异丙莠对小鼠微核、染色体畸形及精子畸形率的影响

异丙莠对小鼠微核、染色体畸形及精子畸形率的影响 异丙莠对小鼠微核、染色体畸形及精子畸形率的影响 摘要:本试验主要研究异丙莠的致突变性和遗传毒性。通过本试验中，异丙莠对小鼠的作用，探究异丙莠对哺乳动物的致突变性和遗传毒性。 方法:60只N IH同体重小鼠体重随即分为3个大组,每大组由5个小组构成,每组实验动物4为只小鼠,设空白试剂试验组为阴性对照组、环磷酰胺( cyclophosphamide, CP)试验组为阳性对照组(剂量为20 mg/kg)和异丙莠染毒组(剂量分别为125、62.5、31.25 mg/kg) 。分四次经口染毒,间隔24h。采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验,来研究异丙莠对小鼠的毒理作用。结果该研究下未观察到有明显的诱导小鼠外周血网织红细胞微核形成作用,但有明显的染色体畸变和精子致畸形作用。结论异丙莠对哺乳动物遗传物质有潜在的致突变和致畸作用。 关键词:异丙莠;染色体;微核;精子;小鼠;畸形;致突变性 异丙莠是一种除草剂，由传统的除草剂异丙草胺(2-氯-N-(异丙基甲基)-N-(2-乙基-6-甲基)苯基乙酰胺)和莠去津复配而成，这种除草剂有明显的优点，但是其对人体是否存在毒理作用尚不清楚。有研究表明阿特拉津在一定剂量下对小鼠生殖细胞可能存在遗传损伤, 干扰精子的正常生成与成熟过程。所以有人认为异丙莠有致畸和致突变作用，但是有人则认为其威胁不大，异丙莠对哺乳动物是否具有致突变性和致畸性, 是否应禁止生产或限量使用, 是目前需解决的问题。本文旨在通过对异丙莠致突变性的观察, 为其生产及应用前景提供科学依据。本试验通过不同剂量的异丙莠小鼠嗜多染红细胞微核、染色体及雄性小鼠精子的影响来探讨氯化镍对哺乳动物的毒理作用。 正文: 1.与方法 1. 1 实验材料 本实验取小白鼠,体重16,18 g,随机分为3大组,每大组由5小组构成,设空白试剂试验组为阴性对照组;环磷酰胺( cyclophosphamide, CP)为阳性对照组(剂量为20 mg/kg)和异丙莠染毒组(剂量分别为125、62.5、31.25 mg/kg),通过小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠骨髓染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验来研究异丙莠对哺乳动物遗传物质的致突变作用。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 小鼠骨髓细胞微核试验 设125、62.5、31.25 mg/kg 3个异丙莠剂量组及阴性对照组(空白试剂)和阳性对照组(环磷酰胺20mg/kg) 。分四次经口注入,间隔24h，用颈椎脱臼法处死小鼠,剪开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型止血钳，将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。将推好晾干的骨髓片用甲醇固定15分钟，晾干。然后用Giemsa染液染色10至15分钟，然后冲洗掉玻片上的染液，晾干。在油镜下观察计数，计数结果见表一。 1. 2. 2 小鼠骨髓染色体畸变试验 设125、62.5、31.25 mg/kg 3个异丙莠剂量组及阴性对照组(空白试剂)和阳性对照组(环磷酰胺20mg/kg) 。分四次经口注入,间隔24h。处死动物前2,4h，腹腔注射秋水仙素，小鼠剂量为4mg/kg，用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取双侧股骨，去肌肉，擦净血污，剪开两端关节面，用注射器系PBS液5ml冲出骨髓于离心管中，用1500r/min离心10min，去上清液。打散沉淀物，加入预温37 ?的0.075mol/L Kcl液约6ml，混匀，于37 ?低渗20min，再加固定液2ml混匀，立即于1000r/min离心10min，弃上清液。