人感染猪链球菌病样品采集与实验室检测方法

附件1    人感染猪链球菌病样品采集与实验室检测 一、样品采集   1．采样器材   ⑴无菌封闭性好的试管，最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管，避免使用玻璃试管。   ⑵可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。   ⑶可以方便采集组织标本的无菌容器。   ⑷无菌的剪刀、镊子和手术刀。   ⑸血平皿和增菌培养瓶。   ⑹乳胶手套、隔离服、防护口罩等。 ⑺带有冰袋或者冰排的安全可靠的保温运输容器。   ⑻采样送检单。   2．样品种类 ⑴现症病人非抗凝全血 ⑵现症病人抗凝血 ⑶脑脊液标本 ⑷尸体解剖应无菌采集淋巴结、脾、肝、心腔血、胸（腹）水 ⑸如有病死猪也可进行解剖，取淋巴结、脾、肝、心腔血、肉 3．血液和脑脊液标本采集方法 ⑴无菌抽取血液10ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中 ⑵按常规方法腰穿采集3～5ml脑脊液标本置于无菌试管中。 ⑶采集的标本立即接种血平皿和/或增菌培养瓶，置于35～37℃培养。 4．样品运输保存 ⑴所有的原始标本在转运过程中应置于安全密闭的容器中。 ⑵标本应冷藏运输。 ⑶用于检测的标本可在4~8℃冰箱暂放。 ⑷剩余标本应放置于-70℃保存。 5．注意事项 ⑴严格无菌操作，防止标本污染。 ⑵用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集。 ⑶应尽可能床边接种血平皿和增菌培养瓶。如无法床边接种，样品应尽快送实验室，并立即检测。 ⑷在标本采集过程中，注意安全防护。使用乳胶手套、隔离服、防护口罩。采取预防，防止针头等锐器刺伤。 二、实验室检测   1．推片镜检   抗凝血或脑脊液可推片进行革兰氏染色镜检。阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒，细胞外偶尔可见革兰氏阳性链球菌。   2．猪链球菌分离鉴定 ⑴血平板接种   血液或脑脊液等标本可直接接种于新鲜羊血琼脂平板（如无血平板可用含8 %胎牛血清的营养琼脂平板代替）。组织标本可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤，洗液接种平板。平板置37℃5% CO2培养箱或者烛缸中培养24～72小时。也可在37℃普通培养箱中培养。 ⑵增菌培养 无菌部位采集标本置脑心肉汤或含8%新生牛血清葡萄糖肉汤或商品化血培养瓶中，37℃增菌培养24小时～1周，逐日观察，接种新鲜羊血琼脂平板，置37℃5% CO2培养箱或者烛缸中培养24～72小时。对污染标本接种选择增菌培养液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基）增菌约15小时后接种血平板，或直接划线接种含两种抗生素的羊血琼脂平板培养基，在蜡烛缸或CO2培养箱中培养24～72小时。 ⑶形态学鉴定 猪链球菌在血平板上呈直径l～2毫米的细小菌落，灰白色，半透明，边缘整齐，凸起，光滑，α溶血（偶尔也有弱β溶血或α溶血、β溶血现象均不明显）。 挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检。猪链球菌无芽胞，刚分离的猪链球菌为典型的革兰氏阳性链球菌，链长达二十多个，多次传代培养后细菌形态不典型，结晶紫着色不良，多为短链或不成链的球杆菌。 ⑷筛检生化试验 猪链球菌触酶试验阴性，可与葡萄球菌区别。 ⑸血清学检测 用标准分型诊断血清，进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验。确定所分离的菌株为R群，与2型猪链球菌分型血清反应。 目前国内无血清供应。据报道,加拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。 ⑹生化鉴定 在血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验，如符合链球菌特征，接种血平板纯培养后进行生化鉴定。 梅里埃API 20 strep等生化鉴定系统可鉴定2型猪链球菌。 ⑺PCR检测 采用PCR技术可以检测猪链球菌种特异性基因16S rDNA、猪链球菌2型和1/2型特异的荚膜多糖基因(cps2j)、毒力因子溶菌酶释放蛋白基因(mrp)和细胞外蛋白因子基因(ef)，有条件的实验室可以采用。 猪链球菌种特异性基因16S rDNA检测可以鉴定猪链球菌；猪链球菌特异的荚膜多糖基因(cps2j)检测可以鉴定猪链球菌2型和1/2型；毒力因子溶菌酶释放蛋白基因（mrp）和细胞外蛋白因子基因（ef）检测可以鉴定高致病性的猪链球菌。