C型肉毒梭菌的鉴定及其神经毒素基因全序列测定

C型肉毒梭菌的鉴定及其神经毒素基因全序列测定 【基础研究】 C 型肉毒梭菌的鉴定及其神经毒素基因全序列测定 高建军张超毛晓燕曹馨匀 【 摘要 】 目的 对 3 株 C 型肉毒梭菌进行鉴定，并选择其中 1 株进行基因全序列测定。方法 对 3 株 C 型肉毒梭菌(C6514、C314,91 和 C)进行生化鉴定、检出试验、确证试验、毒力测定、毒素定型试验，并C6514对 株 进行神经毒素基因全序 AXA 列测序。结果 3 株菌均能发酵葡萄糖，不能发酵乳糖，不能发酵牛奶和形成吲哚;3 株菌均为产毒株;C6514 株毒力较高2， ×为 4 10LD,m l;加 C 型或混合型肉毒诊断血清或加明胶磷酸盐缓冲液(GPB)煮沸均可中和或灭C活 型肉毒梭菌产生的毒素; 50 BoNT ,C 测得的序列拼接后 与 GenBank中序列号 为 D90210的基 因核苷酸和氨基酸序列同源性均为 99,。结论 株肉毒3 梭菌均为典型的 C 型肉毒梭菌。 【关键词】 肉毒梭菌 C 型;生物学鉴定;神经毒素类;序列分析 【中国图分类号】R37 8. 8 ,3 Q78【 文献标识码】 A 【文章编号】 1004-550(32011)12-142505- Identification of Clostridium botulinum Type C and Whole Gene Sequencingof Its Neurotoxin GAO Jian-jun，ZHANG Chao，MAO Xiao-yan，CAO Xin-yun(Lanzhou Institutel Product of Biologica，sLanzhou 730046，China) 【Abstract】 Objective To identify threes trains of Clostridium botulinum typeC and sequence the lewho gene ofne urotoxin of ones train, Methods C6514，C314,91 and C strains of C, botulinum typeC were subjectedb iotcoh emical assay，identity test， AXA confirmation test，virulence test andto xin typing test，of which C6514strain was sequencedwho forle gene, Results The hrtee strains werepo sitive in glucose fermentation，but negative in milk fermentation，indole formation andl actose fermentation tests，all of 4 which were toxigenic, The virulence stofra in C6514 was2 × 10LD,m l，wh ich was higher than those of thetwo o, th Theer otxin 50 producedby C,bo tulinum typeC could be unteralized by typeC or mixed typed iagnostic serum forC ,bo tulinum，or inactivated by boiling with geltin-phosphate bufefr (GPB), Both the hoolmogies of nucleotides and amino acids of BoNT ,C se quence aftseprli cing were 99, to that of gene in GenBank(D9021)0, Conclusion All the threest rains weret ypical C,bo tulinum type C, 【Key words】 Clostridium botulinum type C;Biological identification;Neurotoxins;Sequenicng 肉毒毒素是由厌氧的肉毒梭菌在生长繁殖过程素的研究建立技术平台。 