血浆白蛋白中胱氨酸和精氨酸是主要的氧化剂攻击基团

血浆白蛋白中胱氨酸和精氨酸是主要的氧化剂攻击基团 血浆白蛋白中胱氨酸和精氨酸是主要的氧 化剂攻击基团 中华肾脏病杂志2006年1月第22卷第l期ChinJNephrol,January2006,丝!. 血浆白蛋白中胱氨酸和精氨酸是主要的 氧化剂攻击基团 卢燕雯朱秋毓丁峰顾勇林善锬 【摘要】目的探讨自由基攻击对白蛋白结构的影响.方法以正常人为对照组,尿毒 症患者为实验组,高级氧化蛋白产物(AOPPs)和羰基为氧化应激指标.先对各组的氧化应激水 平进行,随后从各组分离,纯化出白蛋白,再对其氨基酸组成进行分析比较.结果尿毒症 患者的AOPPs,及羰基水平约为正常人的2倍(P<0,01).同正常人相比,尿毒症患者水解出的 17种白蛋白氨基酸组成大部分低10%左右,其中胱氨酸和精氨酸在两组间差异有统计学意义 (P<0.05).结论氨基酸的普遍损失是影响血浆蛋白结构和功能的关键因素,其中胱氨酸和精 氨酸是自由基攻击的两个主要靶基团. 【关键词】氧化应激;氨基酸类;蛋白水解产物;羰基;高级氧化蛋白产物 CysteineandarginineinplasmaalbuminarethemajortargetsattackedbyfreeradicalsLU Yon—wen,ZHUQiu—yu,DING屁,GUYong,LINShah—yon.DepartmentofNephrology,Huashan Hospira1,FudanUniversity,S200040,China Correspondingauthor:DING屁凡g,Email:ding.feng@fudan.edu.cn 【Abstract】0bjectiveTostudytheeffectsofoxidantsonthestructureofalbumin.Methods UsingbothAOPPsandproteincarbonylcontentasindices.Theoxidativestresslevelinnorma l controlsanduremiapatientswasevaluated.AlbumininplasmawaspurifiedbyHPLCandthenWaS subjectedtoaminoacidscompositionassay.ResultsBothAOPPslevelandproteincarbonylcontent inuremicpatientsweresignificantlyhigherthanthoseincontrols(P<0.01).Mostaminoacids' levelsinalbuminfromuremicpatientsweredown— regulatedby10%comparedtothecontrols.A statisticallysignificantdifferenceofbothcysteineandarginineinalbuminWasfoundbetweencontrols anduremicpatients(P<0.05).ConclusionTheextensivelossofaminoacidsinuremicpatients mayplayapivotalroleinaffectingthestructureandbiologicalfunctionsofalbumin,providedthat bothcysteineandargininearethemajortargetsattackedbyfreeradicals. 【Keywords】Oxidativestress;Aminoacids;Proteinhydrolysates;Carbonyls; Advancedoxidativeproteinproducts 目前已认识到许多慢性疾病如糖尿病,冠心 病,慢性肾功能衰竭等同患者体内异常的氧化应 激水平有关_1_.