溶解氯化钾获得,浓度分别为0.2%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%5个处理,蒸馏水 为 对照. 1.3酶液提取及测定方法:(参照李宝聚的方法) 1.3.1酶液的提取准确称取黄瓜叶片1克,加入lmo1]lNaC1提取液(20mmo1]lTris—HC1缓冲 液pH= 7.4)5ml冰浴研磨,于40(2条件10000r/min离心15min,取上清液为酶粗提液,放冰箱备用. 1.3.2羧甲基纤维素酶(Cx酶)活性测定0.5ml酶液,加lml柠檬酸缓冲液配制的含0.51%羧甲 基纤维 素溶液,50?酶解30min,用U一1800型分光光度计在540nm波长下测定其活性. 1.3.3B一葡萄糖苷酶活力的测定0.5ml酶液,加lml柠檬酸缓冲液配制的含0.5%水杨苷溶 液,50?酶 解30min,在540rim波长下测定其活性. 2结果与分析 2.1不同浓度氯钾离子共体液处理后羧甲基纤维素酶活性的变化 250 200 150 ? 落50 O —- ?一ck — -一0.20% ?1卜0.50% —一 1.0O% —一 1.5O% -’ O-”2.00% 图1不同浓度氯钾离子共体液处理后 羧甲基纤维素酶活性的变化 \ 三 划 !逛 落 摹=苫苫召萋囊墓囊囊曩量 B一葡萄糖苷酶活性的变化 --- O--ck +O.20% — ?r0.50% — 1.0o% — 1.50% — ._2.00% P0n柱蹄 P0N控册 _【温蹄 P0_【控蹄 温蹄烬 Pl柱蹄 矮笛世译 54内蒙古农业大学学报2004矩 从图1中可以看出黄瓜幼苗经蒸馏水和不同浓度氯钾离子共体液诱导后,其第1叶位真叶Cx酶活性随 时间的推移有先降低后升高的趋势,诱导后10d降为最低值,然后逐渐升高,20d后变化不明显,但处理仍低 于对照. 从表1看出各处理在诱导后第5d酶活性开始降低,处理1,处理2,处理4的Cx酶活性分别较对照降低 了25.55%,27.01%,24.3%,达到了显着水平,处理3比对照降低了35.91%,达到极显着水平.到诱导后 第10d,处理2,处理3,处理4分别比对照降低了42.28%,49.9%,62.44%,都达到了极显着水平,其中处理 4的酶活性最低为29.08u/g.从诱导10d以后,Cx酶活性开始回升,处理仍低于对照. 表1不同浓度氯钾离子共体液处理后羧甲基纤维素酶活性的变化(u/g) 注:SSR测验表中*表示显着性差异;**表示极显着性差异 2.2不同浓度氯钾离子共体液处理后8一葡萄糖苷酶活性的变化 从图2中可以看出黄瓜幼苗经蒸馏水和不同浓度氯钾离子共体液诱导后,其第一叶位真叶I3一葡萄糖 苷酶活性随时间的推移有先降低后升高的趋势,诱导后10d降为最低值,然后渐升高,20d后变化不明显,但 处理仍低于对照. 从表2看出各处理在诱导后第5dO一葡萄糖苷酶活性开始降低,处理1比对照降低了13.45%,达到显 着水平,处理2,处理3,处理4的一葡萄糖苷酶活性分别较对照降低了21.18%,24.69%,18.27%, 达到了 极显着水平.到诱导后第10d,处理2,处理3,处理4,处理5分别比对照降低了47.77%,58.43%,63.40%, 57.72%,都达到了极显着水平,其中处理4的酶活性最低,为47.75u/g.从诱导10d以后,8一葡萄糖苷酶活 性开始回升,各处理酶活性仍低于对照. 第3期贾俊英等:氯钾离子共体诱导后黄瓜叶片中细胞壁降解酶活性分析55 注:SSR铡验表中*表不显着性差异;**表不极显着性差异 3讨论 植物诱导抗病性的酶机理是多方面的,酚类氧化酶(多酚氧化酶PPO,过氧化物酶POD)能氧化酚类化 合物促进类似木质素物质的聚合作用,这种聚合物在细胞中的沉积抑制病原菌的生长;保护酶(超氧化物歧 化酶SOD,过氧化物酶POD,过氧化氢酶CAT)是细胞抵御活性氧伤害的保护酶系统,与植物抗病性反应密 切相关;而细胞壁降解酶的活性与植物抗病性的关系尚未见报道. 