中产生的一种细菌外毒素，其能引起死亡率极高的 肉毒中毒。肉毒梭菌及其毒素根据毒素抗原性的不 1. 材料与方法 同，可分为 A、B、C、D、E、F和 G 7 个型，其中 A、B、 1. 1 菌株及质粒E、F 型为人中毒型别，C、D型为动物和家禽中 毒型 C 型肉毒梭菌 C6514、C314,91 和 C 均由本 ,1,AXA 别。C 型肉毒梭菌在自然界分布广泛，饮、食污染 所第五研究室提供;E. coli DH5α 为本所第四研究 有 C 型肉毒梭菌特别是 C 型肉毒毒素的水源或草 室提供;pMD18-simpleT 载体购自大连 TaKaKa公 料的动物有可能发生C 型肉毒中毒，可致中毒的动物 ,2-3 ,有:猫、羊、狗、牛、狐、貂等，均现为不同程度 司。 的肢体麻痹，行走困难，甚至瘫痪，最后因呼吸困难 1. 2 主要试剂 而致死;可致中毒的禽类有鸭、鸡、鹅等，典型症状是 庖肉液体(CM)培养基、卵黄平板、糖发酵培养 软颈，头颈伸直下垂，眼紧闭，翅膀下垂拖地，“”基、Ehrlich 试剂、孔雀绿染色液、复红染色液和明胶 重病 禽羽毛松乱容易拨落。相应的预防方法是以 C 磷酸盐缓冲液(GPB)均由本所第五研究室根据配方 型或 D 型肉毒类毒素进行免疫，可预防3 年左右。 自行配制;多价肉毒诊断血清由本所毒素制剂室提 本实验 对 C 型肉毒梭菌进行微生物学、血清学、生 供;Pyrobest DNA polymerase、限制性内切Ba酶mH ?、 化鉴定及 其神经毒素基因全序列测定，为C 型肉毒 梭菌及其毒 Xho?、λ-Hind? digestD NA marker 和D NA marker DL2000购自大 连 TaKaRa 公司;PCR purifiction kits和 QIAquick Gel ExtractionK i(t 250)为 QIAGEN公司 产 作者单位:兰州生物制品研究所免疫室(兰州 73004)6, 通讯作者:高建军，E-mail:gao5369,16,3cmo 品;TEMED 和高相对分子质量蛋白质m arke(r 14 200: 66 20)0为 Sigma公司产品 。氨酸，生成吲哚，吲哚可与试剂中二甲氨基苯甲醛作1. 3 实验动物 用，生成玫瑰吲哚，为红色物质。 1. 8 检出试验 SPF级昆明小鼠 ，雌雄不限，4: 5 周龄，体重 14 : 16 g，由本所实验动物室提供，生产许可证号:甘 分别取 3 株菌的培养液 3 :5 ml，离心后除菌 SCXK2007-001。 过滤，将滤液注射入小鼠腹腔内，每组 4 只，每只 1. 4 菌种复苏 0. 5 ml，观察小鼠中毒症状及死亡情况。若培养液中 从菌种库中取出 3 株 C 型肉毒梭菌、在生物安 有肉毒毒素存在，则小鼠在 96 h 内发病死亡。另设 全柜中按常规菌种复苏步骤接种于 CM培养基 ， 1 组对照，注射 GPB，每只 0. 5 ml。 35?厌氧培养 2 d。 1. 9 确证试验1. 5 菌株的分离培养 将检出试验中致小鼠发病的各株上清液离心，经 2 :3 次传代后，用接种环蘸取少许菌液在卵 除菌过滤，滤液分成 份3 :第 1 份加等量多价肉毒诊黄平板上划线，采用焦性没食子酸和无水碳酸钠除 断血清，混匀，37?作用 45 min;第 2 份加等量 GPB，氧法，倒置平板用石蜡密封，置35 ?厌氧培养2 d。 混匀，沸水浴 10 min;第 3 份加等量 GPB，混匀，不观察菌落特征，在生物安全柜内挑取典型单颗菌落， 做任何处理。3 份混合液分别注射小鼠4 只，每只 接种于 CM 培养基(中管)，35?厌氧培养、传代。 0. 5 ml。24 h 后观察结果，若加诊断血清与沸水浴灭 1. 6 形态学鉴定 活组小鼠均存活，而未经处理组小鼠均死亡，则可判 1. 6. 1 菌体形态观察:取菌体生长旺盛的菌液，按 定样品中有肉毒毒素存在。 常规革兰染色步骤染色后，在油镜下观察。 1. 10 毒力测定 1. 6. 2 芽孢染色观察:采用改良法，取少许菌液，与 取已确证有肉毒毒素的 3 株菌离心液上清，除 0. 