使细胞重新悬浮，加固定液4ml，放置室温15min,然后1000r/min离心10min，去上清液，同样方法在固定一次，留约0.5ml。使细胞悬浮，将细胞悬液滴于冰冻的载玻片上，干燥，用10%Giemsa染液染色15min，取出清洗，自然晾干。在低倍镜下选择分散良好细胞膜破裂的中期分裂相，观察并记录染色体结构异常和数目异常的细胞。结果见表二。 1. 2. 3 小鼠精子畸形试验 设125、62.5、31.25 mg/kg 3个异丙莠剂量组及阴性对照组(空白试剂)和阳性对照组(环磷酰胺20mg/kg) 。分四次经口注入,间隔24h，用颈椎脱臼法处死小鼠,剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml磷酸盐缓冲液或空白试剂的小平皿中，用眼科剪将附睾剪碎，用吸管将悬浮液轻轻吹打5到6次，静置3至5分钟，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min，用2%伊红水溶液染色0.5h，油镜下镜检计数。结果如表三。 1. 2. 4 数据由统计方法 采用spss13.0软件,统计分析各组试验数据间的差异。 2 结果与分析 2. 1 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果 高、中、低三个剂量组的微核率与阴性对照组比较,高、中剂量组差异显著(P<0.05)，低剂量组无明显差别(表一) 。 (表一) 异丙莠对微核的影响 剂量 动物数 受检细胞数 微核数量 微核率 组别 P值 mg/kg (只) (个) (个) (%) 环磷酰胺 20 8 200 27 13.5 <0.05 异丙莠(高) 125 8 200 13 6.5 <0.05 异丙莠(中) 62.5 8 200 3.5 <0.05 7 异丙莠(低) 31.25 8 200 2 1.0 >0.05 阴性对照 0 8 200 1 0.5 注:与阴性对照组比较，P<0.05 2. 2 小鼠染色体畸变试验结果 高、中、低三个剂量组的微核率与阴性对照组比较,高、中剂量组差异显著(P<0.05)，低剂量组无明显差别(表一) 。 (表二) 异丙莠对染色体畸变的影响 染色体畸变剂量 动物数 受检细胞数 畸变率 组别 细胞数 P值 mg/kg (只) (个) (%) (个) 环磷酰胺 20.00 8 200 25 12.5 <0.05 异丙莠(高) 125.00 8 200 12 6.0 <0.05 异丙莠(中) 62.50 8 200 2.5 <0.05 5 异丙莠(低) 31.25 8 200 2 1.0 >0.05 阴性对照 0 8 200 1 0.5 注:与阴性对照组比较，P<0.05 2. 3 小鼠染精子畸形试验结果 高、中、低三个剂量组的染色体畸变率与阴性对照组比较,差异都很显著(P<0.05)(表三) 。 (表三) 异丙莠对小鼠精子畸形的影响 精子畸形数剂量 动物数 受检精子数 畸形率 组别 量 P值 mg/kg (只) (个) (%) (个) 环磷酰胺 20 8 200 67 33.5 <0.05 异丙莠(高) 125 8 200 48 24.0 <0.05 (中) 62.5 8 200 26 13.0 <0.05 (低) 31.25 8 200 17 8.5 <0.05 阴性对照 0 8 200 2 1.0 注:与阴性对照组比较，P<0.05 3 讨论与结论 本实验发现，异丙莠对小鼠骨髓嗜多染红细胞、染色体，生殖细胞的遗传物质均具有不同程度的致突变作用，并且随着异丙莠剂量的增加，致突变的作用越明显。 目前，对于异丙莠对哺乳动物的毒理作用还处于研究阶段。本文通过异丙莠对小鼠骨髓嗜多染红细胞中产生微核、染色体畸变，生殖细胞的遗传物质改变的影响，探讨异丙莠对哺乳动物的致突变性和遗传毒性。这将对异丙莠的安全使用措施提供参考数据。 参考文献 1、郭 淼 、尹 峰 、董 毅，氯化镍对小鼠的毒理作用，山东农业大学学报(自然科学版) , 2008, 39 (3) : 361 – 364 2、张 越、金焕荣、段志文、赵 肃，阿特拉津对小鼠微核及精子畸形率的影响，沈 阳 医 学 院 学 报，第 2卷，第2期，2006，6 3、云南农业信息网资料