体内存在着多种制衡异常氧化应 激的抗氧化体系,其中蛋白质作为大分子抗氧化 物质的作用近来逐渐受到重视.Witko.Sarsat等I415] 发现,血浆蛋白遭受自由基攻击后,其氧化修饰 产物可作为一个敏感的评定氧化应激的指标,并 把蛋白质的这种氧化修饰产物命名为高级氧化 蛋白产物(advancedoxidativeproteinproducts, 基金项目:国家自然科学基金(30300160) 作者单位:200040上海,复旦大学附属华山医院肾脏科 通信作者:丁峰,Email:dindeng@fudan.edu.ca . 临床研究. AOPPs). 白蛋白是构成新型尿毒症毒素——AOPPs的 主要成分.在构成血浆总蛋白80%以上的4种高 丰度蛋白中,白蛋白的氧化程度最高,其次是纤维 原蛋白和转铁蛋白,而IgG的氧化程度最低.为深 入研究AOPPs的形成机制,我们对正常人和尿毒 症患者的血浆白蛋白进行了氨基酸组成分析. 对象和方法 一 ,对象 10例尿毒症血透患者,男性7例,女性3例, 平均年龄(68.6~7.2)岁,均采用碳酸盐透析液和 24中华肾脏病杂志2006年1月第22卷第1期 ChinJNephrol,January2006,Vol22,No.1 首用聚砜膜透析器(PS).排除糖尿病,系统性红 斑狼疮,近期有肺部感染,明显全身性感染及其他 免疫性疾病患者.10例近2个月内未接受输血, 激素或免疫抑制剂治疗.10例正常对照,为年 龄,性别匹配的健康志愿者.新鲜全血采集后即 刻置于含有EDTA的抗凝管内.4?1000~g离心 10min后.血浆于一20~C保存待测. 二,试剂 氯胺.T,2.4.二硝基苯肼(DNPH),三氟醋酸 (TFA),转铁蛋白(Tf),IgG,纤维原蛋白(Fg)购自 美国Sigma,白蛋白购自上海新兴公司,其它试剂 均购自上海化学试剂公司(AR规格).双重蒸馏 水用于配制所有溶液. 三,方法 1.血浆AOPP水平测定:按文献[4,5]进行. 血浆先用20mmol/L磷酸缓冲液(PBS)(pH7.4) 以1:5稀释,吸取200l稀释血浆,加入20l醋 酸,摇匀后即刻于340nm下测定AOPP浓度.血 浆AOPP浓度从氯胺一T(0,100Ixmol/L)制得的 曲线上求得并以氯胺一T浓度表示.空白校正 用PBS替代血浆进行. 2.血浆蛋白羰基水平的测定:按文献[6,7] 进行.血浆用20mmol/LPBS(pH7.4)1:10稀释 后,加4倍量DNPH(10mmol/L,用2.5mol/L盐 酸配制).室温下避光反应1h.同时用不含DNPH 的盐酸(2.5mol/L)进行反应作空白对照.反应结 束后加入等体积预冷20%三氯醋酸(TCA),4~C 10000~g离心15min.顷去上清液,沉淀用乙醇: 醋酸乙酯(1:1)洗2次.同上10000xg离心10 min后,顷去上清液,沉淀用6mol/L盐酸胍于 37~C下振荡溶解.溶液再次离心以去除不溶物.吸 取适量上清液直接进样于HPLC作羰基含量分 析.用盐酸作空白对照用的样品再进一步置于 280nm下测定各蛋白浓度以校正在羰基衍生化 操作中的蛋白损失.血浆中各蛋白的羰基含量用 羰基的摩尔吸光系数22000mol?em求得,结 果以nmol羰基/rag蛋白质表示. 色谱柱为Bio.SepSEC.$2000(300x7.8mm. id)凝胶柱及预柱,柱温25o【=.流动相为180m mol/LPBS(pH7.0),流速0.8ml/min.HPLC仪 器为Agilent1100,配备有四元泵(1311A型),自 动进样器(G1313A型)和可变波长紫外检测器 (G1314A型).羰基测定波长为370nm,蛋白测定 波长为280nm.