5 ml 5,孔雀绿染色液在中管内混匀，沸水浴作用2 2 3 菌过滤，滤液用 GPB稀释 成 10×、5 × 10×、10×、15 :20 min，涂片、固定、脱色、复染(用沙黄溶液或 4 4 10×、5 × 10×，各稀释倍数分别注射小鼠 4 只，每复红)镜检。 只 0. 5 ml，另设 1 组对照，注射 GPB。根据小鼠死亡 1. 7 生化鉴定 情况，判定各株菌产生肉毒毒素的毒力(LD,ml )。 50 1. 7. 1 糖发酵试验:取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖4 1. 11 毒素定型试验种糖发酵培养基，将待检菌的新鲜培养物接种至糖 取多价肉毒诊断血清，包括 A、B、C、D、E、F型 发酵培养基中，35?厌氧培养3 d，肉眼观察管内颜 及混合型肉毒诊断血清各 1 支，按说明书操作步骤 色变化及产气情况。细菌若分解培养基中的糖类，将 及试验范例设计定型试验，每组各注射小鼠 4只 ，每 使培养基中指示剂显酸性反应，培养基颜色发生变 只 0. 5 ml，96 h 内观察结果。根据小鼠死亡情况判 化，若产气，可使液体培养基蜡层顶起;培养基无变 定肉毒毒素型别。 化则表示细菌不分解其中的糖类。 1. 12 神经毒素基因全序列测定1. 7. 2 牛奶发酵试验:将脱脂奶粉溶解于蒸馏水中， 1. 12. 1 基因组 DNA 的提取:按文献,4,方法提取配成 10,: 1 5,的奶液，分装于中管内，每管5 ml， C 型肉毒梭菌 C6514株基因组 DNA。高压灭菌。每管接种细菌培养物 0. 5 ml，置于用无 1. 12. 2 引物设计及合成:参考文献,5,，根据G en) 水碳酸钠和焦性没食子酸形成厌氧环境的大管内， Bank 中登录的 C 型肉毒梭菌神经毒素基因序列 35?培养、观察，管中内容物变清者为阳性。 (D90210)，分别用 prime5. r0 软件设计 BoNT ,C -H 1. 7. 3 明胶液化试验:用接种针取待检各株菌液， (重链)和 BoNT, C -L(轻链及二硫键 等)两对引物，穿刺接种于明胶培养基内，将其放入以无水碳酸钠 序列如下:BoNT , C-H:Sbm1:5′ -和焦性没食子酸形成厌氧环境的大管内，35?培养 CGGGATCCGAT- 48 :72 h 后，置冷水中冷却 10: 20 min，观察结果。 GGATGATCATTATATAATAAAAC′-(3斜 体 部 分 细菌若产生明胶酶，可使明胶分解，失去凝固力，使 为 BamH ? 酶 切 位 点)，Aph1:5′ -其由半固体转化为液体状态。 CTTCTCGAGTTATT-CACTTACAGGTACAAAACC -3′ 酶切位点)，扩增片段大小2 542 bp;BoNT,C - L:Sc l: 1. 7. 4 吲哚形成试验:取2 ml 24 h 细菌培养物，与(斜体部分为 Xho ? 5′ -AGTTAGGAGATGTTAGTATTATGCC-，3A′cl: 1 ml 二甲苯振荡摇匀，静置2 min，沿管壁缓慢加入 5′ -0. 5 ml Ehrlich 试剂，静置 15 min，观察结果。有红色 TATATAATGATCTACCATCTATTGC-3，′扩增片段环出现者为吲哚试验阳性:细菌分解蛋白胨中的色 大 小 1 363 b。p引物由宝生物工程(大连)有限公 司合 成。 萄糖，但不能发酵乳糖，不能发酵牛奶和形成吲哚，1. 12. 3 BoNT, C -H 与 BoNT ,C -L 序列 的 PCR扩 其他鉴定项目因菌株不同而异，见表1 。增:以提取的基因组 DNA 为模板，用. 121. 2 项合 成的引物，以 Pyrobest DNA polymer进ase行 PCR 扩 增 。 BoNT ,C -H 反 应 体 系 为 :dHO 31. 5 μl，Py,2 robest DNA polymerase buffμle，rdNTP 5 5 μl，Tem, plate 3μ l，Sbm1 2. 5 μl，Aph1 2. 5 μl，Pyrobest DNA polymerase . 50 。反应条件为:94?预变性 5 min;μl 94? 40 s，51? 40 s，72mi?n， 共4 30 个循环;最后 72?再延伸 10 min。BoNT,C -L 反应体系为 :dHO2 31. 