黄精多糖对神经细胞的毒性及抗缺氧性坏死和凋亡作用研究

黄精多糖对神经细胞的毒性及抗缺氧性坏死和凋亡作用研究 黄精多糖对神经细胞的毒性及抗缺氧性坏 死和凋亡作用研究 中药药理与临床2006;22(2)29 Tab2EffectsofABP-SL-CMonthesurvivalrateofBel-7402cellsfi 虹.n=4) ?P<0.05.??P<0.0IV8control 2.3诱导Bel-7402细胞凋亡当ABP浓度为0.25g/ml,0. 5Og/ml,1.00g/IIll与小鼠脾淋巴细胞共培养48小时,可见三 个剂量的ABP凋亡发生数明显高于无多糖刺激的脾细胞培养 上清组,说明ABP能通过增强小鼠细胞免疫功能诱导Bel-7402 细胞凋亡,见3. Tab3EffectofABPonBel-7402cellapoptosis(虹,n=4) ?P<0.05.??P<0.01V8control 2.4姬松茸体内对小鼠H22腹水型肝癌生长的抑制作用 ABP高,中,低剂量组瘤重与对照组相比均有显着性差异,且肿 瘤生长抑制率均>30%,其中低剂量组的抑制率高达45.83% 而与阳对药猪苓多糖相当.且三个剂量ABP组小鼠的一般状 态良好:小鼠活动自如,皮毛光滑,食量较正常,体重有明显增 加,瘤体大体外观苍白,与周围组织无粘连,无水肿现象,易于剥 离,说明ABP对H22小鼠在体肿瘤生长有一定的抑制作用,但 未见剂量依赖关系. Tab4ABP对I-I22小鼠腹水型肝癌的抑制作用(面虹.n=12) ??P<0.01V8模型组 3讨论 姬松茸多糖对不同的瘤株其作用有差异?,但对于肝癌细 胞Bel-7402作用无报道.本实验研究表明该多糖在体外对肝 癌Bel-7402细胞无直接细胞毒作用,不能直接抑制细胞Be1. 7402的增殖.诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的主要目标和策 略,不同的肿瘤细胞有不同的凋亡阈(apoptosisthreshold),如何 调控凋亡相关基因及其产物,提高肿瘤细胞对药物的敏感性, 并最终诱导肿瘤细胞的凋亡是抗癌药物取得疗效的关键.本 研究发现ABP能通过增强小鼠脾细胞免疫功能诱导肿瘤细胞 Bel-7402凋亡.ABP还能抑制H22小鼠在体肿瘤的生长,但无 剂量依赖关系,抑瘤率可达45.83%,作用与猪苓多糖相当,且 动物在用药期间一般状态很好,体重增加明显.至于姬松茸多 糖对其他瘤株是否有抑制作用以及对免疫功能的影响等还有 待于进一步的研究. 参考文献 1王丽华,李元瑞,陈懿,等.姬松茸多糖脱蛋白方法的研究.食品科技 2003;(1):18,19 2王晓沽,杨立红,蔡德华,等.姬松茸多糖抑制肿瘤细胞增殖的研究 生物学通报,2004;39(1):51,52 黄精多糖对神经细胞的毒性及抗缺氧性坏死和凋亡作用研究 肖移生,唐宁,吴东风,张进,聂荣庆,胡国柱 文珠, ('江西省医学科学研究所,南昌330006;江西医学院,南昌330006;江西省中医医药研究院,南昌330077;4 深圳市西丽人民医院,深圳518055) 捅要目的:探讨黄精多糖对体外培养的神经细胞的毒性反应及抗缺氧性坏死和凋亡的保护作用.方法:采用Neurobasal 加B27Supplement体外无血清培养,缺氧复氧培养,免疫细胞化学染色,Trypanblue拒染法,Hoechst33342荧光染色法以及Annexin V/PI双染流式细胞仪测定法观察对体外培养新生大鼠神经细胞的影响.结果:黄精多糖在6mg/ml以内对正常培养的神经细胞无 明显毒性作用,在500g/ml,1.5mg/ml范围内随着浓度增加抗缺氧复氧培养诱导的神经细胞坏死作用增大.