李宝聚等人在黄瓜黑星病菌致病机理的研究中认为,纤维素酶(羧甲基纤维素酶,8一葡萄糖苷酶)在该 菌致病中起着重要作用【.高增贵等人认为细胞壁降解酶是玉米茎腐病的主要致病因子,因而提高寄主细 胞壁抗降解能力是植物抗病的有效途径之一L8J.石延霞也初步探讨了黄瓜霜霉病致病菌与羧甲基纤维素 酶,口一葡萄糖苷酶这两种细胞壁降解酶的关系L9J.这些都证明了细胞壁降解酶与病菌的致病过程密切相 关. 本实验的结果表明,黄瓜幼苗经诱导后羧甲基纤维素酶,8一葡萄糖苷酶的活性均显着低于对照,出现规 律性变化.诱导后第5d,酶活性开始降低,到第10d降到了最低值,然后逐渐升高.说明这两种酶活性的变 化与黄瓜抗霜霉病的反应也密切相关.Mehta等(1988)研究表明:所有的酚类物质(香草醛,间苯三酚,邻苯 二酚)都能抑制Fusariumoxysporum和F.moniliforme果胶酶和纤维素酶的合成L1.陈捷等人证实了多酚 及其氧化产物能抑制病菌细胞壁降解酶的合成和活性L1.关于酚类物质与植物诱导抗病性的关系已在大 量资料中有了报道,在用氯钾离子共体液诱导黄瓜抗霜霉病的研究中,云兴福等人发现经诱导后黄瓜叶片内 PPO,POD的活性有升高的趋势,这些酶活性的升高有利于一些抑制病原菌的物质的合成,如木质素,植保 素,酚类物质.这些物质的合成也可能抑制了细胞壁降解酶的合成与活性,也就是导致了植株体内细胞壁降 解酶活性的降低,这与本实验的研究结果相吻合.由于羧甲基纤维素酶,口一葡萄糖苷酶活性的降低,更进一 步刺激了寄主抗性的表达.另外,植物体内细胞壁降解酶活性的降低,在不同程度上保护了寄主细胞壁免受 病菌侵染,从结构抗性上也起到了防卫作用. 本次实验还筛选了导致羧甲基纤维素酶和口一葡萄糖苷酶活性变化最大的氯钾离子共体液的浓度范 围.根据实验观察和显着性分析表明,能使酶活性变化最大的氯钾离子共体液的浓度范围为0.5%, 56内蒙古农业大学学报2004钜 1.5%.因为浓度为0.2%的氯钾离子共体液诱导酶涪陲变化幅度小,而浓度大于1.5%,温度高时,黄瓜叶 片极易产生药害. 4结论 4.1用0.2%--2.0%的氯钾离子共体液诱导黄瓜幼苗,可降低叶片内羧甲基纤维素酶和p一葡萄糖苷酶的 活性. 4.1诱导黄瓜幼苗的氯钾离子共体液的理想浓度范围为0.5%,1.5%. 参考文献: [1]张元恩.植物诱导抗病性研究进展[J].生物防治通报,1987,3(2):88—90. [2]云兴福等.几种化学物质诱导黄瓜对霜霉病的抗性[J].植物保护学报,1997,2(2)I159—163. [3]骆桂芬等.黄瓜叶片中糖和木质素含量与霜霉病诱导抗性的关系[J].植物病理学报,1997,27(1):65—69. [4]云兴福,崔世茂.黄瓜组织几种酶活性与其对霜霉病抗性的关系[J].华北农学报,1995,10(1):92—98. [5]李靖,利容千等.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化[J].植物病理学报,1991,21(4):278—283. [6]李淑菊,马德华等.水杨酸对黄瓜几种酶活性及抗病性的诱导作用[J].华北农学报,2000,15(2):118—122. [7]李宝聚等.黄瓜黑星病致病机理的研究?(细胞壁降解酶及其在致病中的作用)[J].植物病理学报,2000,30(1):13—18. [8]高增贵等.玉米茎腐病产生的细胞降解酶种类及其活性分析[J].植物病理学报,2000,30(2):149—151. [9]石廷霞,李宝聚.黄瓜霜霉病菌致病作用与两种细胞壁降解酶关系初探[J].园艺学报2003,30(4):465—466. [10]Mehta,A.eta1.5thlntemaAbstractsofPapers,tionalCongressofPlantPathology[J].1988,55:11—116. [儿]陈捷等.酚类物质和代谢对瓜果腐霉菌产生的细胞壁降解酶活性的影响[J].植物病理学报,1996,26(2):171—176.