白芍总苷治疗四氯化碳致大鼠肝纤维化的作用与其影响肝星状细胞功能的关系

白芍总苷治疗四氯化碳致大鼠肝纤维化的作用与其影响肝星状细胞功能的关系 白芍总苷治疗四氯化碳致大鼠肝纤维化的作用与其影响肝 星状细胞功能的关系* ， 11211 1, 2 2 李瑞麟，马 勇，魏 伟，叶根深，陈文笔，严家春 (1安徽医科大学临床药理研究所，安徽省高校省级抗炎免疫药理学重点实验室，安徽省中药研究与开发重点实验室，合肥 230032;2中国人民解放军第123中心医院， 蚌埠 233015) [摘要] 目的:研究白芍总苷(TGP)通过影响肝星状细胞(HSC)的功能发挥治疗四氯化碳(CCl)致大鼠肝纤维化的作用。方法:建立CCl诱导化学性肝纤维化模型，全自动生44 化仪血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)水平;放免法检测血清及体外HSC培养上清中透明质酸(HA)和III型前胶原(PCIII)的含量;流式细胞仪检测HSC凋亡率。苏木素-伊红染色处理肝脏组织切片，光镜观察病理学 -1改变。结果:在CCl诱导大鼠肝纤维化模型，TGP给药(40，80 ，160 mg,kg，ig)均明显4 降低血清ALT，AST，ALP，HA和PCIII水平;升高白蛋白水平及白蛋白球蛋白比值(A/G)。 -1TGP (60，120和240 mg,L)能明显降低HSC体外分泌的HA 和PCIII水平，促进HSC凋亡，明显改善肝脏病理组织状况。结论:TGP对CCl致大鼠肝纤维化具有治疗作用，该4 作用与其降低HSC分泌HA 和PCIII、促进HSC凋亡有关。 [关键词] 白芍总苷;细胞凋亡;肝星状细胞;肝纤维化 [中图分类号] R965.1;R975.5 [文献标识码] A [文章编号] 1003-3734(2007) The relationship between the therapeutic effects of total glucosides of peony on CCl-induced liver fibrosis and its effets 4 on the function of hepatic stellate cells 12111,22 LI Rui-lin，MA Yong，WEI Wei，YE Gen-shen，CHEN Wen-bi，YAN Jia-chun (1 Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immunopharmacology in Anhui Province, Hefei 230032, China; 2 Department of Liver Diseases, 123th Hospital of PLA, Bengbu 233015, China) [Abstract] Objective: To study the mechanisms of anti-fibrosis action of total glucosides of [基金项目] 安徽省2006年度科技攻关项目(06013133B) [作者简介] paeony (TGP) on chemical hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rat associated with its effect on the function of hepatic stellate cells.Methods: The model of rat chemical hepatic fibrosis was prepared by subcutaneous injection of carbon tetrachloride. The serum activities of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), alkaline phosphatase(ALP), albumin(ALB), total protein(TP) were assayed by HITACHI 7060 automatic biochemistry detection instrument. The serum concentration of hyaluronic and acid (HA),procollagen typeIII(PCIII) levels, the levels of HA and PCIII released from the cultured hepatic stellate cells (HSC) was determined by radio immunoassay method. HSC apoptosis were determined by Flow Cytometer. Liver tissue sections were examined under a light microscope. Results: TGP (40，80， -1160 mg,kg) markedly decreased the elevated serum levels of ALT, AST, ALP，HA, PCIII ， markedly increased serum