色谱数据用峰高进行定量分析. 3.血浆白蛋白的分离纯化:采用中心切割法 收集白蛋白洗脱峰(9.0,10.2rain),合并收集得 的白蛋白馏分,用AmiconUltra.4超滤管(美国 Millipore,相对分子质量截留值为10000)于4~C 下2000r/min45min离心浓缩后.重复再上凝胶 柱以去除可能残留的杂蛋白.合并收集纯化后的 白蛋白,同上用超滤管浓缩后.用280nm光学法 测定白蛋白浓度,随后置于一20~C保存备用. 4.蛋白水解及氨基酸测定:取0.5ml纯化的 白蛋白馏分原液,加等体积浓盐酸于110~C真空 18h气相水解蛋白质.蛋白水解液真空抽干后, 残渣溶于4ml盐酸(0.05mol/L)中.摇匀后吸取 50l蛋白水解液作氨基酸分析.氨基酸分析采 用柱后茚三酮衍生化法.仪器为日立835—50型氨 基酸自动分析仪.离子交换色谱柱型号为2619 (2.6,150mm),柱温为53?,流动相流速为0.225 ml/min,茚三酮显色剂流速为0.3ml/min.N压 力设定为27.5kPa.分析操作按仪器内定标准程 序进行.除脯氨酸检测用440nm波长外,所有氨 基酸均在570nm下检测.测得的白蛋白中的氨基 酸水平用nmol/L表示. 四,统计学 所有数据用?s表示.统计分析采用 students.t检验. 结果 一 ,正常人和尿毒症患者的血浆AOPPs和羰 基水平 尿毒症患者的血浆AOPPs水平约为正常人 的2倍.而羰基水平除了白蛋白在正常人和尿毒 症患者问差异有统计意义外.其余蛋白均无显着 性差异,见表1. 表1正常人和尿毒症患者的血浆AOPP和 羰基水平(i?) 删例数 正常对照组1071.07+13.900.632~0.2990.052~0.0860.104~0.0750.791~0.143 尿毒症组lO161.91~19.990.316~0,4330.059~.091O.1o9?0.1291.510-i-0.201 P值P<0.01P=0.33P=0.45P=0.47P<0.01 血浆蛋白分离和纯化的白蛋白馏分色谱图结 果显示,未检测出其它蛋白,证明经上述步骤处理 中华肾脏病杂志2006年1月第22第l_in:翌:丝:!: 获得的白蛋白纯度较高,杂蛋白已基本去除干净, 见图1. 《 ? 耄{ ll,,, 上:用280nnl波长监测蛋白分离,图中的虚线为白蛋白的 收集起止区域:下:纯化的白蛋白,按中心切割法收集得的白蛋 白经浓缩,再分离后,对收集的白蛋白进行检测,由图可见未发 现有其它杂蛋白,证明获得的白蛋白纯度较高:图中纵坐标为吸 收信号强度(mAu),横坐标为时间(min) 图l血浆蛋白的色谱分离和收集 二,纯化的白蛋白气相酸解液的色谱分析 在氨基酸自动分析仪给定的色谱条件下,蛋 白水解出的17种氨基酸可得到很好的分离.其出 峰顺序依次为:天冬氨酸(Asp):10.64+0.24,苏氨 酸(The):11.52?0.25,丝氨酸(Ser):12.51?0.27, 谷氨酸(Glu):13.77?0.39,甘氨酸(Gly):18.51? 0.34,丙氨酸(Ala):19.87+0.48,胱氨酸(Cys): 22.37?0.11,缬氨酸(Va1):23.06?0.20,甲硫氨酸 (Met):24.15+0.16,异亮氨酸(IIe):27.62+0.71,亮 氨酸(Lcu):28.66?0.27,酪氨酸(Tyr):30.99,苯 丙氨酸(Phe):33.05?0.30,赖氨酸(Lvs):37.38? 0.40,组氨酸(His):41.92+0.10,精氨酸(Arg): 51.70+0.19,见图2.脯氨酸因在另一波长下测定, 其保留时间为(15.20+0.25)min,介于谷氨酸和甘 氨酸之间,故图中未显示.