β—淀粉样蛋白31～35对体外培养的隔区胆碱能神经元的作用

β—淀粉样蛋白31～35对体外培养的隔区胆碱能神经元的作用 β—淀粉样蛋白31,35对体外培养的隔区胆 碱能神经元的作用 ChinJN?scL,1999;Vo【15(2);115,1i91l5 p一淀粉样蛋白31~35对体外培养的隔区胆碱能神经元 的作用 王琦谢瑶,挑志蝣 _【j剖学教研室广州510089) R7f/6.己 摘要淀粉样蛋白是老年斑的主要成分.为探讨其在老年性痴呆患者基底前脑胆碱能神经元选择性溃变 中的作用,运用MTT自动比色微量分析法,胆碱醇酶组织化学染色及细胞形态学分析方法,研究”老化的淀 粉样蛋白片段31,35对体外培养的海马和隔区神经元的作用.结果明:培养48h,淀粉样蛋白对海马神经 元有毒性作用.减少神经元的存活,呈剂量依赖关系.培养14d,淀粉样蛋白减步了胆碱能神经元的存活率,抑 制突起的延伸,促使神经元胞体和近侧突起的分支增加表明淀粉样蛋白对隔区胆碱能神经元具有减少存 活,抑制突起延伸和促进突起不正常生长的毒性作用. 关键词淀粉样蛋白隔区胆碱能神经元体外培养毒痔 EFFECTSOFB-AMYLOIDPEPTIDE31,35ONTHESEP— TALCHoLINERGICNEURoNS,,D WAGQi,XIEYao,YAOZhi—Bin (DepartmentofAnatomy,SunYat-SenUniversityofMedicalSciences?Guangzhou510089) ABSTRACTamyloidpeptide(A13)isanimportantcomponentinsenileplaque.thatisoneoftheneu— ropathologicalfeaturesofA[zheimerdisease(AD)InordertOexploretheeffectsof13-amyloidpeptideonthe septalch0linergiene~ons.~hichwaslostmAD.AChEhistochemistryandcetlularmorphologicalmethods andarapidautomatedcolorimetriemicroassywereused.TheresultsshowthatagedAI331,35hasthetoxic etfectsonthehippocampalneuronandcho[inergicneuron.Thenumberoflivingneuronsinhippocampa[cul— tureswasdecreasedindosedependentfor48hours.AB31, 35promotessproutingoftheproximaIprocesses andsomeregionsofcholinergicneuronsinsepta[butinhibitstheprolongationofnewbranchandmainpro— cessesforculture14days.ItissuggestedthataccumulationofA3fragmentsmayhavearelationwithselec— tirelossofseptalcholinergicDe.tonsandaberrandysproutingofprocessesins enileplaqueofAD. KEYWORDSamy[oidseptumcholinergicneuroninvitro 老年性痴呆症(AhhaimerDi且其下降程度与认知功能 丧失与sP和NFT有密切关系….构成sP的主要 成分是淀粉拌蛋白(Amyloidprotein.A),它是由 大分子的淀粉样蛋白前体裂解而来.含有39~42个 氡基酸残基近年来,有研究表明:Ap片段不仅可以 促进体外培养的海马神经元存活,甚至能促进突起 的生长;而经过37?条件下孵育即”老化” (aging)的Ap片段却对海马神经元产生毒性作用, 减少神经元的存活.说明A口对海马神经元具有营 养和毒性双重作用[2,41.而这截然相反的作用可能正 是异常突起在SP内聚集盘绕和高密度SP脑区常 伴有神经元丢失的原因之一].