levels of ALB,increased A/G value. In vitro experiments,TGP(60，120， -1240 mg,L)markedly decreased the levels of HA and PCIII released from the cultured HSC, and -1also induced the apoptosis of HSC. TGP (40，80，160 mg,kg) effectively improved the liver leision. Conclusion: TGP has protective effect on hepatic fibrosis of rats induced by carbon tetrachloride. Its mechanisms might be associated with the induction of apoptosis of HSC and the decrease of the HA and PCIII level. [Key words] total glucosides of paeony;apoptosis;hepatic stellate cells;hepatic fibrosis 肝纤维化常见于各种慢性肝脏疾病，也是引起肝功能障碍和肝硬化的重要病理学基础， 其是肝脏细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过量产生和降解减少，导致ECM在 肝脏沉积，形成纤维化。肝星状细胞( hepatic stellate cell, HSC) 活化后大量增殖及生成胶原 [1]等ECM是肝纤维化的细胞学基础。临床上治疗肝纤维化尚缺乏疗效确切的药物, 近年来 研究显示许多中医方药对肝纤维化有一定的治疗效果。白芍总苷(total glucosides of paeony， TGP)是传统中药亳白芍(Radix Paeoniae Alba)中提取的有效部位，主要含有芍药苷、羟基芍 [2]药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等成分, 具有明显的抗炎免疫调节作用，对 炎症免疫性疾病的治疗具有良好前景。本所前期研究明TGP对人白蛋白致大鼠免疫性肝 [3]纤维化模型和四氯化碳(CCl)诱导的大鼠肝纤维化模型均具有明显的治疗作用。本实验4 在CCl诱导的大鼠肝纤维化模型上分离培养HSC，研究TGP是否通过影响HSC的功能发4 挥治疗肝纤维化的作用，为部分阐明TGP治疗肝纤维化的作用机制提供依据。 材料和方法 1 材料 1.1 药物 TGP(纯度75,)，安徽医科大学临床药理研究所提供，临用前用双蒸水溶解，再 -1用0.5%羧甲基纤维素钠稀释。体外TGP应用液的配制:用少量乙醇溶解后加Hank's至10 g,L， 过滤除菌，用无血清DMEM液稀释至所需浓度。秋水仙碱(Col)系西双版纳制药厂产品(批 2 号:031020)。 1.2 试剂 ?型胶原酶系Sigma公司产品;链霉蛋白酶系Calbiochem公司产品;分离剂OptiPrep原液系Axis-Shield公司产品;小牛血清系GIBCO公司产品，小牛血清临用前热灭活;?型前胶原(PC?)、透明质酸(HA)放免试剂盒购自上海海军生物医学研究所; Annexin V FTTC Kit 购自晶美公司;CCl系蚌埠皖达试剂厂产品。 4 1.3动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，?，体重(200?20)g，购自安徽医科大学实验动物中心。合格证号:SCXK(皖)2005-0001 1.4 仪器与设备 日立7060全自动生化仪(日本HITACHI公司产品);IX-70荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS产品);GL-20A冷冻离心机(湖南仪表总厂离心机厂产品);PAS流式细胞仪(德国PARTEC公司产品);GC-1200γ放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司产品);Napco5410型二氧化碳培养箱(美国杜邦公司产品)。 2 TGP抗CCl4致大鼠肝纤维化的体内实验 2.1实验分组与给药 健康雄性SD大鼠随机分为6组:正常组、模型组、TGP低、中、高剂 -1-1量组(40，80，160 mg,kg)和Col组(0.1 mg,kg)，除模型组为20只外，其余各组均为10只。将CCl与高压灭菌精制花生油配成40%油剂，自造模之日起，除正常组外，其他各4 -l组大鼠按4mL,kg体重背部皮下注射40% CCl精制花生油溶液，每周一、四各1次，连续4 12周。每周称重1次，相应调整给药剂量。自造模4周后，TGP和Col组每日灌胃给药，正常组和模型组则灌胃等容积的1%羧甲基纤维素钠，连续8周。 2.2 观测指标 末次给药24h后，股动脉采集血样，用全自动生化分析仪常规检测大鼠血清肝功能指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)等]，用放免法检测血清纤维化指标[HA和PCIII]。颈部脱臼处死大鼠，立即取肝组织，用10 %甲醛固定，乙醇逐级脱水，常规石蜡包埋，HE染色，观察肝脏的病理组织学改变。 