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蛋白互作

2019-01-24 5页 doc 17KB 108阅读

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蛋白互作蛋白互作的研究一直以来都受到重视,是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下,抛砖引玉了,大家多补充纠正一下吧 常用的体外互作研究方法: 1、酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2h) 酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今,并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后,在...
蛋白互作
蛋白互作的研究一直以来都受到重视,是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下,抛砖引玉了,大家多补充纠正一下吧 常用的体外互作研究方法: 1、酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2h) 酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今,并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 但是酵母双杂交有自己的缺点:⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用,使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起基因的表达,产生"假阳性"结果。 “假阳性”对策:即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用,还应对以下方面进行分析:(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。(2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。(3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。 “假阴性”的产生:一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱,应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。 2、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) 用抗体将相应特定分子沉淀的同时,与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 优点在于:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点在于:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证,达到互补的效果。 体内互作的研究 1、荧光共振能量转移(FRET) 荧光共振能量转移(FRET):当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时,供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光,同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关,一般为7~10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长,FRET呈显著减弱。 由于只有在蛋白之间的距离达到10nm一下才会发生FRET,而10nm要小于蛋白互作要求的距离,所以FRET是衡量体内互作的强有力的证据。 2、双分子荧光互补(BiFC) 是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达,如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC),不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成,还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前,该技术已用于转录因子,G蛋白βγ亚基的二聚体形式,不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上。 由于BiFC的直观,而且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性,以及细胞信号分子对其相互作用的影响等,这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。所以,BiFC越来越受到研究人员的青睐。 关于蛋白质互作的实验方法很多,了了如下: (1)活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用;包括荧光共振能量转移显微技术、应用流式细胞分析和荧光共振能量转移检测活体细胞内分子间相互作用、荧光相关谱技术-定量检测分子相互作用的新型技术、共聚焦显微镜检测细胞内蛋白质的共定位、蛋白质片断互补法分析生物化学网络以及细胞内化学【蛋白质】交联法。 (2)在异种系统中检测蛋白质-蛋白质相互作用;如基于转录激活的细菌双杂交系统、应用酵母双杂交系统检测相互作用的蛋白质、双诱饵酵母杂交系统分析蛋白质-蛋白质相互作用、用于膜蛋白研究的分裂泛素教母双杂交系统、反向酵母双杂交技术、哺乳动物细胞双杂交分析检测体内蛋白质互作以及对转染细胞进行免疫共沉淀。 (3)离体实验方法;包括等温滴定热分析技术检测蛋白质-蛋白质相互作用、应用圆二色光谱分析蛋白质-蛋白质相互作用、核磁共振光谱分析蛋白质-蛋白质相互作用、表面等离子共振技术研究视紫红质-G蛋白相互作用、使用光散射技术确定蛋白质复合物的化学计量、沉降平衡研究、模拟小区带凝胶过滤色谱法检测蛋白质-蛋白质相互作用、荧光偏振实验技术定量研究蛋白质-蛋白质相互作用、通过印迹叠加或Far Western印迹研究蛋白质-蛋白质相互作用、GST融合技术研究蛋白质-蛋白质相互作用、在靶向药物发现中应用亲和毛细血管电泳分析蛋白质-蛋白质相互作用、羟基蛋白质足迹法筛选蛋白质-配体相互作用和利用噬菌体展示和多价大分子技术设计蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂等等 基于不同的实验目的和实验对象,设计选用合适的方法。蛋白质的信号网络,其实就是从研究蛋白质-蛋白质相互作用开始,蛋白质作用网络的构建是蛋白组研究的重要版块。 另外,最近发展起来的蛋白质-蛋白质相互作用的计算机预测,也是一条不错的途径。蛋白质相互作用的的计算机算法包括:从蛋白质序列的原始数据中识别模块结构域及序列基序、依靠基于特定序列的算法模拟某种蛋白质的结构域与另一种蛋白质的基序间的结合,并以此建构筑可行的相互作用网络。其中预测蛋白质模块结构域的计算机算法已经十分成熟但要鉴别出这些模块所识别的短基序则比较困难。 互联网上也有十分丰富的研究蛋白质-蛋白质相互作用的网络资源,这里就不再多说啦~~鄙人蛮喜欢这个领域的,以后还要继续多多关注。
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