尿毒症患者的白蛋白氨 基酸组成低于正常人的大约10%左右,仅有的一 个例外是甲硫氨酸,该氨基酸在尿毒症患者白蛋 白中的水平为正常人的112%左右.除了精氨酸 和胱氨酸外,其余所有氨基酸水平在正常人和患 者之间并无显着性差异.见表2,图3. 讨论 在分离并鉴别出的l7种白蛋白水解氨基酸 中,除了缬氨酸,蛋氨酸和异亮氨酸外,其余所有 表2正常人和尿毒症患者血浆白蛋白的氨基酸组成分析 ?尿毒症患者的白蛋白氨基酸组成相当于正常人的百分比, .P<O.05 l:天冬氨酸;2:苏氨酸;3:丝氨酸;4:谷氨酸:5:脯氨酸;6: 甘氨酸;7:丙氨酸;8:胱氨酸;9:缬氨酸;lO:甲硫氨酸;l1:异亮 氨酸;12:亮氨酸;13:酪氨酸;14:苯丙氨酸;15:赖氨酸;16:组氨 酸;17:精氨酸;脯氨酸的检测波长为440nnl,其出峰位置介于 谷氨酸和甘氨酸之间.本图中未显示 图2l7种氨基酸的色谱分析图 氨基酸水平在尿毒症患者中较其在正常人中相应 低约10%左右.这一结果强烈提示氨基酸的普遍 损失是造成白蛋白功能和结构的变化,如水解敏 感性增强,易于破碎或聚集,从而导致尿毒症患者 的血浆白蛋白水平下降的关键原因.DaviesEs]发现, 当每nmol/LBSA中的羟自由基浓度达到10 nmol/L水平时,实验组中的氨基酸损失量与对照 组相比也为10%左右.我们的结果与之相似.这 粥m506咖伽姗瑚0 中华肾脏病杂志2006年1月第22卷第l期ChinJNephrol,January2006,Vol22,No.1 P<0.05 图3正常人和尿毒症患者血浆蛋白的l6种氨基酸组成分析 进一步验证了尿毒症患者体内的自由基水平要明 显高于正常人. 半胱氨酸在患者和对照组之间差异有统计学 意义,其水平明显较正常人低.但无论正常人还是 尿毒症患者,都基本上检测不出其血浆白蛋白中 的酪氨酸成分.酪氨酸的洗脱介于亮氨酸和苯丙 氨酸之间(图2).产生上述结果可能的原因:(1) 以往的研究已证明次氯酸选择性地攻击蛋白质主 要消耗的是酪氨酸,半胱氨酸等[,,1o];(2)酪氨酸 是产生二酪氨酸,氯代酪氨酸和DOPA等氧化应 激特异指标的供体【;(3)已知AOPPs的增加同 次氯酸氧化剂的浓度成正比【引.因此白蛋白中半 胱氨酸水平低,同时检测不出酪氨酸水平提示导 致白蛋白发生氧化修饰的自由基主要是来自于嗜 中性白细胞或单核细胞参与衍生的次氯酸.但确 切的结论仍需作进一步研究证实. 羰基的产生是蛋白质氧化的一个特征性指 标.Lys,Arg,Pro,r等蛋白侧链上的氨基酸残基 是自由基攻击蛋白导致羰基产生的主要基团.我 们的结果表明尿毒症患者的羰基水平远高于正常 人,而其白蛋白的精氨酸水平则明显要低于正常 人.这证明在产生羰基的4种主要氨基酸残基中. 精氨酸是自由基攻击的主要基团. 一 个矛盾的现象是.虽然蛋氨酸是最易遭受 自由基,特别是单线态氧的攻击而发生氧化修饰 的氨基酸之一["].而我们的实验数据表明.尿毒 症患者血浆白蛋白中的蛋氨酸水平稍高于正常 人.虽然差异无统计学意义.但这是否反映出攻击 白蛋白的氧化剂并非来自于单线态氧或者是由于 体内存在某种蛋氨酸的修复体系.例如通过蛋氨 酸亚砜还原酶的催化而将蛋氨酸亚砜复原成蛋氨 酸,从而逆转其损失,对此尚不十分清楚[引. 值得指出的是.虽然真空气相酸水解蛋白质 是测定蛋白质氨基酸组成的经典方法,但在酸解 期间.由于蛋白质中的色氨酸完全遭到破坏,因此 不能排除色氨酸也是自由基攻击的靶基团,特别 是来自单线态氧的攻击["]. 综上所述.尿毒症患者血浆白蛋白的氨基酸普 遍损失是造成其白蛋白水平下降的主要因素,而胱 氨酸和精氨酸是氧化剂攻击的两个主要靶基团. 参考文献 lDhamraitaSS,Stephensa,CooperaJA,eta1. 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