3 TGP对HSC体外分泌HA 和PCIII和凋亡的影响 [4] 随机从体内实验中的正常组和模型组取SD大鼠，参考文献方法，肝脏原位胶原酶灌注法 5-1分离HSC。分离后以2×10个,mL细胞浓度接种于培养瓶中，在5%CO和37 ?的条件下培养，2 台盼蓝染色细胞活力在90%以上，在荧光显微镜下新分离的HSC胞浆呈蓝绿色荧光，荧光阳性细胞在90%以上。 3.2 实验分组与给药 体外实验分正常组、模型组、TGP低、中、高浓度组(60，120，240 -1 5-1mg,L)。取生长良好的HSC以1×10个,mL，每孔1mL接种到24孔培养板，在10%小牛血清、5%CO和37?条件下培养。细胞培养48h后，以无血清DMEM培养24h，换用10%2 小牛血清，按分组所示终浓度给药，对照组和模型组加入等体积生理氯化钠溶液，每浓度药物设3个复孔。 3.3 检测指标 给药后继续培养48 h，用放免法检测HSC培养上清中PCIII和HA水平，并 3 -1用流式细胞仪检测HSC凋亡率。调亡检测步骤如下:培养液用2%胰酶消化，800 r,min离心5min，弃上清，PBS洗涤1~2次;加100μL结合缓冲液重悬，轻轻混匀，再加结合染料5 μL FITC/Anixin?和10μL PI，4?避光反应20~30min;最后加入250 μL结合缓冲液和700 μL PBS重悬;过滤后用流式细胞仪检测，使用Flow max 2.4软件处理数据。 4 数据处理 采用SPSS10.0统计分析软件处理数据，结果以?s，组间差异的比较采用t检验。 x 结 果 1 TGP对CCl所致化学性肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响 4 肝组织学显示，正常组大鼠肝小叶结构正常，而模型组严重混乱，肝实质内含有宽窄不等的纤维带穿插迂回，将肝组织分隔成大小不一的假小叶，其内肝细胞水肿，有严重的脂质 -1-1空泡存在，纤维带周围内见众多炎细胞浸润。TGP(40，80，160 mg,kg)和Col(0.1 mg,kg)组肝纤维带大部分降解吸收，间质增生不明显，伴少量纤维间隔，肝小叶样结构正常，少量炎细胞浸润。病理图见图1。 正常组 模型组 -1-1TGP 40 mg,kg组 TGP 80 mg,kg组 4 -1TGP 160 mg,kg组 Col组 图1 TGP对CCl所致化学性肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响 (HE染色 ×200) 4 2 TGP对CCl4所致化学性肝纤维化大鼠肝功能的影响 与正常组比较，模型组血清ALT，AST和ALP水平显著升高，A /G的水平明显降低;给 -1-1予TGP(40，80，160 mg,kg)和Col(0.1 mg,kg)均能显著降低血清中升高的ALT，AST -1和ALP水平，与模型组相比TGP(80和160 mg,kg)能显著升高总蛋白水平和A/G值。结果见表1和2。 表1 TGP对大鼠血清ALT，AST， ALP，TP，ALB 和A/G 比值的影响 n=10, +s x ALT AST ALP TP ALB A/G 组别 剂量 -1-1-1-1-1-1 /mg,kg /U,L /U,L /U,L /mg,L /mg,L -- 25.8?6.79 95.7?7.21 93.40?9.86 75.34?2.46 41.01?1.22 1.19?0.13 正常 bbbbbb-- 60.8?6.08 167.2?13.41 207.90?18.16 70.24?1.99 32.18?1.13 0.85?0.08 模型 dddcdcTGP 40 41.1?4.95 142.6?14.72 149.35?20.79 72.26?1.47 35.21?2.14 0.95?0.12 ddddddTGP 80 37.6?4.50 136.9?13.57 136.60?17.03 75.15?3.03 36.88?1.09 0.96?0.07 ddddddTGP 160 36.3?7.10 128.0?11.10 108.10?14.34 77.78?2.05 38.78?1.80 0.99?0.06 ddddcCol 0.1 38.4?5.35 146.9?16.44 139.30?22.77 71.62?1.65 34.91?2.02 0.95?0.11 与正常组比较，a:P<0.05 , b:P<0.01与模型组比较，c:P<0.05 ,d:P<0.01(下同) ; 3 TGP对大鼠血清肝纤维化指标的影响 -1与正常组相比，模型组HA和PCIII含量显著升高。与模型组比较，TGP 80和160 mg,kg组血清中HA 和PCIII含量显著降低。结果见表2。 x表2 TGP对大鼠血清肝纤维化指标的影响 n=10, +s HA PCIII 组别 剂量 -1-1-1 /mg,kg /ng,mL /ng,mL … 146.67?33.12 78.22?7.81 正常 bb… 634.28?118.37 138.38?9.66 模型 ccTGP 40 518.60?69.08 128.14?10.77 ddTGP 80 449.02?74.65 115.95?13.71 5 ddTGP 160 373.19?59.44 92.00?10.73 dcCol 0.1 436.38?52.07 126.25?13.58 4 TGP对HSC体外分泌HA 和PCIII的影响 与模型组相比，24h和48h时TGP低中高浓度组的HA和PCIII含量均显著降低，表明TGP可明显抑制HSC细胞外基质的分泌。