碱性磷酸酶动力学参数的测定

                                            题目：碱性磷酸酶动力学参数的测定            （创新实践活动）     2015年4月24日·北京 不同缓冲液对碱性磷酸酶动力学参数的影响 摘要 酶促反应动力学主要研究酶催化的反应速率以及影响反应速率的各种因素，为了更好的发挥酶的高效性，就必须准确把握酶促反应的条件。本文重点研究不同缓冲液所配制的酶液对酶促反应的影响。实验利用碱性磷酸酶溶解在TRIS，碳酸钠，去离子水等缓冲液中为酶液，磷酸苯二钠为基质，进行实验，得到去离子水为最适缓冲液的结果，明以去离子水为缓冲液所配制的酶液能使酶发挥最好的效果，具有研究意义。 关键词：碱性磷酸酶；缓冲液；动力学参数； 本试验以碱性磷酸酶为催化剂，磷酸苯二钠为底物，在一定温度、pH及酶量的条件下，碱性磷酸酶催化磷酸苯二钠转化为苯酚；利用分光光度计测定在不同底物浓度下苯酚的生成量。通过实验可以加深对有关酶促反应动力学基本知识的理解和记忆；并熟记利用双倒数法测定酶Km值的原理，熟悉试验。 1  实验材料、试剂与仪器 1.1 材料与试剂   实验中使用的主要试剂有          磷酸苯二钠:国药集团化学试剂有限公司 分析纯     醋酸镁：天津市永大化学试剂开发中心 分析纯     醋酸：北京化工厂 分析纯     碱性磷酸酶：北京化工厂 分析纯     4-氨基安替比林：天津市永大化学试剂有限公司 分析纯     铁氰化钾：北京化工厂 分析纯     硼酸：北京化工厂 分析纯     苯酚：天津市福晨化学试剂厂 分析纯     三羟甲基氨基甲烷（Tris）：北京化学试剂公司 分析纯     NaOH：北京化工厂 分析纯     碳酸钠：天津光复科技发展有限公司 分析纯     碳酸氢钠：天津市福晨化学试剂厂 分析纯   实验中使用的主要溶液有        （1）0.1 mol/L碳酸盐缓冲溶液（pH=10）：碳酸钠1.5875 g，碳酸氢钠0.84 g，蒸馏水溶解至250 mL。 （2）0.04 mol/L基质溶液：磷酸苯二钠0.436 g（无结晶水），用煮沸冷却的蒸馏水溶解至50 mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。 （3）0.1 mol/L醋酸镁溶液:醋酸镁1.0725 g，蒸馏水溶解至50 mL。 （4）pH 8.8Tris缓冲溶液：Tris 1.21 g，蒸馏水溶解至100 mL，取此溶液10 mL，加蒸馏水80 mL，再加0.1 mol/L醋酸镁10 mL，混匀后用1%的醋酸调节pH值至8.8，用蒸馏水稀释至100 mL即可。 （5）0.5 mol/L NaOH溶液：NaOH 5 g，蒸馏水溶解至250 mL。 （6）酶液：碱性磷酸酶1.25 mg，用pH 8.8的Tris 缓冲溶液配制50 mL，冰箱内保存。碱性磷酸酶1.25 mg，用pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制50 mL，冰箱内保存。碱性磷酸酶1.25 mg，用去离子水为缓冲溶液配制50 mL，冰箱内保存。 （7）0.3%4-氨基安替比林液：4-氨基安替比林液0.3 g，碳酸氢钠4.2 g，蒸馏水溶解至100 mL。 （8）0.3%铁氰化钾溶液：铁氰化钾1.25 g，硼酸3.75 g，，各溶于100 mL蒸馏水中，溶解后混合至250 mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。 （9）酚溶液：苯酚1.5 g，溶于0.1 mol/L盐酸至1000 mL，为储备液。取此储备液25 mL，标定后用蒸馏水稀释至0.1 mg/mL 作为标准溶液。 1.2 仪器 烧杯（100 mL）6量筒，移液管，试管，试管架 分光光度计 型号UV2300 上海天美科学仪器有限公司 电子天平 型号 AL204-IC 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 恒温水浴等 型号 DF-101S 金坛市晶玻实验仪器厂 2  试验方法与步骤 2.1 标准曲线的制备 取酚标准液0.00、0.05、0,10、0.20、0.30、0.40 mL于6支试管中，分别加蒸馏水至2.00 mL后，37℃水浴中保温5 min，然后各加入0.5 mol/L NaOH溶液1.00 mL、0.3%4-氨基安替比林液1.00 mL、0.3%铁氰化钾溶液2.00 mL，混匀后室温放置17 min，510 nm波长处比色，并绘制标注准曲线。