5 μl，Pyrobest DNA polymerase buffμelr， dNTP5 5 μl，Template 3 μl，Scl 2. 5 μl，Acl 2. 5 μl， Pyrobest 图 1 C6514 株革兰染色镜检结果(× 400) DNA polymerase. 5 0。反应条件为:94?预变性μl Fig 1. Gram staining of C6514strai n(× 400) 5 min;94? 40 s，48? 40 s，m7i2n?，共 230 个循环; 最后 72?再延伸 10 min。扩增产物经 1,琼脂糖凝 胶电泳鉴定。 1. 12. 4 目的基因的克隆及测序:用QIAqui ck Gel ExtractionK i(t 25)0对 PCR 扩增产物进行胶回收，将 回收产物与 pMD18-simpleT 载体以 3 ? 1的比 例 16?连接过夜，转化感受态E . coli DH5α，涂布含 Amp(50 μg ,ml )的 LB 琼脂平板 ，37?过夜培养，挑 选重组子，接种单菌落于 m4 l LB 培养基(含 Amp 50 μg ,m)l 中 ，37?振摇培养，碱裂解法提取质粒(pMD- 18TL1、pMD-18TL、2pMD-18TH、1pMD-18TH2)，进行 PCR 鉴定，并设阳性对照(以C6514 肉毒梭菌基因 组 DNA 为模板)和阴性对照(不加模板)。提取的质 图 2 卵黄平板上 C6514 株的菌落形态 粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测Fig 2. Morphology of coloniesof C6514 strain on yolk 定的序列拼接后与 D90210核苷酸序列进行比对 。 plate 表 1 C 型肉毒梭菌的生化鉴定 Tab 1. Biochemical assay on C. botulinum type C 2. 结果 糖发酵试验牛奶发明胶液吲哚形 2. 1 菌株的培养特性 菌株酵试验 化试验 成试验 葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖 35?厌氧培养 1 d 后，3株肉毒梭菌均能很好地 在 CM 培养基中生长、产酸、产气，使培养液混浊，密 C6514，，，,,,, 封蜡层顶起，有恶臭味。 C314 ,91 ， ,,,,，, 2. 2 菌株的形态学鉴定 C， ， , , , ， , AXA 3 株肉毒梭菌革兰染色均呈阳性，油镜下观察 为梭状或杆状。经革兰染色或改良法芽孢染色均可 2. 4 检出试验 在油镜下看见芽孢，为网球拍状，位于菌体一端，不 注射了 C 型肉毒梭菌毒素滤液的小鼠均出现中 同培养时间芽孢的形状(大小)略有不同，见图1( 以 C6514株为 例)。 毒症状:竖毛、四肢瘫软、无力、呼吸困难呈风箱式， 卵黄平板上分离培养，3 株菌均可呈菌落状生 腰部凹陷，宛若“蜂腰”，所有小鼠在注射毒素 2 长。由于肉毒梭菌能产生脂肪酶，分解卵黄中的脂肪h 后 酸产生甘油，致使菌落表面呈现一种类似珍珠层的 死亡。表明这 3 株菌均为产毒株。 光泽(在阳光下观察)，见图2( 以 C6514株为 例)。 2. 5 确证试验 2. 3 菌株的生化鉴定试验结果显示，3 株菌均可引起小鼠明显的肉 生化鉴定结果显示，C 型肉毒梭菌均能发酵葡 毒中毒症状，并致小鼠死亡;加等量肉毒诊断血清可 中和毒素，起保护作用;通过煮沸可灭活菌株产生毒 素的毒性，为肉毒毒素特性。见表2 。表明 3 株菌均 为产毒株。 bp122. 6 菌株的毒力 4 LD,m l，其他 C6514株毒力 较高，为 2 × 1050 23 130两株毒力略低，见表3 。 9 4162. 7 毒素定型试验 6 557 4 316 定型试验结果显示，加等量 型或混合型肉毒C 诊断血清或加等量 GPB 混匀煮沸均可中和或灭活 2 322 2 027C 型肉毒梭菌产生的毒素，见表4 。 2. 