为了解A口是否与 AD患者基底前脑胆碱能神经元选择性丢失有关, 本实验通过MTT自动微量比色法,胆碱酯酶组织 化学及细胞形态学分析方法,研究对体外培养 的胚胎大鼠隔区胆碱能神经元的存活与生长的影 响 1材料和方法 1.1淀粉样蛋白的.老化”处理?将A1,35 (Sigma产品)溶解在DMEM/F12培养基(GIBCO 产品)由,1ml培养基溶解1mg的A831,35,0.2 滤器过滤除菌,即为A1,35原液.将原液置 于37?恒温箱内孵育4,7d.进行老化处理然后 4c贮存备用,用时稀释. 12神经细胞培养取妊娠18d的Sprague—Daw— icy大鼠胚胎脑,按Hartikka等:方法在解剖镜下分 离出海马和隔区,分别剪碎并用Hanks平衡液洗 涤,加入0125胰蛋白酶(trypsin,Sigma产品)溶 液消化(37c,15min).用含有1j新生牛血清(杭 州四季青生物公司产品)的DMEM/F12培养 液终止消化并洗涤=细口径次. 快速自动微量比色分析(MTT比色微量分 析)D]:终止培养前4h.每孔加入10四唑盐 (MTT,1.5mg/mlDMEM)继续培养.4h后每孔加 入tO0gl0.08mol/LHCI一异丙醇溶液终止反应,吸 管反复畋打致使MTT反应的蓝色产物充分溶解. 将培养板放在DydatechMR4000型微板读数器上, 采用实验波长570nm和参考波长630nm测每孔拌 品的光密度(0D)值. 1.2.2隔区胆碱能神经元的培养,染色及观测另 将隔区细胞稀释至5×10cells/ml的悬液,接种于 预先置有盖玻片的35mm的培养皿中,每皿2ml. 等细胞贴壁后,实验组加入”老化”的AI331,35,最 终浓度为20#mol/L,对照组以培养液代替.置皿于 37?,5CO.培养箱内培养.接种后第3天在皿 中分别加入10mol/L阿糖胞苷(cytosinearahi— noside,Sigma产品)以抑制非神经元过度繁殖.48h 后更换新鲜培养液,井保持实验组A?1,35的浓 度不变.14d后,用l0甲醛室温固定20min,按 Karnovsky和Rootsn法进行胆碱酯酶(AChE)染 色.尼氏复染后,在镜下分别计数500个相邻细胞 中AChE阳性神经元数目,并用CameraLucida将 AChE阳性神经元胞体及突起描绘在绘图纸上,采 用Shol1分析方法[】分析突起的结构参数,即以神 经元胞体中心为圆心,计数突起与相同间距(代表 14m)的同心圆的截氨数,得出神经元突起总长度 及分支分布情况.并计算神经元的初级和次级分支 数目,求其平均值.由胞体直接分出分支为初级分 支,余者皆为次级分支 2结果 2.1老化”淀粉样蛋白对培养48h神经元存活的 影响用MTT比色微量分析法检测三种不同浓度 的A#31,35对海马神经元的作用.结果1tmaol/ L组oD值最高,与对照组比较无差异(P>005): 随浓度增加OD值曲线下降明显,10#mol/L组和 20gmol/l组分别与对照组比较有差异,20 #mol/L组为甚(P<O.01).但对隔区神经元各浓度 组的OD值与对照组比较均无显着性差异(P> 0.05)(图I).图2A,B显示了两组培养的海马神经 元MTT染色情况.对照组(A)MTT结晶物形成量 较实验组(B)多,表明对照组存活细胞多. 样蛋白3l,35对体外培养的隔区胆碱能神经 2—2淀粉样蛋白对长期培养隔医胆碱能神经元的胞体远侧突起长 度减少,截点数较对照组减少 影响 2—21A31--35对培养的隔区胆碱能神经元存活 的影响用胆碱酯酶组织化学合并尼氏复染方法计 数显示:培养14d后,实验组和对照组AChE阳性 神经元所占存活神经元的百分比分别为4.07和 6—85(P<0.05)(表1)=表明”老化的A03l,35长 期作用对隔区胆碱能神经元可能具有选择性毒性作 用. 2.22AI33],35对培养的隔区胆碱能神经元突起 的影响培养14d的实验组的隔区胆碱能神经元 初级,次缎分支较对照组显着增多(P<oO1),但突 起长度和突起野范围较对照组小(表2)SholI点分 析显示实验组与对照组隔区胆碱能神经元突起总长 度并无明显差异但对突起长度按Shol[同心圆序 数作进一步分析(图3)表明:实验组胞体近侧突起 长度或分支增多,截点数较对照组明显增多;相反, Fig1Effectofdifferentconcentrationsof~amylold(AB) onhippocampusandseptum……inculturefor 