各管酚含量分别为0、5、10、20、30、40μg。 2.2 动力学参数确定实验 取干净试管9支，编号，按表1,表2，表3正确操作。 表1 动力学参数测定试剂用量1 试管号 水/mL 0.04mol/L基质液/mL 碳酸盐缓冲液/mL pH8.8Tris 缓冲溶液配制酶液/mL 最终基质浓度/（mmol/L） 1 0.9 0.1 0.9 0.1 2.0 2 0.85 0.15 0.9 0.1 3.0 3 0.8 0.2 0.9 0.1 4.0 4 0.75 0.25 0.9 0.1 5.0 5 0.7 0.3 0.9 0.1 6.0 6 0.6 0.4 0.9 0.1 8.0 7 0.2 0.8 0.9 0.1 16.0 8 - 1.0 0.9 0.1 20.0 9 1.0 - 0.9 0.1 - 表2 动力学参数测定试剂用量2 试管号 水/mL 0.04mol/L基质液/mL 碳酸盐缓冲液/mL pH=10碳酸钠缓冲溶液配制酶液/mL 最终基质浓度/（mmol/L） 1 0.9 0.1 0.9 0.1 2.0 2 0.85 0.15 0.9 0.1 3.0 3 0.8 0.2 0.9 0.1 4.0 4 0.75 0.25 0.9 0.1 5.0 5 0.7 0.3 0.9 0.1 6.0 6 0.6 0.4 0.9 0.1 8.0 7 0.2 0.8 0.9 0.1 16.0 8 - 1.0 0.9 0.1 20.0 9 1.0 - 0.9 0.1 - 表3 动力学参数测定试剂用量3 试管号 水/mL 0.04mol/L基质液/mL 碳酸盐缓冲液/mL 去离子水为缓冲溶液配制酶液/mL 最终基质浓度/（mmol/L） 1 0.9 0.1 0.9 0.1 2.0 2 0.85 0.15 0.9 0.1 3.0 3 0.8 0.2 0.9 0.1 4.0 4 0.75 0.25 0.9 0.1 5.0 5 0.7 0.3 0.9 0.1 6.0 6 0.6 0.4 0.9 0.1 8.0 7 0.2 0.8 0.9 0.1 16.0 8 - 1.0 0.9 0.1 20.0 9 1.0 - 0.9 0.1 - 加入酶液后，立即计时37℃水浴中保温15 min。保温结束后，立即加入0.5 mol/L NaOH溶液1.00 mL以终止反应。 各管分别加入0.3%4-氨基安替比林液1.0 mL及0.3%铁氰化钾溶液2.0 mL，充分混匀，放置10 min以9号管为对照，在510 nm处比色，并计算各管的酶活性。用双倒数作图法，在坐标纸上作图，求该酶的Km值。 3  结果与讨论 3.1 标准曲线的绘制 用分光光度计测量每个试管的透光率，再依据公式-logT计算吸光度的值，具体数值见表4 表4 标准曲线参数值 酚含量（μg） 透光率T% 吸光度（ABS） 0 100 0 5 38.6 0.413 10 30.2 0.52 20 18.9 0.724 30 11.2 0.951 40 7.9 1.102 依据表4的数据绘制标准曲线见图1 图1 标准曲线图 得到公式y=0.0312x。 相关系数较小的可能原因为：标准样受到污损，人为操作有误，一起不稳定等。 3.1.2 动力学参数确定实验 按照2.2进行动力学参数测定试验，实验结果见表5，并依据表5的结果进行数据处理，处理结果见表6,7,8。利用表6,7,8的数据，以底物浓度的倒数为横坐标，酶促反应速率的倒数为纵坐标作图，见图2,3,4。计算出动力学参数，得到动力学方程1/V=Km/（Vmax*Cs）+1/Vmax。 