8 神经毒素基因扩增产物的鉴定 BoNT ,C -L和 BoNT ,C -H 序 列的 PCR扩增 产 物经 1,琼脂糖凝胶电泳鉴定，分别可见约1 300和 1:λ-Hind ? digest DNA marker;2:BoNT ,C -H PCR 2 500 bp的特异条带 ，大小均与预期相符，见图 和3 产物 图 4 BoNT ,C -H PCR 扩增产物电泳图 图 4。 Fig 4. Electrophoreticprofil e of PCR products of BoNT , C-H 表 2 毒素的确证试验(死亡数, 总 数) Tab 2. Confirmation test of toxin(death,total mice) 菌株加肉毒诊断血清加 GPB煮沸 加 GPB bp1M2345 C65140 ,4 ,4 ,4 0 4 2 000C314, 91 0 ,4 0 ,4 4 ,4 C0 ,4 0 ,4 4 ,4 AXA 1 000 750500 表 3 菌株的毒素毒力(死亡数, 总 数) 250Tab 3. Virulence of C6514，C314, 91 and CAXA strains 100 (death, total mice) 稀释度 菌株2 2 3 4 4 10×5 ×1 0×10×10×5 ×10 × 对照 C6514,4 ,4 ,4 ,4 ,4 ,4 4 4 4 4 0 0 1:阴性对照;M:DNA marker DL2000;2，3:阳性对照;C314, 91 4 ,4 4 ,4 1 ,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4 4:pMD-18TL1的 PCR 产物;5:pMD-18TL2 的 PCR 产物 图 5 质粒 pMD-18TL1 和 pMD-18TL2PCR 扩增产物 C4 , 4 2 , 4 0 , 4 0 , 4 0 , 4 0 , 4 AXA 电泳图 bp123Fig 5. Electrophoreticprofil e of PCR products of plas) mids pMD-18TL1 andpMD -18TL2 2 000 1 000 750 bp500M51234 23 130 250 100 9 416 6 5574 316 2 3222 027 1:DNA marker DL2000;2，3:BoNT,C -L PCR 产物 图 3 BoNT ,C -L PCR 扩增产物电泳图 Fig 3. Electrophoreticprofil e of PCR products of BoNT , C-L 1:pMD-18TH1的 PCR 产物;2:pMD-18TH2的 PCR 产2. 9 神经毒素基因重组克隆质粒的鉴定 物;3，4:阳性对照;M:λ-Hind?digest DNA marker;5:阴性 经 1,琼脂糖凝胶电泳分析，质粒 pMD-18TL1 和 对照 pMD-18TL2 的 PCR 产物可见约 1 300 bp的目的 基 图 6 pMD-18TH1 和 pMD-18TH2 PCR 扩增产物电泳图 Fig 6. Electrophoreticprofil e of PCR products of plas) 因条带，质粒 pMD-18TH1 和 pMD-18TH2 的 PCR 产 mids pMD-18TH1 andpMD -18TH2 物可见约 2 500 bp的目的基因条带 ，见图5 和图 6。 2. 10 BoNT ,C 的测序结果 1353位 的核苷酸变异(分别为A ?G，G?A)为无义 BoNT ,C 测得的序列拼接 后与 D90210核苷 酸 突变，见图 7。上述 C 型肉毒神经毒素基因序列的 2 和氨基酸序列同源性均达 99,。神经毒素全序列共 个有义突变导致 442 位和 559位的氨基酸分 别由 有 4 个核苷酸变异，其中1325 和 1675位的核苷 酸 V(缬氨酸)?D(天冬氨酸)，(I异亮氨酸)?V(缬氨 酸)，见图 8。 