结果见表3。 表3 TGP 对HSC体外分泌HA与PC?的影响 n=3, +s x HA(24h) PCIII(24h) HA(48h) PCIII(48h) 组别 浓度 -1-1-1-1-1 /mg,L /ng,mL /ng,mL /ng,mL /ng,mL … 87.89?11.05 152.81?15.62 141.90?18.23 284.61?17.14 正常 bbbb… 285.57?20.93 322.88?23.74 331.49?21.49 488.67?23.27 模型 ccdcTGP 60 237.61?18.15 271.04?18.08 258.06?18.12 419.74?21.09 ddddTGP 120 193.97?18.48 231.65?14.15 226.23?17.78 380.20?17.14 ddddTGP 240 147.23?16.27 190.32?15.41 166.21?15.22 325.20?23.30 5TGP对HSC凋亡的影响 模型组的凋亡率较正常对照组显著升高[(4.01?0.48)% vs. (2.08?0.45)%，P<0.01]。与模型组相比，TGP低、中、高浓度作用48h均使HSC凋亡明显增加[(7.92 ?0.69)%，(13.01?0.66)%，(16.72?0.35)% vs. (2.08?0.45)%，P<0.01]，且存在浓度依赖趋势。结果见图2。 正常组 模型组 -1-1TGP 60 mg,L组 TGP 120 mg,L组 6 -1TGP 240 mg,L组 细胞凋亡图片说明:第一象限为死细胞区，第二象限为破膜细胞区，第三象限为正常细胞区， 第四象限为凋亡细胞区 图2 TGP对HSC凋亡的影响 讨 论 肝纤维化是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应，也是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程。肝纤维化发生的中心环节是HSC增生和激活，激活的HSC 不断增殖、游走到损伤区域，产生收缩性，生成大量胶原蛋白、多糖和糖蛋白等ECM蛋白， [5]而ECM的大量沉积最终导致了肝纤维化形成。本实验发现TGP作用24和48h均可明显抑制体外培养大鼠HSC分泌HA和PC?，但48h作用并不比24h强，原因可能与HSC体外培养48h后持续增殖导致HA和PC?等细胞外基质的分泌增加有关，同时TGP能够显著降低血清中HA和PC?的含量。实验还发现TGP能显著降低血清ALT，AST和ALP水平，升高血清ALB水平和A/G值。肝脏病理组织学观察显示TGP能减轻肝脏炎细胞浸润，改 [6]善脂肪变性，有利于肝细胞和肝脏组织结构、形态恢复正常。周登余等研究表明TGP能减少大鼠系膜增生性肾小球肾炎时系膜细胞的增生，使已经聚积的ECM部分降解，能一定程度保护和恢复大鼠的肾功能。 活化增生后的HSC可以通过凋亡途径而死亡，凋亡途径不但可以减少增生活化的HSC数量，而且不引起溶酶体等细胞器的破坏，很少引起微环境的炎症损伤，是清除增生HSC [7]的理想方式。本实验研究发现不同剂量的TGP均使HSC凋亡明显增加，且存在浓度依赖趋势。研究表明TGP可通过降低Bcl-2，增加Bax蛋白的表达，降低Bcl-2 /Bax蛋白比例，从而诱导细胞凋亡发生，抑制滑膜组织增生。Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax基因与细胞凋亡的关系倍受关注。Bcl-2过多将阻止Bax之间形成同源二聚体,而Bax同源二聚体的相对减少, [8]使细胞免受凋亡。 [9]本所前期研究表明，TGP预防给药可明显降低卡介苗加脂多糖诱导免疫性肝损伤小鼠的血清ALT水平，其机制可能与其直接清除自由基、提高抗氧化物酶的活性和降低脂质过氧化物水平，并可调节免疫功能，减少NO 和TNF-α的产生等有关。TGP对环磷酰胺升高 7 或降低的细胞或体液免疫均可恢复正常，在对原发性和继发性大鼠佐剂性关节炎(AA)研究 中，TGP呈功能依赖性的免疫调节作用，在不同的病理状态下TGP对异常的免疫功能具有 [10]双相调节作用，表现出呈功能和浓度/剂量依赖性的双向免疫调节。本实验表明TGP可能 通过诱导HSC凋亡、抑制HA和PC?等细胞外基质的分泌来改善CCl诱导的肝纤维化，4 但有关TGP诱导凋亡的机制尚需进一步的研究。 [作者简介] 李瑞麟(1981-)，男，硕士研究生。 [通讯作者]魏伟(1960-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事抗炎免疫药理学研究。 联系电话:(0551)5161208，E-mail:wwei@ahmu.edu.cn。 [参考文献] [1] 王宝恩(肝星状细胞与肝纤维化[J]. 中华肝脏病杂志，2000，8(4):197-199. 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