48h(1XlOcel[s/hole) Fig2A,BMTTstainofhippocampal? nsculturesofEl8rafor48hoursA.Controlgroup;B.A口group;C…Dpta …r.nsscatteringcultureofEl8Htsfor14days-AChEhistocb.emistrycombiningNisslstainingCControlgroup D.A日group 118王 Tab1Eff~tofB-amyloid(31, 35)ORAChE—positiveneuronsinseptalcultures 尸<0.05 Tab2Effectofamyloid(31~35)onAChE—positiveReurollSinseptalculture s 一 64.尸<001 orderofs?日H(?tt~/L) Fig3Shol[pointanalysisofamo】d(31,拍)effectlna processesgrowthofseptalcho[[nergicneuronin vitro 3讨论 邶是老年斑的主要成分,由其前体蛋白裂解而 来.不同序列的A0片段的生物特性也不尽相同. Whitson等口.”分别用Al31~28和A目l,42片段处 理培养的海马神经元.发现前者能增加神经元的存 活;而后者既增加神经元的存活+叉能促进神经元的 突起生长.Yanker等在海马神经元培养的不同时 期先后加入A81,4o片段,结果在培养的初期和后 期分别出现营养和毒性作用,故推测这可能与神经 元分化程度和A目浓度相关.并认为与速激肽神经 肽家族具有同源性的A022,35序列部分是AB毒 性的决定序列. 许多研究证实.A8的分子构型及生理状态与其 神经毒性的关系十分密切.Pike等”把高浓度 的A月原液置于37?恒温箱中孵育4,7d,A8即自 行聚集并形成直径为5,10nm的纤维丝.其生物活 性发生变化,对海马神经元产生毒性作用.至今,关 于AB对基底前脑胆碱能神经元的作用报道较少. Harkany等口把AB1,42活体注射至大鼠基底前 脑的Meynert基底核,存活14d后,发现同侧大脑 皮质的乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶活性下降, 胆碱能神经纤维发生溃变+故认为邶对基底前脑 胆碱能神经元具有毒性作用.本实验以A目毒性片 段序列的31~35片段经上述条件老化”处理后+作 用于体外培养的海马和隔区神经元.通过快速自动 比色微量分析法检测Aft31,35对海马和隔区神经 元存活的影响,即在终止培养前加入MTT+后者可 被活跃的细胞摄取并转变为蓝色反应产物+通过测 定其光密度值即可反映活跃的神盔元的相对数目. 结果表明:3l,35浓度达10~mol/L时,对海马 神经元有毒性作用,但对培养早期的隔区神经元的 作用不甚明显这可能说明了A8毒性作用具有一 定的时效性和选择性[5?. 为观察A0对基底前脑胆碱能神经元直接影 响,我们采用隔区神经元盖玻片长期培养,14d后作 AChE组化染色+尼氏复染后作细胞计数及形态学 观察.结果表明实验组的AChE阳性神经元百分率 少于对照组,说明”老化3l,35长期作用对隔区 胆碱能神经元具有毒性作用.由于胆碱能神经元在 隔区神经元总数中所占比例仅为1,13.故 在短期培养物的MTT自动比色微量分析中,实验 组与对照组未见有显着性区别.随着培养时间延长, 邶的毒性逐渐显示出来.Sholl点分析结果显示实 验组胆碱能神经元突起野范围小于对照组,但其突 起的初级与次级分支较对照组明显增多+似乎A8 可促进突起抽芽,分化出更多的分支.由于突起分支 31,35对体外培养的隔区胆 增加而总长度不变,表明突起的延伸和生长受到抑 制.那么究竟是抽芽作为突起延伸抑制的一种代偿, 抑或是抽芽消耗了营养物质使突起的延伸能力下 降,现在尚不清楚Geddes等证实在AD患者海 马齿状回分子层观察到与内嗅皮质损伤后出现胆碱 能的纤维抽芽相类似的情况,且老年斑先行出现在 突起抽芽活跃的脑区.因此推测老年斑内某些物质 具有刺激胆碱能神经元抽芽的作用 总之+A日3l,35对培养的海马神经元和隔区胆 碱能神经元的作用是复杂的,它减少神经元的存活, 抑制突起的延伸,但又能促进近端突起不正常分支. 