黄精多糖在500 IIll,1.5mg/IIll范围内有抗缺氧复氧培养诱导的神经细胞凋亡作用,且随着浓度 增加而增大.流式细胞仪测定显示500IIll,1. 5mg/ml的黄精多糖有抗缺氧性神经细胞坏死作用,lmg/ml,1.5mg/ml范围内有抗 缺氧性神经细胞凋亡作用.结论:黄精多糖有抗 缺氧性神经细胞坏死和凋亡作用. 关键词黄精多糖;神经细胞;缺氧;凋亡;坏死 脑中风无论是缺血型还是出血型最终都将导致神经细胞 缺nt/缺氧.急性和慢性神经细胞缺血/缺氧导致的细胞死亡除 坏死外还有细胞凋亡[].以补气,益气药物人参,黄芪…, 黄精为主药的方剂在治疗脑中风中取得了较好的疗效,尤其 是在脑神经功能恢复方面作用明显.老龄大鼠口服黄精多糖显 着地提高组织中的超氧化物歧化酶(SOD)活性引,本文对黄精 多糖抗神经细胞缺氧性坏死和凋亡的作用进行了研究. 30中药药理与临床2006;22(2) l材料与方法 1.1试验药物黄精多糖,中国科学院成都生物研究所,多糖 含量95.28%. 1.2动物出生24h内的Wistar大鼠,清洁级. 1.3试剂与仪器Neurobasal培养基,B27Supplement(GIBCO— BRL.批号:1027887和1178099);马血清(Sigma,批号 092K84(M);D一多聚赖氨酸(Sigma,批号:68H5900);胰蛋白酶 (Sigma,批号4799).Hoechst33342(Sigma,批号B一2261);碘化 丙啶(PI)(Merck,批号537059);AnnexinV试剂盒(德国宝灵曼 公司产品);抗兔IsG二抗ABC试剂盒(华美生物,即用型);兔 抗大鼠烯醇化酶(NSE)多克隆抗体(SantaCruzBiotechnology, Inc);缺氧罐及氮气,二氧化碳空气混合器(CJ.MIX-3型,长沙 长锦应用技术研究所);24孔培养板(CostarCo);流式细胞仪 (CMibur型,BectonDickinson公司). 1.4方法新生大鼠大脑皮层神经细胞原代无血清培养及缺 氧复氧培养均按照文献j的方法进行.神经细胞烯醇化酶 (NSE)免疫细胞化学染色按常规方法操作,抗NSE一抗工作浓 度I:4OO.Trypanblue染色法及神经细胞Hoechst33342荧光 染色也均按照文献的方法进行.2.2.7AnnexinV/PI双染流 式细胞仪检测按照文献的方法进行,检测软件为CEUQuest, 数据使用MouFitLT软件分析及统计. 实验分4组:?正常对照组:神经细胞在37?,5%CO2饱 和湿度培养;?坏死阳性组或凋亡阳性组:神经细胞培养4天 后再缺氧复氧培养48h;?黄精多糖组1,组2,组3:在缺氧培 养前10h分别加入终浓度为0.5ms/ml,lmS/ml,1.5ms/ml的黄 精多糖,再缺氧复氧培养48h;?黄精多糖组4,组5,组6:在缺 氧培养12h后分别加入终浓度为0.5ms/ml,lmS/ml,1.5ms/ml 的黄精多糖,再进行复氧培养48h. 2结果 2.1黄精多糖对培养的新生大鼠大脑皮层神经细胞的毒性作 用神经细胞培养4d后加入黄精多糖继续培养48h,Trypan blue染色证明黄精多糖在1ms/?d一6rag/ml范围内与正常对照 组死细胞差异不显着,而7ms/ml,20ms/ml时可见明显细胞毒 性,见表1. 表l黄精多糖对神经细胞的毒性作用(.n=5) 与正常对照组比较?P<O.01 2.2黄精多糖抗神经细胞缺氧复氧性坏死作用神经细胞培 养4d后加入黄精多糖预处理10h,而后进行缺氧12h复氧培养 48h,经Trypanblue染色测定神经细胞的坏死率,结果黄精多糖 在500p.s/ml一1.5ms/m1时神经细胞坏死率随浓度的增加而下 降,此后坏死亡率上升,6ms/ml以上高于坏死诱导组. 