免疫组化

免疫组化 ******关键 1 是细胞爬片的细胞密度适中，细胞少了最后不容易找到，多了影响形态观察。 2 我用的是冷的4%多聚甲醛固定，效果不错，丙酮也可以，但容易使细胞收缩。 3 各步骤一定洗干净(PBS) 4 中山的二步法，简单、实用。 5 关于Triton-X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，我用0.1,(PBS稀释)，如果抗原在细胞浆， 我建议还是用的好～ 有一点个人建议 1.DAB显色:有很多情况染色很快 要是避光无法观察 很有可能染色过甚,要是本身能染上的 不用避光也没有问题。 2.苏木素复染 0.5~1min之后,水洗后,最好再用乙醇脱水，85,95,各一分钟，二甲苯去乙醇 两次 每次一分钟。 3、树胶封片。 ******细胞与组织区别若抗原达在胞浆或胞核内者须破膜，抗体孵育时间较组织适当延长，由于固定时间较短，有的无须抗原修复。 1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2 PBS清洗标本 3次 各 1 min。 3 冰丙酮固定 15 min。 4 空气干燥 5min。 5 PBS清洗标本 3次 各 2 min。 20 min。 6 0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 7 PBS清洗标本 3次 各 2 min。 8 3%H2O2孵育 15 min。 9 DPBS清洗标本 3次 各 2 min。 10 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液) 20min。 11 一抗孵育(PBS配，滴度1:200，湿盒)4OC 过夜 或37OC 60 min。 阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液 12 PBS清洗标本 3次 各 5 min。 13 二抗工作液孵育(湿盒) 37OC 30 min。 14 PBS清洗标本 3次 各 5 min。 15 C液(湿盒) 37OC 30 min。 16、PBS清洗标本 3次 各 5 min。 17、DAB显色(避光，镜下观察至棕色 ) 约3~10min。 18、蒸馏水洗 2次 1 min。 19、苏木素复染 0.5~1min。 20、自来水洗 30min。 21、树胶封片。 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下: (1) 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片; (2) 接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片; 2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4OC冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，(不可用吸管太用力吹，易脱片) 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100(屈立通)表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。 -20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋******我的做法是:细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，— 白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。 当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。 如:1。多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等 2(乙醇。优点:穿透性强、抗原性保存较好。缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 3(甲醛(福尔马林)应用最广 优点:形态结构保存好，且穿透性强， 缺点: 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 *******将原代和第三代培养得到的NSCs克隆球，滴在预先涂有0.1%明胶的24孔培养板上，加少量培养液继续培养2h，使克隆球能够贴附到盖玻片上而又没有分化。2h后取出培养板按照以下步骤进行免疫细胞化学染色。 1) 用0.01M冷PBS轻轻洗涤3次，每次3-5min 2) 冷风吹干后，用4%多聚甲醛室温下固定20min 3) 0.01M的PBS轻轻洗涤3次，每次3-5min 4) 3% H2O2/甲醇室温下作用30min，去除内源性过氧化物酶 5) 0.01M的PBS轻轻洗涤3次，每次3-5min 6) 0.1% Triton X-100室温下作用30min 7) 0.01M的PBS轻轻洗涤3次，每次3-5min 8) 10%正常山羊血清封闭20min，吸去多余液体(保留薄层血清) 9) 加入抗nestin单克隆抗体(1:100)，放入湿盒中4?过夜 10) 0.01M的PBS轻轻洗涤3次，每次3-5min 11) 分别加入二抗及三抗,各15min, 12) 0.01M的PBS轻轻洗涤3次，每次3-5min 13) DAB显色,5-10min 14) PBS漂洗,镜下观察 *****细胞爬片HE染色 要点: 标本的制备:细胞爬片的制作很关键，首先是细胞能够爬好，细胞分布均匀，密度适中;其次是不会在染色过程中脱片，细胞形态走形～相应的处理----要选择状态良好的细胞，一般要选择消化吹打均匀传代第二或三天的细胞，镜下的标准为细胞平铺为瓶底的80,左右为宜。细胞分布均匀，形态良好，吸取(标准是吸取而不是倾倒)培养基，加无血清培养基或PBS洗一遍，加1ml胰酶(大号瓶可加致2ml)，轻晃使胰酶分布到每个角落，考虑胰酶刚刚融化，加后可在火上过几下，因为在37度消化作用最好。一般消化2到3分钟(不同细胞不一样，)，镜下(金标准)见细胞回缩，边缘折光性改变，向 圆形改变(经验:这时稍用力摇晃，镜下见一些圆形细胞随胰酶漂移即可)，即倒掉胰酶，加培养基或血清(体会:加培养基即可，而且吹打时不易形成泡沫)吹打，感觉象流沙一样最好，但绝对不可消化过头～～消化后要多吹打几次，尽量形成单细胞悬液，离心后调整细胞接种密度(摸索本细胞系体会:2,5×104/ml合适)。 玻片的制备:盖玻片泡清洁液24小时，自来水洗10遍，1蒸洗3遍，煮沸20分钟，2蒸洗3遍，煮沸20分钟;放入80,(须进一步明确)酒精2,4个小时，用绸布搽拭凉干。放入瓶皿高压灭菌待用。(本实验未用多聚赖氨酸涂片，具体过程可见DXY) 加细胞时，先在每个孔里滴几滴培养基，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。接种后6小时细胞即可贴壁，可去上清加含药培养基，等作用时间到，取玻片。 固定:细胞爬片后用4,的多聚甲醛固定20分钟后，PBS洗2遍后进行染色; 染色:玻片用中性树胶把无细胞面和载玻片固定，便于染色。过程(此过程适合细胞爬片，石蜡切片等不尽相同，须查相关文献和专著)——苏木素中1,1.5分钟;自来水洗数遍，加氨水(少量，起泛蓝的作用);放入分化液(配方为盐酸酒精，比例未记～作用时间，有文献介绍2,7秒，具体须自己摸索;作用是溶解蓝色的苏木素，尤其是胞浆的蓝色)片刻;放入伊红1,2分钟;80,酒精2,3分钟;95,酒精?2,3分钟;95,酒精?5分钟; 100,酒精?5分钟;100,酒精?10分钟;二甲苯?10分钟;二甲苯?10分钟;将玻片细胞面和载玻片用中性树胶封片。