表5 不同酶液的T% pH 8.8 Tris 缓冲溶液配制的酶液的T% pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的T% 去离子水为缓冲溶液配制的酶液的T% 0.711 0.691 0.720 0.702 0.682 0.709 0.675 0.658 0.706 0.667 0.647 0.705 0.677 0.636 0.685 0.64 0.623 0.666 0.629 0.591 0.655 0.617 0.584 0.645 1 1 1 表6 pH 8.8 Tris 缓冲溶液配制的酶液的数据 T ABS D C 1/Cs 1/V 0.711 0.148 4.740 0.790 0.5 18.9 0.702 0.154 4.926 0.823 0.33 18.2 0.675 0.171 5.481 0.914 0.25 16.4 0.667 0.176 5.641 0.940 0.2 15.9 0.677 0.169 5.417 0.903 0.16 16.7 0.64 0.194 6.218 1.036 0.125 14.5 0.629 0.201 6.442 1.074 0.063 14 0.617 0.210 6.731 1.122 0.05 13.3 1 0 0 - - - 图2 pH 8.8 Tris 缓冲溶液配制的酶液的双倒数图 让y=0，则x=-1.085，Km=0.9217mmol/l。 表7 pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的数据 T ABS D C 1/Cs 1/V 0.691 0.161 5.160 0.860 0.5 17.5 0.682 0.166 5.321 0.887 0.33 16.9 0.658 0.182 5.833 0.972 0.25 15.4 0.647 0.189 6.058 1.010 0.2 14.9 0.636 0.197 6.314 1.052 0.16 14.3 0.623 0.206 6.603 1.101 0.125 13.7 0.591 0.229 7.340 1.223 0.063 12.2 0.584 0.234 7.500 1.250 0.05 12.0 1 0 0 - - - 图3 pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的双倒数图 让y=0，则x=-0.935，Km=1.0695mmol/l。 表8 去离子水为缓冲溶液配制的酶液的数据 T ABS D C 1/Cs 1/V 0.720 0.143 4.583 0.764 0.5 19.6 0.709 0.149 4.776 0.796 0.33 18.9 0.706 0.151 4.840 0.807 0.25 18.5 0.705 0.152 4.872 0.812 0.2 18.5 0.685 0.164 5.256 0.876 0.16 17.2 0.666 0.177 5.673 0.946 0.125 15.9 0.655 0.184 5.897 0.983 0.063 15.2 0.645 0.190 6.090 1.015 0.05 14.7 1 0 0 - - - 图4 去离子水为缓冲溶液配制的酶液的双倒数图 让y=0，则x=-1.3504，Km=0.7405mmol/l。 3.2 动力学参数测定实验结果与讨论 以上结果表明：用去离子水为缓冲溶液配制的酶液最合适，用pH 8.8的Tris 缓冲溶液配制的酶液次之，用pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液最不合适。此次实验，受限于实验环境，设备条件，人为操作等因素的影响，对于这三种酶液的具体情况还有待研。        3.3 体会 通过这次试验，我更加深入的了解了不同缓冲液配置的酶液对于酶促反应速率的影响，且对于反应操作也更加得心应手，不足之处在于酶液的配置及保存都有很严格的要求，受外界环境因素的影响较大，导致实验结果出现偏差， 希望之后通过文献的查阅，实验条件的改善，人员操作的谨慎能更加准确的测定其效果。 参考文献 [1] 史凌云，周婷，徐成，张媛媛，赵小峰，高梦，於露，贺玲 .正交实验法对碱性磷酸酶活性测定的优化[J].生物学通报，2014，49(7)：50-52 [2] 洪 新，唐克，牟晓刚，朱海燕 .耐酸性α-淀粉酶酶促反应动力学研究[J].辽宁工业大学学报，2010，30（2）:116-118 [3] 周毅 .浅谈酶促反应方法与影响酶促反应速率的因素[J].中国卫生标准管理2014，5（23）：71-72 [4] 王秋颖 .碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011,38（1）：157-160 [5] 陈银霞 .影响酶促反应速度的外因研究[J].现代农业科技,2008,18：238-239