表2黄精多糖抗神经细胞缺氧复氧性坏死和凋亡作用(iJ 与凋亡阳性组比较?P<0.05.??P<0.01 2.3缺氧前加入黄精多糖抗缺氧复氧性神经细胞凋亡神经 细胞培养4d后加入黄精多糖预处理10h,然后进行缺氧12h复 氧培养48h,经Hoeehst33342荧光染色测定神经细胞凋亡率见 表2.黄精多糖在500~s/ml一1.5ms/ml范围内抗缺氧复氧培 养诱导的神经细胞凋亡作用随浓度的增加而增大,2ms/ml一 8ms/ml时,其抗神经细胞缺氧性凋亡作用下降. 2.4缺氧后与缺氧前加入黄精多糖抗缺氧复氧性神经细胞凋 亡比较Hoechst33342荧光染色表明,缺氧前后同浓度组比较 差异显着.缺氧前加黄精多糖500~s/ml,1.5ms/ml,凋亡细胞 减少,而在缺氧后加黄精多糖,500~s/ml,1.5ms/ml各剂量组 的凋亡率无变化,见表3. 表3黄精多糖缺氧后与前加入干预缺氧复氧性神经细胞凋亡的 比较(虹) 分绡剂量丝堕塑圭兰 一(mg/m1)n缺氧前lOh加人多糖n缺氧12h后加人多糖 与凋亡诱导组比较??P<0.01;同一黄精多糖浓度组缺氧前后加 入黄精多糖之间比较??P<O.01 2.5黄精多糖抗缺氧复氧性神经细胞凋亡及坏死的流式细胞 仪检测神经细胞培养4d后加入黄精多糖预处理10h,然后缺 氧12h复氧培养48h,流式细胞仪测定结果见表4.黄精多糖在 500tLs/ml一1.5ms/ml范围内有抗缺氧复氧培养诱导的神经细 胞坏死作用,在1ms/ml一1.5ms/ml范围内有抗神经细胞凋亡 作用. 表4黄精多糖干预缺氧复氧性神经细胞早期凋亡及坏死的流式 细胞仪测定结果(.n=3) 与凋亡诱导组比较?P<O.05.??P<0.01 中药药理与临床2006;22(2)3l 3讨论 黄精多糖加入神经细胞培养48h,在1mr,/ml一6m#ml范围 内对正常培养的新生大鼠大脑皮层神经细胞无毒性反应,而在 7m#ml一20mg/ml时其对神经细胞的毒性作用随浓度的增加而 增大.辜红梅等人应用Mrrr法证明黄精多糖对正常培养的 Vero细胞72h的最大无毒浓度为16mg/ml,晏为力等人认为毒 性主要由杂质引起.本文使用的黄精多糖与辜红梅等人 相同,其对神经细胞的最大无毒浓度为6m#ml,可能是使用的 细胞种类不同. 神经细胞缺氧性死亡包括坏死和凋亡,黄精多糖缺氧前 lOh加入神经细胞培养中,经缺氧12h复氧48h培养后5oo~# rrIl一1.5mg/ml的黄精多糖随浓度的增加表现出十分显着地抗 缺氧性坏死作用,超过此浓度则毒性作用表现出来,且缺氧的 神经细胞比正常培养的神经细胞对黄精多糖毒性作用的耐受 力更低.500ml一1.5rag/ml的黄精多糖抗缺氧复氧性神经 细胞凋亡作用非常显着,而2mg/ml以上抗凋亡作用下降,黄精 多糖同等浓度下抗神经凋亡的能力比抗坏死的能力更强.然 而神经细胞缺氧12h后加入5oo~#ml一1.5mml的黄精多糖 其神经细胞凋亡率显着上升,与凋亡阳性组几乎无差异.黄精 与人参,黄芪同属于补气类中药,但其抗凋亡能力不如人参皂 甙Rbl,黄芪注射液,尤其是在缺氧后加入.缺氧后加入人参皂 甙Rbl5Og/ml,黄芪注射液50mg/ml神经细胞凋亡率均明显 降低川.AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测也证明5oo~g/ rrIl一1.5m#ml的黄精多糖使缺氧性神经细胞坏死率随浓度的 增加显着下降,1mg/ml一1,5m#ml则使凋亡率随浓度的增加显 着下降.而PI染色流式细胞仪测定也证明人参皂甙Rbl (10ml—loo~#m1)能显着地降低神经细胞凋亡率(8.52% 一 1.43%),而正常和凋亡阳性组则分别为0.78%和31. 61%[. 