变异(分别为 T ?A，A ?G)为有义突变，1155和 表 4 毒素定型试验(死亡数, 总 数) Tab 4. Typing test of toxin(death , total mice) 加 A 型加 B 型加 C 型加 D 型加 E 型加 F 型加混合型 菌株 加 GPB煮沸 加 GPB 诊断血清诊断血清诊断血清诊断血清诊断血清诊断血清诊断血清 C6514,4 ,4 ,4 ,4 ,4 ,4 ,4 ,4 ,4 4 4 0 4 4 4 0 0 4 C314, 91 4 ,4 4 ,4 0 ,4 4 ,4 4 ,4 4 ,4 0 ,4 0 ,4 4 ,4 C4 , 4 4 , 4 0 , 4 3 , 4 4 , 4 4 , 4 0 , 4 0 , 4 4 , 4 AXA BoNT ,C D90210 BoNT ,C D90210 图 7 BoNT ,C 与 D90210核苷酸序列比对差异位点 Fig 7. Comparison of nucleosidesequences BoNTof ,C and D90210 BoNT ,C D90210 BoNT ,C D90210 图 8 BoNT ,C 与 D90210氨基酸序列比对差异位点 Fig 8. Comparison of amino acidsequences BoNTof ,C and D90210 3. 讨论 Bank中序列号 为 D90210的基因核苷酸和氨基酸序 列同源性均为 99,，说明 C6514株确为能产 生 C 型 肉毒梭菌菌种的鉴定是建立肉毒抗毒素生产用 肉毒神经毒素的菌株。 菌种库的关键步骤之一。本实验根据 3 株肉毒梭菌 的培养特性、形态学鉴定、生化鉴定、检出试验、确证 参考文献试验、毒素定型试验结果，确证 株肉毒梭菌均为典3 ,1, 赵铠，章以浩，李河民, 医学生物制品学,M,, 2 版, 北京:人民 型的 C 型肉毒梭菌。肉毒神经毒素是由二硫键连结 卫生出版社，2007:702-716 , ,2, Woo GH，Kim H，YBae YC，et al, Outbreak oft ulibosm(Clostrid)的轻链(L)和重链(H)组成，轻链作为毒素的活性部 ium botulinum type) Cin wild waterfow:lSeou，lKorea, J,, J 分，实质为锌肽链内切酶;重链具有胆碱能特异性， Wildlife Dis，2010，46(3):951 -955, ,3, Lindstro mM，Nevas M，Kurki J，et al, TypeC botulinum dueo t能促进轻链的运转，使其发挥毒性作用。受体结合区 toxic feed affecting 52000 farmed foxes and inminks Finla nd,J,,J 位于重链的羧基端，也叫Hc 端。本实验对C6514 株 Clin Microbiol，2004，42(10):4718-4725 , ,4, Kouguchi ，HWatanabe ，TSagane ，Yet al, Characterization and 的肉毒神经毒素基因全序列进行了测定，目的如下: reconstitution of functional hemagglutinin of the Clostridiumbo ) ?对 C 型肉毒梭菌采用分子生物学方法进行鉴定;tulinum typeC progenitor toxin,J ,, Eur J Biochem，2001，268 ?通过对 C6514株肉毒神经毒素基因全序列 的测 (14):4019-4026 , 定，为肉毒抗毒素生产用菌种库的建立和鉴定创建 ,5, Heffron ，APoxtonI R, A PCR approach to determinedist rithebu) tion of toxin genesin cl osely related Clostridiumspeci es:Clostridi) 一个技术平台，保证肉毒抗毒素生产用菌种的特异 um botulinum type C and D neurotoxins and， C2 tand oClostrixindi) 性和均一性;?PCR 扩增获得 C 型肉毒毒素的重链， um novyi alphaoxi tn,J,, J MedMi crobio，2007，56(Pt2):196- l为下一步制备 C 型肉毒毒素基因工程疫苗奠定基 201 , 础。神经毒素基因序列测定结果经Bi oEdit软件分 析 表明，C6514株肉毒神经毒 素基因全序列与G en) (收稿日期:2011-079-)2