这些表现似乎与AD病理改变有些类似 参考文献 1Y丑oZB.ChenYC.PiOofbrainresearch.Publisher ofSeie~ceandTechnologyofGu~ngdong,1995fp175 , 186 2YankerBA,DullyLK,KirschnerSA.Neurotroph]c andaeurotoxiceffectsofamyloidBprotein:revez~a]by tachykirdnneuropeptides.Seance,1990{250:279,288 3WhitsonJS,GlabeLG—shitan[E,a1.amyloid protMnpromotesneuriticbranchingnhippocampa[ eu]tu1~es.NeUTOBC】Lett,l990{l1013l9,324 4PikeCJ.Wa]e~cewiczAJ,GlabeLG.a1.In咖 agingo5~-amyloidproteincsusespeptidesaggregation andneurotoxicity.BrainRes,109l}56313l1,314 5MannDM.YatesPO,MarcyniukB.Cor1~elationbe t?plaqueandneurofibrillarytangleCOuntsin braIC~ITtexandneugon81countsjncodexandBubcorti— ca】structuresinAhheimerdisease.NeurosclLett. 1985}56:51,55 5HartikkaJ—HeftiF.Compa~sono5neFvegrowthfac— torseffectsondevelopmentofseptum.striatumand nuc]eu~bxsal~cholinergie~eutonsin埘r..JNeurosci Res,l988E21:352,364 7QingH.GuoWH.Promotingthedevelopmentofthe rOIlsofsubstandaaigraofmese~cephalonbythe abstract~fromstfiatum.AendemicJAnat,1994E25 (3):313,3l7 8KarnovkyMJ.RootsJ.A”direct~oloring”thio— cholinemethodforeho]inesteraseJHistochemcy tocbem一1964;l2:219~221 9Y】N.HistologyandHistochemkeaItechnoJogyPub ]isherofHunanMedicalCollege,1986p136 l0Sho1]DA.Dendriticorganizationinthe呻uronsofthe visua】andmotorcorticesofthecat.JAnat,l953{871 387,406 11WhitsonJS,Se]koeDJ,CotmanCW.Amy]oldPprotein enchancesthesurvivalofhippocampalneuEon5invit— r..Seience,1989243:1488~1490 l2TakadenaT.SakuraN,MohriT,eta1.Toxiceffects ofnamyloldpep~ides(A822,30nthlppocam palneu~nanditsprevent~n.NeurosciLeft,1993;61: 41,44 l3PuttfarekenPS,ManelliMA.NeillyJ.Inhibitionof age—inducedamyloidneurotoxicityinrBth~ppocam palcells.Expneuro].1996;138;73,81 14HarkanyT?LengyeIZ?SoosK,a/Cholinotoxicef— fectsofbeta—amyloid(1,42)peptMeoncortica]pro— Jectionsoftherat~uc]eusbasa]ismagnoce]lularis. 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