参考文献 lNimtofiT,SatoN,WaguriS,eta1.DelayedneuronaldeathintheCA1 pyranidalcelllayerofthegerbilhippocampusfollowingtransientisehemiais apoptosis.JNeurosei,1995;15(2):1001,101l 2彭斌,李舜伟,潭会兵.慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的研究. 北京医学,2002;24(5):339,341 3曲宏达,佟丽,沈剑刚,等.补阳还五汤对体外培养的大鼠皮层神经 元缺氧凋亡的影响.第一军医大学,2002;22(1):35,38 4秦泗明,秦绪丽,潘为法.梗塞通治疗缺血性中风3O例.陕西中医. 20o3;24(2):13l,132 5李世昌,范金风,李世平,等.黄精四草汤加减治疗缺血性脑血管疾 病疗效观察.中国中西医结合急救杂志.2001;8(6):376 6赵红霞,蒙义文,曾庆华,等.黄精多糖对老龄大鼠衰老生理生化指 标的影响.应用与环境生物.1996;2(4):356,360 7聂荣庆,李扣华,胡国柱,等.人参皂甙Rbl抗新生大鼠大脑皮层神经 细胞缺氧性凋亡.中国康复理论与实践,2004;10(12):723,725 8姜泊.细胞凋亡基础与临床.北京:人民军医出版社,19999月第一 版:261,288 9辜红梅,蒙义文,蒲蔷.黄精多糖的抗单纯疱疹病毒作用.应用与环境 生物,2003;9(1):21,23 lO晏为力,蒲蔷,蒙义文.两种黄精多糖衍生物的制备及其抗病毒活性 比较研究.天然产物研究与开发,2000;12(5):60,65 ll聂荣庆,李扣华,胡国柱,等.黄芪抗新生大鼠大脑皮层神经细胞缺 氧性凋亡研究.中国中医基础医学杂志,2004;10(11):34,37 银杏达莫的一般药理学研究 孙立伟,张胜,陈立江,毕云静 (辽宁省医药工业研究院,沈阳110015;辽宁大学制药工程系,沈阳110036) 摘要目的:研究银杏迭莫氯化钠溶液的一般药理作用.方法:银杏迭莫氯化钠溶液以5rag/kg,15mr,/kg及45mg/kg剂量 尾静脉注射给予小鼠,以1mg/kg,3m#kg及9m#kg剂量经股静脉注射给予Beagle 犬,观察对动物中枢神经系统,心血管系统及呼 吸系统的影响.结果:在试验剂量下对小鼠一般行为表现无明显影响;在低,中剂量时对小鼠的自发活动无明显影响,高剂量对小 ,鼠的自发活动有一定抑制作用;低,中剂量时对戊巴比妥钠睡眠作用无协同作用,高剂量对戊巴比妥钠睡眠作用具有协同作用.在 低剂量时对犬的心血管系统及呼吸系统的影响不大,中剂量及高剂量可使动物心率减慢,血压降低,呼吸频率增加.结论:较低剂 量时本品对动物上述系统无明显影响,较高剂量时则有一定程度的影响,这可能与本品中含有的银杏总黄酮具有扩张血管,增加血 流量,改善血循环的作用相关. 关键词银杏达莫;一般药理学;中枢神经系统;心血管系统;呼吸系统 1材料与方法 1.1试验药物银杏达莫氯化钠溶液,每1ml含银杏总黄酮 8.33mg和双嘧达莫3.33mg(试验计算时按11.66mg/ml标示, 每1.2ml相当于银杏达莫氯化钠注射液一袋,含银杏总黄酮 10mg和双嘧达莫4mg),由广东神州制药有限公司提供.用时 以0.9%氯化钠注射液配制成所需浓度并以0.45p,m滤膜过滤 沈阳北方制药厂产品. 后备用;O.9%氯化钠注射液, 1.2动物昆明种小鼠体重18—22g,雌雄各半,由沈阳医学 院实验动物中心提供;Beagle犬,体重8—12kg,雌雄兼用,由中 国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供.温度 2O?左右,相对湿度6o%左右.